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1、酒精发酵工艺,石 贵 阳江 南 大 学2010.04,一 前言,酒精发酵工业是一个大宗底物需求的工业,厨余垃圾、办公废纸等,二 酒精发酵基本过程,酒精发酵属于厌气性发酵，在发酵过程中进行无氧呼吸，醪液中的一部分可发酵性糖和氮等营养物质被酵母吸收合成菌体细胞，大部分糖则被发酵生成酒精和CO2 酒精发酵过程可以分为三个不同阶段,醪液中的酵母细胞数不多，酵母菌迅速进行繁殖；接种时温度控制在2628，整个前酵过程一般不超过30 ；酒精和CO2生成量很少，发酵醪的表面比较平静，醪液温度上升不快，糖分消耗慢；前发酵延续时间一般为10小时左右；前发酵期间应十分注意防止杂菌污染；,2.1 前发酵期,醪液中酵母
2、细胞数可达1亿/毫升以上，酵母菌基本上停止繁殖，主要进行酒精发酵醪液中糖分迅速下降，酒分逐渐增多，醪液中产生了大量的CO2发酵醪温度上升快，最好能控制在30-34主发酵时间一能般为12小时左右,2.2 主发酵期,2.3 后发酵期,发酵液中的可发酵性糖浓度持续降低最终维持在极低水平，发酵作用缓慢，酒精和CO2的生成量也相对较少发酵产生的热量减少，应通过保温方式控制醪液温度在30-32淀粉质原料生产酒精的后发酵阶段一般约需40小时左右,三 酒精发酵工艺,3.1 间歇式发酵工艺,一次加满法 分次添加法 连续添加法分割主发酵醪法,3.2 半连续发酵工艺（1）,一种是将一组数个发酵罐连接起来，使前三个罐
3、保持连续发酵状态，然后从3号罐依次分别流入其余发酵罐。即第四罐施加满后，改流至第五罐，第五罐满后改流至第六罐，依次类推。第四、五罐发酵结束后，送去蒸馏。洗刷罐体后再重复以上操作。,第二种是由78个罐组成一组罐，各罐用管道从上部通入下一罐底部相串连。投产时，先制备1/3体积的酒母，加入第一只发酵罐，随后在保持主发酵状态下，流加糖化醪；满罐后，流入第二罐，待第二罐醪液加至1/3容积时，糖化醪转流加至第二罐；第二罐加满后，流入第三罐，然后重复第二罐操作，直至末罐；最后从首罐至末罐逐个蒸馏。,3.2 半连续发酵工艺（2）,3.3 连续发酵工艺（1）,循环连续发酵法 多级连续发酵法,全封闭自流式连续发酵
4、工艺,1、2、3后熟器 4汽液分离器 5糖化锅 6热水器 7喷淋冷却器 8酒母罐 945m3发酵罐 1035m3发酵罐 1132m3发酵罐 1230m3发酵罐 13泡沫发酵罐 14CO2洗涤器 15泵,3.3 连续发酵工艺（2）,双流糖化和连续发酵,蒸煮醪按两种糖化方法进行。第一种方法在5860C条件下糖化5060分钟；第二种方法在真空条件下60C糖化56分钟。2/3的糖化酶加入第一种糖化器中，其余1/3加入第二糖化器内。经第一种糖化器糖化的醪液流入主发酵罐内，而从第二糖化器流出的糖化醪送入其它发酵罐内。 酵母接种量按主发酵容积的25加入，发酵至第8、9罐结束(每组由12个罐组成)，成熟发酵醪
5、酒精含量为8.428.76(v/v)，残糖0.220.26，其中可发酵性残糖仅0.1。,3.3 连续发酵工艺（3）,双流糖化和连续发酵 示意图,1、2糖化器 3、4冷却器 5、6第一、二主发酵罐 7、8发酵罐,3.3 连续发酵工艺（4）,连续发酵的优点,提高了设备利用率提高了淀粉利用率 节省酒母工段便于实现自动化,3.3 连续发酵工艺（5）,四 制备高性能高活力酒精酵母的研究,4.1 新型酒精酵母活力评价方法4.2 新型工业酒精酵母的构建,4.1 新型酒精酵母活力评价方法,在细胞培养的过程中，经常需要对细胞的活力进行观察检测，以了解培养物的生长状况。细胞活力的检测在发酵工业中主要用于种子的筛选
6、与其质量评估、培养过程中细胞生理状态的跟踪等。如何对酵母的活力进行准确、快速的评价，是近几年来国内外一直致力的研究课题。,为了控制发酵，啤酒厂一直沿用血球计数板计数的方式进行酵母细胞的计数，这种方法虽然简单，但人为因素多，误差大。此外，只计细胞数而不知其活力，无法反映出发酵过程中酵母细胞的真实生理状况而酵母细胞数、出芽率、死亡率、耗糖率等传统方法准确度较低，检测周期较长，无法实现实时监控。,酵母质量的检测方法虽多，但一般可以根据检测指标的不同，主要分为四类：细胞繁殖能力检测、细胞生理指标检测、细胞膜完整性检测与染色法。这些检测方法中，国内外研究最多的为胞内pH法、镁离子释放法与酸化力法,细胞活
7、力的检测分类,胞内pH法,胞内pH法是根据氢离子释放能力来衡量酵母活力的大小，具有较高氢离子释放能力的细胞，其活力较高。研究表明胞内pH不仅可以反映出酵母活力的大小，也与发酵性能有密切关系，内pH值高的酵母菌，活力高，发酵性能好。此法所用仪器及试剂都比较昂贵，因此不能作为化验室常规的检测内容。,镁离子释放实验,在发酵状态良好的情况下获得的酵母泥接种麦汁培养基后对这些离子的利用过程是先释放，再吸收，相反，在较差发酵状态获得的酵母泥接种后则缺少了离子的释放过程。使用通用的镁离子测试试剂包即可对酵母泥接种前后的麦汁中镁离子进行定量的比色分析，快速检测酵母活力。不足之处： 离心后每一批酵母泥含有的水分
8、不同，导致称取0.1g酵母泥时会有误差。实验中镁离子测定试剂会受到钙离子等无机离子的干扰。,酸化力法,酸化力测定是指在待测样品悬浮液中添加葡萄糖，测定添加前后胞外pH 的变化。胞外pH 值的降低是由酵母H+释放引起的，与CO2的排出、有机酸、K+/ H+ 转换及原生质膜中ATP 酶的作用有关。酸化力检测虽能准确预测发酵性能，然而这种方法不适用于那些使用酸洗或者酸调理的酵母细胞样品，如果要保证实验结果的准确，需要用去离子水将酵母细胞表面清洗干净。,亚甲基蓝还原实验,亚甲基蓝会被位于微生物细胞膜上的还原酶还原成一种无色的物质，该物质是无电荷的、亲脂的并且可以通过细胞膜进入细胞中，在细胞中再次被氧化
9、。在乳品加工业中，亚甲基蓝还原实验经常被用来检查牛奶中微生物的含量。2005年，亚甲基蓝还原实验被用在大肠杆菌培养过程中，可以准确反映培养过程中细胞数目的变化。, 是否可反映出酵母的活性； 酵母活力的表示方法； 测定条件； 灵敏性（应用范围）； 与酸化力法(AP法)相比，可否准确反映出酵母活力。,需要确定的问题：,T1/2值的定义,A1：亚甲基蓝初始吸光度A2：亚甲基蓝最终稳定时 的吸光度A1/2 ： A1与A2的吸光值的 平均值根据A1/2的值通过线性关系可计算出T1/2。,亚甲基蓝吸光度随时间变化的曲线,当新鲜酵母含量在40%以上，其活力和T1/2值具有完全的关联度，R2=0.9388；当
10、T1/2值大于250时，混合细胞中已含有60%的死细胞，表示酵母细胞的活力已经很低，完全不能用于酒精发酵。在进行酒精发酵过程中，完全可以利用亚甲基蓝还原实验来追踪发酵过程酵母质量的变化及判断发酵终点。,不同活力酵母的亚甲基蓝还原实验,检测条件, 亚甲基蓝浓度与酵母浓度的选择, pH的选择,随着亚甲基蓝浓度的增加，体系的吸光度值增大，仪器误差增大，为了使实验有较高的灵敏度，本实验选用亚甲基蓝的浓度为8 mg/L。酵母浓度太大时导致亚甲基蓝的初始吸光度改变，且导致褪色速率增加，使实验具有低的灵敏性，太低时导致活力与MB还原反应成非线性关系。本实验中酵母浓度为2.5%。,图1 pH对亚甲基蓝还原反应
11、的影响,MBRT的灵敏性实验,图2 不同活力酵母的亚甲基蓝还原反应,但在测量时AP值受到酵母洗涤次数，搅拌转速，温度等因素影响，与酸化力法相比，亚甲基蓝还原实验是一种简单，快速，准确测定酵母活力的一种方法。,培养过程中酵母活力的变化,从图中T1/2值与AP值可以看出酵母生长经过延滞期、对数期、稳定期与衰亡期。,木薯渣培养酵母试验中监测酵母活力,酵母培养过程中酵母活力的变化（木薯渣原料）,在培养过程中，从OD及残糖量数据并没有看出酵母活力低； 从T1/2值可以看出，在对数前期，酵母新陈代谢旺盛，酵母活力较高， 在对数后期，酵母活力下降较快； 在进一步的试验中，还发现在木薯渣中加入适量的氮源及合适
12、的离子可 培养出活力较高的酵母。,表 3 添加不同离子对酵母各指标的影响,注： 同列数据后具相同小写字母者表示在0.05水平上差异不显著。,无机离子对酵母生长的影响,蛋白胨对酵母生长的影响,酵母膏对酵母生长的影响,尿素对酵母生长的影响,硫酸铵对酵母生长的影响,亚甲蓝还原实验中T1/2值可准确表示出酵母活力的大小，T1/2值越小，则表示酵母活力越强。T1/2值为100s时表示酵母具有良好的生理状态；T1/2值在100250s时表明酵母代谢活动已有所下降，但仍可用于发酵；T1/2值在250s以上时表明酵母新陈代谢能力较低并可能导致发酵迟缓。,蛋白胨与酵母膏可促进酵母生长的最低浓度分别为48 g/L
13、、24 g/L;尿素最适浓度为2 g/L ; 硫酸铵最适浓度为5 g/L;K+ 15 mmol/L，Mg2+ 2 mmol/L，Na+ 2.5 mmol/L，Ca2+ 0.5 mmol/L。,结论 I,结论 II,酵母种子在淀粉原料中的生长情况,原料成分分析,木薯渣、木薯粉中含氮量较低，不能满足酵母生长的需要。木薯粉与石蒜粉中Na+、K+、Ca2+、Mg2+含量能够满足酵母生长的需要，所以不需要额外添加，木薯渣中Na+、Ca2+ 、Mg2+含量足够，但对酵母影响最大的K+含量较低，所以在利用木薯渣培养酵母时应额外加入K+。,图8 酵母生长过程中各指标变化,酵母在木薯粉糖化液中的生长情况,图11
14、 酵母生长过程中各指标变化,酵母在石蒜糖化液中的生长情况,酒精发酵对比试验,直接以这三种原料糖清液培养出的酵母活力均在200s左右，用其酒精发酵时间时，发酵时间约为72h左右；以尿素为氮源时，这三种原料培养出的酵母活力均在150s以下，酒精发酵时间约为65h。,高活力酵母的培养,进口有机氮源对酵母生长的影响,图12 有机氮源对酵母生长的影响,尿素与硫酸铵对酵母生长的影响,对照实验,图15 对照试验,图A表示的是酵母在较好状态下生长情况，作为对照组；图B表示的空白组及优化后时酵母种子生长过程中的各指标变化，其中空心为空白组酵母各指标变化，实心为优化后酵母各指标变化。,木薯渣：对数中期的酵母数在1
15、亿/mL以上，酵母活力T1/2值在150s左右， 比空白组酵母数增加2倍，T1/2值降低了40%；木薯粉：对数中期酵母数在1.5亿/mL以上，T1/2值在100s左右，T1/2值降 低了50%，可作为合格的种子进行酒精发酵；石蒜渣：与前两种原料相比，其培养酵母的效果最差。,以进口氮源培养酵母时可培养出4亿/mL左右的酵母，对数期酵母活力T1/2值100s左右；以2 g/L尿素与6 g/L硫酸铵作为氮源时，可培养出3亿/mL以上的酵母，对数期T1/2值在110s左右，这说明完全可以使用廉价氮源替代昂贵的进口氮源来进行大规模的酵母培养。,结论 III,结论 IV,4.2 新型工业酒精酵母的构建,酒
16、精酵母工业菌株遗传改良已经进入一个全新的分子时代,代表性成就：1、酿酒酵母全基因组解析2、2m质粒衍生基因表达体系 3、PCR技术为基础的基因删除技术4、五碳糖发酵途径工程,单基因,多基因,基因组,代谢组,表达组,代谢重组,途径工程反向途径工程,酒精酵母工业生产菌株遗传改良的基本策略,研究热点,纤维二糖酵母：-葡萄糖苷酶相关酶系表达：酸性蛋白酶、生淀粉酶 木糖发酵酵母：木糖还原酶(xylose reductase, XR)基因、木糖醇脱氢酶(xylitol dehydrogenase, XDH)基因,甘油是酒精生产中主要副产物之一，甘油的生成因菌株、原料与工艺的不同会消耗4 %10 %的总碳源
17、，如果这些碳源用来生成酒精，每年全球无需增加原料投入可多产酒精约13亿升，这将大幅度提高酒精生产的效率，产生可观的经济与社会效益。,减少甘油的生成,新型工业酒精酵母的方法,葡萄糖,6-磷酸葡萄糖,NAD+,NADH,3-磷酸甘油醛,乙醇,磷酸二羟丙酮,酵母在纤维二糖唯一碳源培养基上的生长情况,酵母在纤维二糖唯一碳源液体培养基中生长情况,重组酿酒酵母在纤维二糖和葡萄糖中的生长 比较,甘油途径改造对单倍体菌株的影响,甘油途径改造对菌株生理的影响,生长曲线,糖耗曲线,在糖浓度为2的发酵实验中，a型 (gpd2)、型(gpd2)单倍体菌株甘油得率分别为0.088和0.090(g Ethanol/ gl
18、ucose) g ，与原始工业菌株相比，分别降低7.84和5.82 。,单倍体酵母及重组单倍体酵母甘油产率,在糖浓度为2的发酵实验中，a型 (gpd2)、型(gpd2)单倍体菌株酒精得率分别为0.883和0.826(g Ethanol/ glucose) g ，与原始工业菌株相比，分别提高7.74和6.65 。,单倍体酵母及重组单倍体酵母酒精产率,酸性蛋白酶酶活测定,重组菌N21应用于酒精发酵的初步研究,酒精发酵培养基：料水比 1：2，不添加任何无机氮源。按1 g玉米粉添加100 U生淀粉酶，接种量10 %，发酵温度30。,蛋白质利用性能测试,与工业菌株相比，表达酸性蛋白酶的重组菌株的酒精度提
19、高12 %，淀粉料用率提高11.67%。,与工业菌株相比，重组菌株N21的发酵醪液中的游离氨基氮可维持在较高的水平。,蛋白质利用性能测试,工业菌株相比，重组菌株的发酵醪液粘度较低。,已获得具有醇溶蛋白和纤维二糖利用能力且甘油途径部分阻断的重组工业酒精酵母S. cerevisiae ANG-28(gpd2:BGL1,AP)，能在以纤维二糖为唯一碳源的培养基中生长，在不额外添加氮源的玉米粉中生长良好，酒精得率比出发菌株提高了4.5%。进一步的修饰和提高的研究工作正在开展。技术的成功实施，预计可有效缩短发酵时间、提高设备利用率，吨酒精生产成本降低10%以上。以300万吨淀粉质原料酒精产量进行估算，则
20、至少可节约生产成本10亿元人民币。,五 酒精发酵工艺技术的新发展,5.1 传统生产工艺的不足之处发酵醪酒精浓度低，蒸馏能耗大;酒精生产效率(强度)不高;发酵发酵周期长;糖化醪还原糖浓度偏高，易导致底物抑制作用，乙酸、杂醇油等副产物含量较高。,5.2 酒精生产新技术与新工艺 5.2.1 浓醪发酵技术,7-8%,发酵醪酒精度,浓醪发酵优点的体现： 发酵强度 杂菌的抑制 能源消耗 用水量,浓醪发酵的技术要求,菌种糖化工艺生产工艺 连续发酵 真空发酵,浓醪发酵技术的现状,玉米原料：发酵60小时，成熟发酵醪酒精度 可以稳定在13% (v/v)甚至15 % (v/v) 以上。木薯原料：国内厂家的发酵指标一
21、般在11- 13% (v/v)，部分厂家在14 % (v/v)。,浓醪酒精发酵工艺过程（多菌种）,木薯原料,美国玉米原料干法粉碎工艺生产酒精,根据资料显示，美国玉米原料干法粉碎后浓醪发酵的生产指标为98.21加仑/吨原料。,湿法粉碎后浓醪发酵的生产指标为94.64加仑/吨,浓醪发酵技术的发展趋势,适宜浓醪发酵的糖化工艺的优化与精确控制。配合浓醪发酵技术进行的工业酒精酵母的分子生物学改造以拓宽基质利用范围、减少副产物导致的原料损失，从而提高发酵强度、降低生产成本。生产实践表明，酒精发酵强度的提高远比单批发酵获得的高酒精浓度更为重要和经济。,5.2.2 生料发酵工艺,生料发酵的优点生料发酵工艺的发
22、展我国生料发酵工艺现状 在我国，生料发酵的研究始于20世纪80年代初，其由于不经蒸煮，在节能方法无疑是最为理想的，但是到目前为止，真正意义上的工业生产应用还没有。,5.2.3 高温发酵技术,耐高温酵母菌株的成功选育及发酵工艺条件的优化配置，使发酵温度由以往的3032C，提高到了34C以上，南方的酒精发酵装置在夏季高温季节，可以在3738C条件下运行，发酵过程冷却降温可以使用循环冷却水，而不需要投资大、能耗高的大功率制冷机组来保障 。,5.2.4 无载体固定化酒精发酵,无载体固定化酵母无载体固定化细菌 运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis),原料,完全糖化,过滤,糖液,蒸馏,絮凝性
23、酵母固定化酵母连续发酵,技术核心：糖质原料发酵工艺,酶,20-40 h,原料,液化,糖化,浓醪发酵,蒸馏,清液,带渣,“零”小时糖化，双边发酵,淀粉质酒精发酵的两种主要工艺技术比较,60 h,20 h,带渣原料全利用浓醪发酵技术成为淀粉质酒精发酵工业的主流技术,淀粉质酒精发酵的两种主要工艺技术比较,清液,糖化成本大幅提高初糖浓度高(15%)底物抑制导致酵母活力降低，酒精度提高困难,工业化应用成本高,VHG,实现高浓度酒精发酵,边糖化边发酵初糖浓度优化(7-9%)，底物抑制降低酵母代谢活力增强,淀粉质原料不同生产工艺比较,*注：括号内为本课题组研究数据,针对甜高粱秆的固体发酵,5.2.5 新型固
24、态发酵工艺,清华大学采用的新菌种和工业化发酵装置（自混式固态发酵罐、连续式旋转圆盘汽提塔）在内蒙巴彦淖尔市五原县进行中间试验 中国科学院过程工程研究所开发了气相双动态固态发酵反应，强化了固体颗粒内部传热传质、消除了固体培养基内温度梯度（温差）、提高了微生物发酵水平，成功实现了25、50、100m3的工业化规模放大。,小 结,酒精的发酵工艺不是孤立的过程，该过程的确定需要综合考虑原料预处理过程及糟液处理与综合利用，需要从绿色工艺和清洁生产角度整体把握。就淀粉质原料酒精工艺而言，新技术及新工艺大都是基于传统连续发酵工艺进行的改进和修饰。其涉及的关键是新型酶制剂的开发和利用、工业酒精酵母的改进及设备
25、的设计加工与控制。,研究最多的是玉米秸秆（corn stover）,六 纤维质原料酒精发酵工艺介绍,诺维信公司和杰能科公司：纤维素酶的使用成本降低了20倍（从$5.5降低到约$0.3/加仑酒精）。国内： 山东大学、南京林业大学、江南大学等单位已开展纤维素酶法生产酒精技术研究20多年； 已有多家纤维素酶制剂生产企业，如宁夏夏盛集团等已工业化生产纤维素酶。,6.1 木质纤维酒精生产发展现状,纤维素酒精产业化的另外几个主要瓶颈： 秸秆等木质纤维原料的预处理技术； 己糖-戊糖共发酵技术； 高活力-葡萄糖苷酶等小酶种的纤维素酶 生产技术； 木质素降解物等副产物综合利用技术等。,6.2 发酵工艺,从工艺实
26、现的技术角度看没有特殊的要求：具体工艺可以借鉴糖质原料发酵过程。目前的研究主要是在发酵菌种的选育方面，即针对纤维素原料水解液糖组成，筛选和/或分子生物学改造微生物达到宽基质（主要是戊糖、纤维二糖利用）发酵和高转化率的发酵性能。,典型木糖代谢途径工程,B,发 酵 时 间 （hours）,对照菌,工程菌,问题探讨稀酸水解与纤维素酶水解相结合新型酵母、双边发酵与原有乙醇车间结合乙醇、木糖醇、丁二醇、甲乙酮等多产品结合,理想的生产过程,纤维质酒精生产实例介绍,玉米芯生物炼制,（纤维饲料）,（燃料乙醇）,（废渣发电）,（玉米芯废渣）,（炭灰还田）,(低聚木糖),(木糖醇),(功能糖衍生产品),(玉米芯),山东禹城,木糖相关产品-酒精联产的万吨级纤维素酒精示范工厂。,6.3 发展趋势,木质纤维原料酒精发酵是一个系统工程，涉及了众多交叉学科，需要多学科背景的科学家协同攻关才有可能实现产业化。就当前情况而言，如果排除石油价格暴涨的因素，纤维质酒精暂时不可能在短期内实现真正的商业化，淀粉质、糖质原料酒精将在一定时期内继续保持主体地位。我国人口众多，粮食安全问题显得尤为重要。大力发展非粮生物质能源将是现阶段的主要任务，根据不同地区的特点，开发和推广种植能源植物如能源甘蔗、甜高粱、石蒜等并发展相关的酒精发酵工艺是当务之急。,Our aim,
