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1、亲子鉴定在水产动物遗传育种中的应用,高泽霞,华中农业大学水产学院,2003年美国进攻伊拉克，在战争中众多尸首中虽然已面目全非，但运用DNA技术，最终证实萨达姆的两个儿子乌代和库赛战死。,目 录,一、亲子鉴定的意义二、常规亲子鉴定的方法和原理三、水产动物亲子鉴定的方法及应用,一、亲子鉴定意义,民事纠纷中争论或不确定的若干问题；系谱追认、混合精液输精、不明确的偷配或乱配认证、双亲资料混乱等，错误的系谱信息会使遗传进展的获得速度降低；野外或人工饲养与繁殖的濒危动物, 对于其遗传资源的保护、制订科学的配种方案提供清晰的系谱信息有极大的理论和现实意义；为避免后代中可能存在的近亲交配和控制小群体内的近交交
2、配导致的群体生活力下降。,遗传标记,DNA水平 遗传标记,表达产物水平遗传标记,DNA序列多态性(如线粒体DNA) DNA长度多态性(如微卫星SSR),红细胞血型(如ABO) 白细胞血型(如HLA) 血小板型 酶型(如 PGM 1 ) 血清型(如 Hp) 其他(如 唾液蛋白）,二、常规亲子鉴定的方法和原理（主要针对人类和哺乳动物）,2.1 红细胞血型,此法常见于人类亲子鉴定人类的血型通常分为 A 、 B 、 O 和 AB 四种。血型的遗传借助于细胞中的染色体。ABO 血型系统的基因位点在第 9 对染色体上。人的 ABO 血型受控于 A 、 B 、 O 三个基因，但每个人体细胞内的第 9 对染色
3、体上只有两个 ABO 系统基因，即为 AO 、 AA 、 BO 、 BB 、 AB 、 OO 中的一对等位基因，其中 A 和 B 基因为显性基因， O 基因为隐性基因。,因此，用红细胞进行亲子鉴定，只能否定，不能肯定，也就是只能做亲权排除。,2.2 酶型,多态性同工酶是指在同工酶中，那些由遗传所致，在不同个体之间表现出酶蛋白一级结构差异，并可根据这种差异将人群分为若干类型的同工 酶。,区带电泳利用酶蛋白分子的电荷密度的差异，不同酶蛋白分子在介质中的迁移率不同，从而形成清晰的区带。,等电聚焦技术根据酶蛋白分子的等电点不同，在pH梯度介质中，酶蛋白分子聚焦在相应的等电点pH位置上，形成狭窄而清晰的
4、区带。凝胶介质上酶区带的显现和鉴定酶蛋白分子经电泳分离以后，利用酶特异性的催化活性，使之显色，表现出特征性谱带，可据此作出同工酶型的判断。,酶谱技术：电泳和组织化学染色两种方法的联 合应用。,常见的其他几种多态性同工酶：红细胞酸性磷酸酶（EAP）酯酶谷丙转氨酶乙二醛酶I6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶腺苷脱氨酶（ADA）,2.3 白细胞的抗原（HLA）型,HLA具有高度多态性HLA-类基因产物为HLA-A，-B，-C抗原，由两条糖蛋白链构成，即重链和轻链重链由HLA基因控制，具有多态性。轻链为2微球蛋白，不由HLA基因控制，无多态性。其中，3比较恒定，而2和1则有高度可变性。HLA-类抗原由和两条糖蛋白
5、链构成，并以共价键相连接 和链均有多态性,2.4 血清型,某些血清蛋白具有遗传多态性，表型有个体差异，称为血清型 （serum types）。血清蛋白的电泳多态性遗传标记：指不同个体血清蛋白的电泳特性的差异。是血清蛋白多肽链中部分肽链或个别氨基酸不同，引起电泳迁移率发生变 化构成的多态性。,分型原理免疫学的方法可以用来进行同种异型遗传标记的分型，以特异性的抗体检测同种异型抗原，确定遗传标记的型别。如红细胞被动凝集抑制试验、酶联免疫分析等。血清型多数属于电泳性质上的多态性，需要采用凝胶电泳技术分型。,2.5 染色体型,染色体多态性又称异态性（heteromorphism)，是指正常人群中常见的各
6、种染色体形态的微小变异（如：随体增大、重复或缺如，着比粒区的荧光强度变异等），这种多态是可以遗传的。这项技术就是利用其形态来鉴定亲子关系，这要靠技术人员的主观判断，其准确率也不尽如人意。,2.6 DNA 指纹分析,随着分子生物学的发展,自1985 年以来,DNA 指纹分析技术在亲子鉴定中被应用。将个体的染色体DNA用限制性内切酶消化，分离得到不同大小的DNA片段，再以重复序列中的共有序列作为核酸探针进行杂交，对所得到不同生物个体相似DNA片段的带型图谱(即DNA指纹图谱，对每一个体都是独特的)进行分析的方法。,2.6 微卫星 DNA（SSR）,一般由2 个6 个碱基构成一个核心序列,核心序列在
7、长度上呈串联重复排列,主要由核心序列拷贝数目的变化产生长度多态性。 具有高度多态、 共显性遗传SSR 分型具有很高的灵敏度和良好的重复性,分型结果稳定可靠。,SSR 技术较DNA指纹有更高的非父排除率和个人识别几率。SSR位点的总识别率为0.9999999999999935 ,累计非父排除为99. 999 %,在亲子鉴定中已达到很高的水平,因此被称为“第二代DNA 指纹”。SSR 位点在人类基因组中广泛分布, 具有丰富的多态位点资源, 而且扩增STR基因座仅需要少量模板DNA。联合使用多个SSR 位点,可满足各种需要。基于以上优点,近几年人类做亲子鉴定多使用SSR 技术。,人类亲子鉴定常使用的
8、SSR位点：TH01 、VW2FA31 、TPOX、CSFIPO、FIBRA、D3S1358、D7S820、D8S1179 和D5S818。,三、水产动物亲子鉴定的方法及应用,系谱信息（Pedigree information）在水产动物遗传选育中的重要性追踪子代的父母本鉴定个体间亲缘关系鉴定有效繁殖亲本清楚种群的系统演化关系防止种群/个体的近交尽可能保持物种的遗传多样性阐明精子竞争、繁殖成功、幼体扩散等许多有关繁殖生态学和遗传学方面的科学问题,水产动物传统选育方法,不同家系分开繁殖,饲养在不同tank中,待长到一定大小时进行物理标记,每个家系选择一部分子代放于pond或tank中混合饲养,一
9、定时期后收获，数据测量，不同家系子代性状比较,传统物理标记方法的缺点：需要个体长大一定大小时才能植入，之前各家系个体都必须分开单独饲养，从而消耗大量的物力和财力；家系前期的单独饲养时，不同缸之间会产生环境效应，影响对家系遗传性状的评估，从而减小选育的效率和准确性；耗时耗力，限制了标记个体的数目，从而影响选育强度。,寻找一种方法：可以将不同家系个体从早期阶段就开始混合饲养，消除不同环境条件造成的环境效应，同时又可有效防止后代的近亲交配。采用分子遗传标记做亲子鉴定，快速准确寻找不同家系后代的亲本。,微卫星标记具有的密度大、多态性丰富、高度杂合、稳定性好、遵循孟德尔分离定律、共显性遗传、易于PCR
10、扩增等特点使其成为了作为亲子鉴定的首选分子标记方法。微卫星亲子鉴定方法已经广泛的用于鱼类遗传选育项目中。,SSR分子标记的开发,SSR标记,PCR扫描法,菌落原位杂交法,富集文库法,EST文库筛查法,高通量测序法,Roche 454 焦磷酸测序,Illumina Solexa 合成测序,ABI SOLiD 连接法测序,GS Junior 基因序列分析仪,Illumina MiSeq,Ion Torrent,序列的拼接，标记的查找,近缘种之间标记的通用,基于微卫星标记亲子鉴定方法下的鱼类选育项目,不同家系繁殖后,混合饲养在pond或tank中，使子代在相同的环境条件下生长,养殖一定时期后，收获，
11、性状数据测量，取个体鳍条组织,获取个体的基因组DNA遗传信息,根据亲本的遗传信息，进行家系鉴定，比较各家系性状指标，建立个体遗传信息库,取繁殖亲本的鳍条组织，掌握亲本的基因组DNA信息,在防止亲近交配或以减少近亲交配为原则，选择下一批繁殖亲本，尽可能保持繁殖后代的遗传多样性,如何选择可作为亲子鉴定的微卫星位点,基于亲本的遗传信息，尽可能选择在亲本中多态性高的微卫星位点；选取一些位点后，用软件P-Loci做模拟分析，该软件可基于亲本的遗传信息，推测所有可能产生的后代的信息，并筛选出可以准确鉴定后代的微卫星位点组合。,下载网址：http:/marineresearch.oregonstate.ed
12、u/genetics/ploci.htm,获取了子代的遗传信息后，结合亲本和子代的信息，用软件Cervus 3.0 作真实的亲子鉴定，寻找每一个后代的父母本来源。,下载网址：http:/,基因型分析,巢式一步法PCR扩增,SSR标记（14个）,亲子鉴定步骤（以团头鲂为例）,亲本基因型分析,P-Loci软件模拟分析,筛选到9对（100）,子代基因型分析,Cervus 3.0软件分析,Genemap 4.0 software,ABI 3730,获得子代的亲本来源,影响微卫星亲子鉴定的因素,1. 无效等位基因(Null allele) 的存在Null allele指不被PCR 扩增的等位基因,常常是
13、由引物结合部位的点突变、插入或缺失引起，另外DNA模板质量不好或者量太少也可能导致PCR失败。微卫星是中性标记,遵循孟德尔遗传定律,即等位基因独立分离且自由组合。但如果在家系中有无效等位基因存在,则能够导致个体的基因型与经典的孟德尔遗传明显不一致，从而使得parentage assignment与实际不符。,影响微卫星亲子鉴定的因素,2. “结巴”带(Stutter bands)的存在在用变性聚丙酰胺凝胶检测微卫星位点的PCR 扩增产物时,有时1 个等位基因不是1 条带,而是由1 个主带和数条附加带组成,这些附加带称作“结巴”带或“阴影”带( Shadow bands) ，给数据读取带来一定误
14、差。,PAGE胶,Genetic Analyzer,“结巴”带大多出现在重复单位为2 碱基的微卫星位点,并且通常比主带(长度n) 短数个重复单位( n - 2 ,n - 4 , ) ,强度随着离主带距离的加大而减弱,出现几率则随重复次数的增多而增大。,PCR 反应过程中TaqDNA 聚合酶的复制滑脱是“结巴”带的主要成因,影响微卫星亲子鉴定的因素,3. 上游等位基因扩增丢失(Upper allele dropout)当等位基因的大小存在差异时,片段小的等位基因往往比片段大的等位基因扩增效率高，因此常导致较大的等位基因在杂合体中无法检测到。,多重PCR体系（multiplex PCR）,不同荧光
15、标记(FAM, HEX, NED, er al.)，PCR反应完后将产物混合后上机,同一种荧光标记，几个SSR位点同时在一个PCR反应里面扩增大大节省成本,微卫星亲子鉴定在水产动物上的应用,Bernatchez, L., Duchesne P., 2000. Individual-based genotype analysis in studies of parentage and population assignment: how many loci, how many alleles? Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences
16、57, 112.Jerry, D.R., Preston, N.P., Crocos, P. J., Keys, S., Meadows, J.R.S., Li, Y., 2006. Application of DNA parentage analyses for determining relative growth rates of Penaeus japonicus families reared in commercial ponds. Aquaculture 254, 171181.Kim, S.G., Morishima, K., Satoh, N., Fujioka, T.,
17、Setsuo, S., Arai, K., 2007. Parentage assignment in hatchery population of brown sole Pleuronectes herzensteini by microsatellite DNA markers. Fisheries Science 73, 10871093 .Wang, H.P., Li, L., Geoff, W., Bonnie, B., Hong,Y., Gao, Z., Laura, T., OBryant, Paul., Dean, R., Russ, M., 2009. Evaluation of relative growth performance and genotype by environment effects for cross-bred yellow perch families reared in communal ponds using DNA parentage analyses. Aquaculture Research 40, 13631373.越来越多的水产动物育种项目在采用SSR标记进行家系来源鉴定,
