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1、实验三 血清中和试验（固定病毒稀释血清法）,一、实验目的 了解中和试验的基本原理和几种不同的测定方法，掌握固定病毒稀释血清法的操作步骤和计算方法及含义。,二、原理 病毒感染敏感靶细胞后，引起细胞形态学变化，出现细胞病变效应（CPE）。特异性中和抗体与病毒结合后，可使病毒颗粒失去感染性，抑制细胞病变的出现。,三、血清中和试验的分类,1、终点法,2、蚀斑减数法3、交叉保护试验,固定病毒稀释血清法固定血清稀释病毒法,四、用途1、疾病诊断2、病毒分离株的鉴定3、不同病毒株的抗原关系研究4、疫苗免疫原性的评价5、免疫血清的质量评价6、测定实验动物血清中是否存在抗体,六、固定病毒稀释血清法的操作步骤,测定
2、病毒液的TCID50( 10-4.5/0.1ml )将测好TCID50的病毒液稀释成200个TCID50的病毒悬液。将血清作连续倍比稀释（具体方法是在8个EP管中各加入500lD-Hanks，第一管再加500l待检血清，混匀后，吸500l至下一管，如此下去。一直到1:256，共8个稀释度），再将8个EP管内各加等量(500l)病毒液，混匀。,同时设阳性血清对照，待检血清毒性对照，病毒对照和正常细胞对照，其中： 1 阳性血清对照：将阳性血清做8个2倍比稀释度，每孔各加50l病毒液和50l各稀释度血清。 2 待检血清毒性对照:将待检血清做8个2倍比稀释度，每孔各加50lD-Hanks和50l各稀释
3、度血清.3 病毒对照:做4个10倍比稀释度(200个TCID50、20个TCID50、2个TCID50、0.2个TCID50 ),每孔各加50lD-Hanks和50l各稀释度病毒液。 4 正常细胞对照：每孔各加100lD-Hanks.,将血清病毒混合液（包括阳性血清对照组）放入37 5%CO2培养箱中作用45min-60min.感作完成后每个稀释度分加至96孔细胞板中，每孔100l，继续置37 5%CO2培养箱培养1.5h，洗液（D-Hanks）洗一遍，换维持液，放温箱中培养，逐日观察并记录结果。 结果计算，按Reed-Muench两氏法或Karber法进行。,12,14,18,116,132
4、,164,1128,1256,血清,实验孔,阳性血清对照,细胞对照,病毒对照,待检血清毒性对照,血清稀 CPE 无CPE 累计 保护率%释度 孔数 孔数 CPE孔数 无CPE孔数 1:2（10-0.3） 0 8 0 30 100(30/30)1:4（10-0.6） 0 8 0 22 100(22/22) 1:8（10-0.9） 2 6 2 14 87.5(14/16)1:16（10-1.2） 2 6 4 8 66.7(8/12)1:32（10-1.5） 6 2 10 2 16.7(2/12)1:64（10-1.8） 8 0 18 0 0(0/18)1:128（10-2.1） 8 0 26 0 0(0/26),lgPD50=高于50%的保护率血清稀释度的对数+距离比例稀释度对数的差=-1.2+0.33(-0.3)=-1.299 距离比例=（高于50%的保护率-50% ）/ （高于50%的保护率低于50%的保护率） =（66.7-50）/（66.7-16.7） = 0.33,PD50=-1.299的反对数=0.05=1/20 即1:20稀释的待检血清可保护50%的组织培养细胞免于出现CPE,
