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1、第七章 层析分离技术（7）,本章内容,7.1 层析技术导论 7.2 凝胶过滤层析7.3 离子交换层析7.4 亲和层析7.5 固定金属离子亲和层析7.6 疏水作用层析7.7 反相层析,7.7 反相层析,一、基本原理二、反相介质的种类三、特点及用途四、影响因素五、高效液相色谱简介,7.7 反相层析一、基本原理,反相层析（Reversed-phase chromatography, RPC）利用非极性的反相介质为固定相，极性有机溶剂的水溶液为流动相，是根据溶质极性（疏水性）的差异进行分离纯化的层析技术。反相层析属于分配层析，溶质在固定相（非极性介质）和流动相之间的分配系数取决于溶质的疏水性：溶质的疏
2、水性越大，其在固定相中的分配系数越大。烃类化合物的分配系数与其分子所含碳原子数成正比。当固定相一定时，可通过调节流动相的组成来调整溶质的分配系数。流动相的极性越大，溶质的分配系数越大。因此，RPC多采用降低流动相极性（水含量）的线性梯度洗脱法。,7.7 反相层析二、反相介质的种类,反相介质的商品种类繁多，其中最具代表性的是以硅胶为载体，通过硅烷化反应在硅胶表面键和非极性分子层。硅烷化反应式如下：,其中，硅烷化试剂中R1和R2多为甲基，R为C4、C8、C18烷基或苯基，一般简称为C4、C8、C18柱等,另外，高分子聚合物也可作为反相介质，如：聚丙烯酸酯- C18,7.7 反相层析三、特点及用途,
3、一般用非极性固定相（如C18、C8）；流动相为水或缓冲液，常加入甲醇、乙腈、异丙醇、丙酮、四氢呋喃等与水互溶的有机溶剂以调节保留时间。为了得到更好的分离效果，有时加入一定浓度的三氟乙酸（TFA）适用于分离非极性和极性较弱的化合物。RPC主要用于相对分子质量低于5000，特别是1000以下的非极性小分子物质的分析和纯化，也可用于蛋白质等生物大分子的分析与纯化。由于反相介质表面为强烈疏水性，并且流动相为低极性的有机溶剂，生物大分子在RPC过程中容易变性失活。因此，以回收生物活性蛋白为目的时，应注意选择适宜的反相介质和流动相。随着柱填料的快速发展，反相色谱法的应用范围逐渐扩大，现已应用于某些无机样品
4、或易解离样品的分析。为控制样品在分析过程的解离，常用缓冲液控制流动相的pH值。但需要注意的是，C18和C8使用的pH值通常为2.57.5（28），太高的pH值会使硅胶溶解，太低的pH值会使键合的烷基脱落。RPC在现代液相色谱中应用最为广泛，据统计，它占整个HPLC应用的80%左右。,7.7 反相层析三、特点及用途,相似之处：均是利用不同物质与固定相之间的疏水性作用力不同进行色谱分离。不同之处：固定相的疏水程度不同；流动相组成不同；操作方式不同；应用范围不同。,反相色谱与疏水作用色谱的比较,7.7 反相层析四、反相层析的影响因素,在反相介质已经确定的情况下，影响反相层析分辨率的因素主要包括：流动
5、相的组成、洗脱模式、层析柱尺寸、流速、温度等。1. 流动相2. 洗脱模式3. 层析柱的尺寸4. 流速5. 温度,1. 流动相,1)流动相的组成：流动相中的有机溶剂可降低流动相的极性，流动相极性越低，其洗脱能力越强，因此洗脱时通常采用的有机溶剂比例会逐渐提高，以使各样品组分按疏水性由弱到强的顺序洗脱；对有机溶剂的要求：与水互溶、由较低的紫外吸收及较低黏度（如乙腈、甲醇、乙醇等）。2）流动相的pH值：反相层析的流动相条件多在低pH值下（pH2-4）层析介质（如硅胶）在高pH下不稳定；很多组分在低pH下具有较好的溶解性；低pH抑制了样品组分中酸性基团及硅胶上硅醇基的解离；为了使流动相保持在低pH下，
6、在流动相中加入酸（如三氟乙酸（TFA）。,2. 洗脱模式,由于溶质中不同组分的疏水性强弱不同，与固定相结合的牢固程度不同，在起始条件下，极性很强的组分不能结合在固定相上面直接被洗脱，其余组分结合在固定相表面，为了将这些组分洗脱下来，必须降低流动相的极性，即增加流动相中有机溶剂的比例。因此，反相层析的洗脱过程中流动相的组成随时间而变化。通常可采用阶段洗脱和梯度洗脱。最理想的洗脱条件是通过多次实验优化后得到的。,3. 层析柱的尺寸,层析柱的尺寸由其内径和柱长所决定，内径影响层析的规模，但对分辨率没有影响，柱长对分辨率的影响则与溶质的种类有关。对于小分子有机物，增加柱长可以提高柱效改善分辨率，而多肽
7、、核酸等生物大分子对柱长的敏感程度较低。,4. 流速,流速对于反相层析的影响是多方面的，一般来说，流速对于小分子的分离影响较大而大分子对流速变化敏感性较低。通常过高的流速会导致涡流扩散严重，影响样品在固定相和流动相之间的平衡，导致洗脱峰宽度变大分辨率下降；但过低的流速可能会导致样品组分纵向扩散加剧，也会使分辨率下降，且分离时间较长，不利于样品的稳定和较大规模的分离；,5.温度,温度对于反相层析的分离结果有较大的影响。提高温度能够降低流动相的黏度，增加传质速度，减少区带变宽现象，从而改善分辨率。但是在分离生物大分子的时候必须考虑到分子的稳定性，因此不宜用太高的温度。,7.7 反相层析五、高效液相
8、色谱简介,1. 基本原理2. 特点3. 应用4. 高效液相色谱仪的组成5. HPLC在蛋白分离中的应用及操作规程6. HPLC-RPC 在蛋白分离中的应用举例,7.7 反相层析五、高效液相色谱简介,高效液相色谱（High Performance Liquid Chromatography, HPLC）与经典的色谱法（或层析法）的分离机制类似混合物在流动相和固定相之间的分配系数不同，在两相中作相对运动时, 经过反复多次的吸附- 解吸的分配过程, 各组分在移动速度上产生较大的差别, 被分离成单个组分依次从柱内流出。,1. 基本原理,7.7 反相层析五、高效液相色谱简介,HPLC在经典液相色谱的基础
9、上，采用了高压泵、高效固定相和高灵敏度的检测器，具有高分辨率、高灵敏度、速度快 、自动化程度高等优点。3. 应用HPLC被广泛应用到生物化学、食品分析、医药研究、环境分析、无机分析等各种领域。高效液相色谱仪与结构仪器的联用是一个重要的发展方向。,2. 特点,7.7 反相层析五、高效液相色谱简介,（1）高压输送系统（2）进样系统（3）分离系统（4）检测系统及记录系统,4.高效液相色谱仪的组成,7.7 反相层析五、高效液相色谱简介,溶剂贮存器 ：贮存流动相（12L）高压泵：将贮存器中的流动相连续送入色谱系统，使样品在色谱柱中完成分离过程。压力：042MPa，流速：0.00110ml/min。梯度洗
10、脱装置：通过程序控制混合泵来使流动性的离子强度/pH/极性等发生梯度变化，提高分离效果和效率。,4.高效液相色谱仪的组成（1）高压输送系统,7.7 反相层析五、高效液相色谱简介,六通阀进样器是高效液相色谱系统中最理想的进样器，它是由圆形密封垫(转子)和固定底座(定子)组成。 工作原理：手柄装载(Load)位置时，样品经微量进样针从进样孔注射进定量环，定量环充满后，多余样品从放空孔排出；将手柄转动至进样(Inject)位置时，阀与液相流路接通，由泵输送的流动相冲洗定量环，推动样品进入液相分析柱进行分析。,4.高效液相色谱仪的组成（2）进样系统,7.7 反相层析五、高效液相色谱简介,柱管（柱壳）材
11、质：玻璃柱、不锈钢柱柱长及柱内径：4.6mm150mm/ 4.6mm250mm（分析柱）柱内经25mm （制备柱）固定相（填料）类型：凝胶柱、离子交换柱、亲和柱和反相柱。孔径：根据样品分子量大小选择填料的孔径。分子量越小，孔径要求也越小；反之亦然。粒径：5m（标准），3.0 m/3.5 m（短柱）,4.高效液相色谱仪的组成（3）分离系统,7.7 反相层析五、高效液相色谱简介,检测器：类型：紫外、荧光、电导、pH等检测器。性能要求：灵敏度高、噪音低、线性范围宽、响应快及对温度和流速不敏感等。记录系统：样品被分离成单个组分后，依次从柱内流出, 通过检测器时, 样品浓度被转换成电信号传送到记录仪，数
12、据以图谱形式打印出来或在电脑上显示。,4.高效液相色谱仪的组成（4）检测系统及记录系统,7.7 反相层析五、高效液相色谱简介,（1）色谱柱的选择：根据被分离蛋白的性质，选择适当的分离模式和不同规格和性能色谱柱。凝胶色谱反相色谱（2）样品液的准备：将分析样品转化为适合HPLC直接进样的样品。样品制备步骤：取材匀浆预分离浓缩溶解保持蛋白活性的措施：低温操作、添加蛋白酶抑制剂等提高蛋白溶解性的措施：适当加入表面活性剂、变性剂等在进样之前最好用0.45m/0.22 m膜过滤。（3）流动相的选择：合适的极性、良好的选择性、与检测器匹配。pH的选择：梯度洗脱条件的选择有机改良剂的加入：三氟乙酸（TFA）流动相的配制：互溶性、微孔膜过滤,5. HPLC在蛋白分离中的应用及操作规程,7.7 反相层析五、高效液相色谱简介,6. HPLC-RPC 在蛋白分离中的应用举例,思考题,1. 反相层析的基本原理是什么？2. 分析反相层析与疏水作用层析的区别与联系。3. 高效液相色谱的原理和特点是什么？4. 高效液相色谱仪有哪几部分组成？,
