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1、第7章 色谱分离技术,7.1 基本原理7.2 分配色谱7.3 凝胶过滤7.4 离子交换7.5 亲和色谱,7.1 基本原理,7.1.1 概述,1903年 俄国植物学家茨维持(，Tswet)在填充碳酸钙柱中用以石油醚冲洗植物色素萃取物，得到各色区带;1931年 氧化铝柱中胡萝卜素两种同分异构体的分离，表现出极高的分辨率;1944年 出现纸层析;1950年代 气相色谱出现，色谱分离的仪器化1960年代 高效液相色谱的发展，高效固定相填料获得突破进展,随着生物技术的发展，色谱分离已成为生物产品高度纯化最有效的的方法之一。从多数生物产品纯化工艺来讲，色谱分离是产品包装前的最后纯化工序。,色谱分离基本特点
2、,(1)分离效率高 是所有分离纯化技术中最高的(不计电泳)。若用理论塔板数来表示柱效率，每米柱长可达103105块塔板。通常色谱柱长一般只有几厘米至几十厘米。(2)应用范围广 从极性到非极性、离子型到非离子型、小分子到大分子、无机到有机及生物活性物质，以及热稳定到热不稳定的化合物，都可用色谱法分离。,(3)选择性强 色谱分离有很强的选择性,可通过多种途径选择不同的操作参数，以适应各种不同样品的分离要求。,(4)高灵敏度的在线检测(5)快速分离 高效细颗粒固定相载体和高压液相色谱分离技术的采用，保证在高分离效率前提下的高分离速率，可以提高单位时间的产量。(6)过程自动化操作,色谱/层析/色层机理
3、：利用多组分混合物中各组分物理、化学性质的差别，使各组分以不同程度分布在固定相和流动相中。当多组分混合物随流动相流动时，由于各组分物理、化学性质的差别，而以不同的速率移动，使之分离、纯化。,吸附色谱是指混合物随流动相通过固定相吸附剂时，由于固定相对不同物质的吸附力不同而使混合物分离。,7.1.2 色谱（Chromatography)分离的分类,7.1.2.1 按分离机理不同分类,(一)吸附色谱分离(Adsorption Chromatography，AC),吸附色谱是各种色谱分离技术中应用最早的一类，传统吸附色谱以各种无机材料为吸附剂。新型吸附色谱技术，如疏水作用色谱、金属整合作用色谱和共价作
4、用色谱等。,分配色谱流动相和固定相都是液体，利用混合物中各物质在两液相中的分配系数不同而分离。操作方法有两种：一种是固定相是将与流动相互不相溶的液体涂渍到载体上形成的；另一种是逆流分配法，固定相(重相)和流动相(轻相)都放在一组特别的分配管中，用来完成这种操作的仪器称为逆流分配仪。,(二)分配色谱(Distribution Chromatography，DC),离子交换色谱是基于离子交换树脂上可电离的离子与流动相中具有相同电荷的溶质离子进行可逆交换，由于混合物中不同溶质对交换剂具有不同的结合力而将其分离。该法适合于离子和在溶剂中发生电离物质的分离。离子交换色谱广泛用于生物大分子分离纯化，特别是
5、在蛋白质、多肽、核酸等生物物质的分离纯化。,(三)离子交换色谱(Ion Exchange Chromatography，IEC),(四)凝胶色谱(Gel Chromatography，GC),凝胶色谱以凝胶为固定相，是一种根据各物质分子大小不同而进行分离的色谱技术。凝胶色谱主要用于脱盐、分级分离及分子量的测定。凝胶是不带电荷的多孔网状结构的物质，每个凝胶颗粒的细微结构就如一个筛子。混合物随流动相流经凝胶柱时，较大分子不能进入所有的凝胶网孔而受到排阻，与流动相一起首先流出；小分子能进入凝胶网孔，凝胶柱中流出次序靠后。,生物体内许多大分子化合物具有与其结构相对应的专一分子可逆结合的特性(亲和力)。
6、把与目的产物具有特异亲和力的生物分子固定化后作为固定相，则当含有目的产物的混合物(流动相)流经此固定相时，即可把目的产物从混合物中分离出来。,(五)亲和色谱(Affinity Chromatography，AFC),广泛用于定性与定量分析，不用于制备和生产。,7.1.2.2 按固定相形状不同分类,(1)柱色谱,(2)纸上色谱,进样量大，回收容易。除用于分析外，还广泛用于生物样品的制备和工业生物产品的分离与纯化。,(3)薄层色谱,主要用于分析，也可用于小量样品的制备。,7.1.2.3 其他分类方法,(1)根据流动相的物态分类 气相色谱、液相色谱和超临界色谱,(2)根据操作压力分类 低压色谱(0.
7、5MPa)、中压色谱(0.55MPa)和高压色谱(550MPa)。,(3)根据洗脱操作分类,根据洗脱时展开方式的不同，可分为洗脱展开法、前沿分析法和置换展开法3种。,色谱和电泳是目前最好的两种分离方法，其塔板数可达百万数量级。但电泳法目前尚不能用于生产规模的分离与纯化，因而色谱技术成为分离和纯化蛋白质、酶、核酸、多糖等生物大分子物质的核心手段。,根据一次进样量的多少，色谱分离规模可分为：分析色谱：10mg 半制备色谱：1050mg 制备色谱：0.110g 工业色谱：20gd,7.1.3 生物工业中的色谱分离,(1)色谱分离的规模,(2)色谱分离方法的选择,对于蛋白质、酶、核酸等生物大分子，由于
8、它们分子量大、易失活以及具有生物专一亲和性等特点，较多地选用多糖基质(如纤维素、葡聚糖、琼脂糖等)离子交换色谱、疏水作用色谱、凝胶色谱和亲和色谱等。对于生物小分子的代谢物，由于它们分子量小、结构和性质比较稳定、操作条件不太苛刻，采用吸附、分配和离子交换色谱进行分离较为适宜。其中，氨基酸、有机酸、核苷酸等一些离子型化合物的生产多用离子交换色谱分离；而抗生素、生物碱、萜类、色素等次级代谢产物多采用吸附色谱或反相分配色谱分离。,色谱分离原理示意图,7.1.4 色谱分离的基本原理,色谱操作中，加入洗脱剂而使各组分分层的操作称为展开(Development)，洗脱时从柱中流出的溶液称为洗脱液(Eluat
9、e)，而展开后各组分的分布情况称为色谱(Chromatography)。,组分对固定相的亲和力：。随着洗脱剂加入，两组分将逐渐分开，亲和力弱的“”分子移动快，先从色谱中分离出来，亲和力强的“”分子后从色谱柱中出来。,被分离的混合物在流动相携带下通过固定相时，溶质在固定相和流动相之间的平衡关系服从分配定律：,7.1.4.1 分配色谱,分配色谱利用混合物中各组分在两种互不相溶的溶剂中分配系数不同而分离，相当于连续性的溶剂萃取。,(7-01),cs、c m分别为溶质在固定相和流动相中的浓度，Kd为分配系数。,离子交换色谱和亲和色谱也可归类于吸附色谱，前者主要是静电引力的作用，而后者是生物专一亲和力的
10、作用。,7.1.4.2 吸附色谱,吸附色谱分离就是根据吸附剂(固定相)对不同物质的吸附力不同而使混合物分离的。,在一定温度下，分离物质在液相和固相中的浓度关系可用吸附方程式来表示：,(7-14),(7-15),A吸附剂，B游离在液相中的溶质，AB表示吸附剂与溶质的结合方式。Ka、Kd分别为吸附与洗脱常数。,对大多数化合物而言，Langmuir吸附等温曲线是应用最多的:,双曲线(凸形线),凝胶色谱分离原理示意图,小分子溶质可自由进入凝胶颗粒内部，下移通道较大，下移速率较慢。,7.1.4.3 凝胶色谱,凝胶色谱分离已成为一种通用的分离方法，在生物大分子物质的制备与生产技术中被广泛应用。,(7-28
11、),(7-29),(7-30),凝胶色谱柱的总体积Vt分为3部分：,Vo为凝胶颗粒之间空隙的总体积；Vi为凝胶颗粒内部空隙总体积；Vm为凝胶颗粒基质本身所占体积。溶质分子充满色谱柱的体积，也即洗脱容积为：,或,Kd1，溶质分子完全不被排阻，可自由进入所有凝胶颗粒微孔。Kd0，溶质分子完全被排阻于凝胶颗粒微孔之外，最先被洗脱。对于中等分子，能进入部分凝胶空间，0Kd1。当具有不同分子量物质的混合液流经凝胶柱时，其Kd值的大小就决定了物质的流出顺序，即Kd值小的先流出，Kd值大的后流出。,工业规模色谱大多采用柱色谱法。,7.1.5 柱色谱分离法,7.1.5.1 柱色谱吸附剂,色谱所用吸附剂对分离性
12、能密切相关。用于生物产品分离的色谱柱应尽可能满足下述要求：(1)分离能力强：(2)分离速度高；(3)处理能力大；(4)目的产物回收率高，生物活性损失小；(5)使用寿命长，可再生，要求可反复再生使用半年以上；(6)成本较低，价格合理。,(一)无机基质吸附剂,用作分离介质的硅胶是人工合成的多孔二氧化硅，其表面含有很多硅羟基团，可以进行表面化学修饰(化学键合)或改性。以自由硅羟基对各种键合反应最为重要。,1硅胶(Silica Gel),活性炭是憎水性吸附剂，适宜于从水溶液中吸附非极性物质。活性炭柱色谱分离样品上柱量大，分离效果好，来源较易，价格便宜，适用于大量制备性的分离。但活性炭生产原料不同，制备
13、方法及规格不一，其吸附力不像氧化铝、硅胶那样容易控制，因此应用不广。,2活性炭,羟基磷灰石Ca10(PO4)6(OH)2，与生物体有很好的相容性。,3羟基磷灰石,(二)有机基质吸附剂,琼脂糖是D-半乳糖和3,6-脱水-L-半乳糖交替结合而成的链状多糖，是生物大分子物质色谱分离操作最常用的基质之一。用环氧氯丙烷使琼脂糖交联，可增强基质稳定性，调节交联剂和琼脂糖的比例可控制凝胶珠体的孔度大小。琼脂糖颗粒中带有大量的OH基团，亲水性好，且可以方便地进行化学修饰，接上一些官能团，以便与某些接枝“手臂”或配基共价结合，适应于各种色谱分离技术。,1琼脂糖(Agarose),2葡聚糖(Dextran),葡聚
14、糖(Dextran)是-1，6键相连的葡萄糖聚合物。由环氧氯丙交联葡聚糖得到的珠粒，商品名称为Sephadex。由于多糖骨架上有大量羟基，使得它的亲水性比Sepharose还强。凝胶的化学稳定性和热稳定性也很好。可以高压消毒，并且性质不变。,纤维素是-1，4键相连的D-葡萄糖(偶而有1，6键合)的线性聚合物，具有很高的孔度和亲水性。机械强度比葡聚糖凝胶和琼脂糖凝胶都好。它同样可以进行化学修饰，以满足不同的需要。纤维素及其众多的衍生物已被广泛地用于蛋白质类物质的纯化。,3纤维素,聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺与交联剂N，N甲叉双丙烯酰胺共聚得到的。聚丙烯酰胺亲水性好，pH 110范围内稳定，不为生物
15、降解，在色谱分离中有广泛用途。它主要用于凝胶过滤法和凝胶电泳法的生物大分子的分离中。,4.聚丙烯酰胺凝胶,聚乙烯醇系Toyo Pearl是以交联聚乙烯醇为骨架的凝胶过滤介质。Toyo Pearl为多孔的三向网状结构，大分子链上含有丰富的羟基，骨架为高亲水性。除广泛用于凝胶过滤外，还可进行化学改性而得到含有多种官团的离子交换吸附剂及亲和吸附吸附剂。,5聚乙烯醇,柱色谱装置一般由进样、流动相供给、色谱柱、检测及流分收集器等部分构成，其中色谱柱是色谱分离装置的关键部件。,柱色谱分离法装置,7.1.5.2 柱色谱装置,(一)进样及流动相供给装置,(二)色谱柱,柱的分离效率与柱长成正比，与柱径成反比。色
16、谱柱细长，一般ld2030。柱直径多为215cm。柱径增加可使样品负载量成平方地增加，但柱径大时，流动很难均匀，色带不易规则，分离效果差；柱径太小时，进样量少，且使用不便，装柱困难。,蛋白质中的肽键和芳香族氨基酸分别在206215nm以及280nm处有很强的光吸收，生物大分子物质色谱分离中，常用紫外分光光度计作为检测器，直接了解蛋白质的分离情况。流分收集器是将底部流出的液体，每次按一定量分别收集的仪器。以容量式和质量式较为方便实用。,(三)检测器与流分收集器,溶剂性质须适应所用固定相，大量样品溶液导入色谱柱后不马上扩散，集中在柱头，不会在柱内展开。,(一)样品溶解与进样方法,7.1.5.3 柱
17、色谱操作技术,样品上柱后，加入洗脱剂，使样品分离并收集目的产物。展开操作有多种方式，实际使用中选择何种操作方式取决于样品性质、所需产品纯度及产率等。,(二)展开操作,是应用最广的一种方法。操作时，先将样品输入色谱柱，随即加入一种不与固定相发生作用的溶剂或几种溶剂的混合物作为流动相冲洗。洗脱过程中，各组分因与固定相的作用力不同而分离，并随溶剂向下移动，最后有顺序地全部流出色谱柱。,1洗脱展开法,洗脱展开流出曲线,最先出现的峰是与固定相作用力最弱的溶质，以后顺次出现的峰其溶质与固定相的作用力顺次增加。,(1)恒定洗脱法(2)逐次洗脱法 洗脱剂的组成至少改变一次。逐次洗脱法设备要求也较简单，重现性较
18、好，故常用于较大规模色谱分离。(3)梯度洗脱法 梯度洗脱法就是逐渐改变洗脱剂的组成，使洗脱条件更有利于混合物的分离，从而消除重叠峰现象。,梯度洗脱装置,洗脱展开法可分为如下3种。,在前沿分析法中，样品溶液不是作为一部分进入色谱柱，而是连续不断地输入色谱柱，样品溶液本身起流动相的作用。当溶液通过固定相时，不同组分根据与固定相作用力强弱不同，产生不同的移动速率。,2前沿分析法,前沿分析不能将样品中每个组分都分离回收，而只能得到其中作用力最弱的纯物质，一般不用于混合物的分离。但此法适合于在产品的精制中除去痕量杂质。前沿分析法的一个显著特点是分离过程中样品溶液本身就是流动相，组分的浓度不会像洗脱展开中
19、那样逐渐稀释。,三组分前沿分析流出液组成图形,开始时，溶质全部吸收在固定相内，流出液为纯溶剂；经一段时间洗脱后，与固定相作用力最弱的A物质首先被洗脱出来，出现第1个阶梯；随后作用力较强的B物质和更强的C物质也先后流出，分别形成第2个、第3个阶梯，直至稳定不变。此时，输入与流出的组成完全相同。,与洗脱展开法差别不大，主要的不同之处是样品输入色谱柱后，用一种与固定相作用力极强的置换剂作为流动相，去替代结合在固定相表面的溶质分子。样品在置换剂推动下沿色谱柱前进，因样品各组分的作用力不同，向下移动的速率也就不同，最先从柱中被置换出来的是作用力最弱的溶质，最后出来的是置换剂本身。以流出液体积对溶质浓度作
20、图，也可得到一阶梯图，每一个阶梯只有一种成分。,3置换展开法,置换展开法区带图,置换展开法的优点是样品中各组分的浓度在展开过程中不但不会降低，有时甚至还能提高，即起到浓缩作用。,7.1.5.4 洗脱色谱动力学,目的产物与色谱吸附剂之间存在真正的扩散和化学作用，则可用下述五个步骤组成的机理描述：,(1)溶质从溶液主体传递到吸附剂表面；(2)溶质由吸附剂表面通过扩散作用进入吸附剂载体中；(3)溶质和吸附剂进行可逆反应，过程包括吸附、表面作和解吸；(4)解吸的溶质由吸附剂的内部扩散到表面；(5)溶质由吸附剂表面扩散到液相主体。,对多数的生化分离过程，通常受第2和第4步的内部扩散速度控制，因为目的产物
21、常是生物大分子，其扩散系数小。,根据传质理论，色谱分离的传质过程可表示为：,1 传质单元高度与传质单元数,(7-48),对于球形颗粒：,(7-49),d p 固定相颗粒直径;固定相空隙率 积分式(7-48)，可得使洗脱液从C0降至C所需的固定相填充柱长为：,(7-50),(7-51),(7-53),(7-52),通过对实验用色谱柱的测定，可确定L之值；从实验数据可求得传质单元数的近似值。由式(1251)便可求出传质单元高度。假定洗脱色谱分离的传质单元数N类似于分离级数，在上述式(7-39)中，若用传质单元数N取代级数，则有：,(7-54),(7-55),式中：,传质单元高度,传质单元数,实际色
22、谱过程中存在传质阻力(如固定相表面液膜扩散和内扩散)，溶质在两相间的分配平衡不可能瞬间完成，而需要一定的柱高。通常将溶质达到一次分配平衡的色谱柱段称为一个理论板(theoretical plate)，该柱段高度即理论板当量高度(heigh equivalent to a theoretical plate，HETP)。设高度为L的色谱柱的理论板数为N，则,2 理论板模型,(7-56),理论板模型示意图,当实测得到理论板数N后，即可利用式(7-56)计算理论板当量高度HETP。,洗脱曲线（Gauss分布）,理论板数越多，洗脱峰越窄，溶质之间的分离程度越好。,(7-57),HETP与流速的关系,(
23、7-59),液相色谱条件下，分子扩散的影响可忽略不计即式中A近似为零。,为提高分离效果，可通过降低流速u或减小固定相粒径即式中的C值来降低HETP，提高理论板数。降低流速意味着增加分离时间，因此采用减小粒径的方法可同时保证分离操作的高速度和高精度，很短的色谱柱具有很大的N，对高速度、高精度的分离有利。,分子扩散,流动相不均布,溶质在固定相扩散,分 离 度(resolution),洗脱曲线中相邻溶质相互分离的程度,下标1和2分别代表两个相邻洗脱峰。,Rsl时，溶质的分离已较好。一般为实现溶质间的良好分离，Rs值应在1-1.3之间。,Rs与 N的1/2次方成正比，两种溶质的分配选择性较小时，需要较
24、多理论板数才能获得较大分离度。,(7-60),在实验室规模的小型色谱分离实验成功后，要扩大应用到工业规模的生产上，必须进行有科学依据的放大。在分离能力扩大同时，要尽可能维持产物收率和纯度不改变。提高给料流量是增加生产能力的更有效的方法。要维持产物纯度，需要待处理物料中各组分的色谱浓度分布不能有大的改变。,(三)洗脱色谱分离的放大,径向色谱柱中，样品和流动相是从柱的圆周围流向柱圆心，可在较小的柱床层高度时使用较大的流动相流速；同时因圆柱表面积一般大于其横截面积，在流动相保持较高的体积速率时，反压降较低；当保持制备色谱柱直径不变，只增加柱长时，可以线性增大样品处理量，样品的规模可在保持相似的色谱条
25、件下直接放大，各组分的保留时间及分辨情况与小试时完全相同。,径向色谱柱原理示意图a垂直断面示意图 b水平断面示意图,为解决大直径色谱柱分离效果较差的问题，近年来发展了径向色谱柱技术，从原理上解决了色谱柱技术所存在问题。,7.1.5.5 径向色谱(Radial Flow Chromatographic column),径向色谱操作装置示意图1预平衡液 2样品 3流动相 4阀 5泵6径向色谱柱 7流量计 8压力表 9检测器 10记录仪,径向色谱柱在生物制剂、血液制品及基因工程产品等方面已广泛使用，其结果优于传统的轴向色谱柱。,7.2 分配色谱(Distribution chromatography
26、),正相色谱：固定相极性，流动相非极性；混合物随流动相通过固定相时，极性较强的化合物被保留，极性较弱的化合物先被洗脱下来。,反相色谱利用非极性的反相介质为固定相，极性有机溶剂的水溶液为流动相，用于分离非极性或弱极性物质。所用填料常以硅胶为基质，表面键合有极性相对较弱官能团的键合相。常用反相填料有：C18（ODS）、C8（MOS）、C4（Butyl）、C6H5（Phenyl）等。RPC中溶质通过疏水性相互作用分配于固定相表面。但是RPC固定相表面完全被非极性基团所覆盖，必须采用极性有机溶剂(如甲醇、乙腈等)或其水溶液进行溶质的洗脱分离。极性较强的组分先被冲洗出，而极性弱的组分在色谱柱上有更强的保
27、留。,反相介质性能稳定，分离效率高，可分离蛋白质、肽、氨基酸、核酸、甾类、脂类、脂肪酸、糖类、植物碱等含有非极性基团的各种物质。RPC做为定量分析手段，广泛应用于科学研究、临床诊断、工业检测和环境保护等各个行业。做为产品纯化制备手段，由于反相介质与其分离的对象相比价格较高，多限于实验室规模的应用，在大规律工业生产中应用较少。,RPC分离合成蛋白质混合液,RPC柱：4.635，TSK gel OctadecylNPR洗脱液A：含0.05TFA的水溶液洗脱液B：含0.05TFA的乙腈溶液线性梯度：15 80B(10min)流量l.5mlmin；1核糖核酸酶；2胰岛素；3细胞色素C；4溶菌酶；5乳白
28、蛋白；6肌红蛋白；7卵清蛋白,7.3 凝胶过滤(GFC),分离原理,洗脱曲线,7.3.1 分离原理,GFC操作中溶质的分配系数Kd只是相对分子质量、分子形状和凝胶结构(孔径分布)的函数，与所用洗脱液的pH值和离子强度等物性无关，即在一般的色谱操作条件下，相对分子质量一定的溶质的分配系数为常数。因此，GFC操作一般采用组成一定的洗脱液进行洗脱展开，这种洗脱法称为恒定洗脱法(isocratic elution)。,交联葡聚糖凝胶骨架结构,琼脂糖凝胶的骨架结构,Sephadex G是利用葡聚糖(右旋糖酐)交联制备的，交联剂一般采用环氧氯丙烷(epichlorohydrin)。原料中环氧氯丙烷用量越大
29、，交联度越高，凝胶的网状结构越紧密，吸水量越小。琼脂糖凝胶是另一种较常使用的凝胶过滤介质。Sepharose是常用的琼脂糖凝胶品牌之一，机械强度较低。利用环氧氯丙烷交联制备的Sepharose CL凝胶，机械强度较普通Sepharose高。,7.3.2 凝胶过滤介质,1.线速度,色谱柱：16300；HW 55F；Toyopearl HW55Fdp44 mHW40F：Toyopearl HW40F。dp44m；BSA牛血清白蛋白；OA蛋清白蛋白；Mb肌红蛋白；B12维生素12,中压GFC的HETP与线速度的关系,(7-59),正常操作下，HETP为凝胶粒径的23倍,7.3.3 影响分离特性的因素
30、,2.料液体积,为得到较高的分离度，料液体积需根据溶质之间分配系数的差别控制在适当的范围内，在不影陶分离度的前提下取最大值。,3.料液浓度,分离操作中发现，当料液浓度较高时，洗脱曲线常呈现不对称形状，如出现吐舌或拖尾，甚至出现分裂的两个峰，使HETP急剧增大。,1分离纯化,GFC用于相对分子质量从几百到106数量级的物质的分离纯化，在蛋由质、肽、脂质、抗生素、糖类、核酸以及病毒(50-400nm)的分离与分析中频繁使用。,GFC分离骨髓瘤血清IgA,色谱柱：10300，Superose 6洗脱液：0.05molL磷酸盐十0.15molL NaCl(pH7.0)，流量0.2 mlmin1-IgA
31、高聚体；2-IgA二聚体；3-IgA单体 4-IgG；5-白蛋白,7.3.4 GFC的应用及特点,2脱盐,GFC在生物分离领域的另主要用途是生物大分子溶液的脱盐，以及除去其中的相对分子质量物质。经过盐析沉淀获得的蛋白质溶液中盐浓度很高，一般不能直接进行离子交换色谱分离，可首先用GFC脱盐。,3相对分子质量的测定,凝胶过滤介质的分级范围内蛋白质的分配系数与相对分子质量的对数呈线性关系，所以GFC可用于未知物质相对分子质量的测定。,(767),4GFC的特点,GFC最大特点是操作简便，凝胶过滤介质价廉易得，适合于大规模分离纯化过程。GFC在生物大分子分离纯化过程中应用最为普遍，尤其被广泛应用于分离
32、纯化过程的初级阶段以及最后成品化前的脱盐。作为脱盐手段，GFC比透析法速度快，精度高；与超滤法相比，剪切应力小，蛋白质活性收率高。,7.4 离子交换(Ion exchange chromatography，IEC),离子交换色谱利用离子交换剂为固定相，根据带电溶质与离子交换剂之间静电相互作用力的差别进行溶质分离。,荷电溶质在离子交换剂上的分配系数可用下式表示：,其中，I为流动相的离子强度，A和B为常数，Kd,为离子强度无限大时溶质的分配系数，是静电相互作用以外的非特异性吸附引起的溶质在离子交换剂上的分配。对于不同的溶质，在离子交换剂上的分配行为不同，因此在洗脱过程中彼此之间得到分离。,(768
33、),离子交换色谱,常用于蛋白质等生物分子离子交换的阴离子交换基有：DEAE(二乙胺乙基，适用范围pH8.6；QAE(季铵乙基)。阳离子交换基有CM(羧甲基，适用范围pH4)，P(磷酸基)和SP(磺丙基)。用于离子交换色谱分离的凝胶基质如下表。常用于制备离子交换剂的介质有Sephadex、Sepharose、TS KgelPW、Toyopearl、BioGel A和纤维素等。,蛋白质等生物大分子为多价电解质，pH偏离等电点的溶液中净电荷数常为两位数以上，故B值比较大。一方面，蛋白质的分配系数对离子强度非常敏感，离子强度的微小改变，就会引起分配系数的很大变化；另一方面，不同蛋白质的B值可能相差很大
34、，即在同一离子强度下不同蛋白质分配系数可能相差非常大(几个数量级)。,如果采用离子强度不变的流动相进行恒定洗脱，两种蛋白质的洗脱体积相差很大，甚至分配系数大的蛋白质很难洗脱，造成洗脱剂的大量消耗和洗脱时间的大幅度增加。,(7-68),恒定洗脱过程中溶质A和B在IEC柱内的移动和洗脱曲线(溶质移动速度一定，柱内溶质之间距离逐渐增大),IEC很少用恒定洗脱法，多采用流动相离子强度线性增大的线性梯度洗脱法(1inear gradient elution)或离子强度阶跃增大的逐次洗脱法(stepwise elution)。,线性梯度洗脱过程中，流动相的离子强度线性增大，因此溶质分配系数连续降低，移动速
35、度逐渐增大，使恒定洗脱条件下难于洗脱的溶质B在较小的流动相体积下洗脱。,线性梯度洗脱过程中溶质A和B 在IEC柱的移动和洗脱曲线溶质的移动速度不断增大，直至与流动相流速相同(m0),改变流动相离子强度的增大速度(即浓度梯度)，可调整溶质的洗脱体积，即溶质洗脱峰之间的距离，在改善分离度的同时缩短洗脱时间。,IEC的应用及特点,IEC是蛋白质、肽和核酸等生物产物的主要纯化手段。这主要是由于IEC基于离子交换的原理分离纯化生物产物，不仅具有通用性，而且选择性远高于GFC。,IEC柱：7.575，TSK ge1 SP5PW；A液：0.02molL磷酸盐乙腈(7030)，pH3.0；B液：0.5mol
36、L磷酸盐乙腈(7030)，PH3.0；梯度：线性AB(30min)；流量l.0Lmin；图中：1催产肽；2脑啡肽；3TRH；4 内啡肽；5 LHRH；6神经降压素；7-MSH；8 血管紧张肽II；9P物质；10-内啡肽,IEC分离激素多肽,7.5 亲和色谱(Affinity Chromatoraphy，AFC),亲和色谱是专门用于纯化生物大分子的色谱技术。它基于固定相的配基与生物分子间的特殊生物亲和能力的不同来进行分离。其显著特点是高选择性，且色谱过程操作条件温和，能有效地保持生物大分子高级结构的稳定性，活性样品的回收率也比较高。,7.5.1亲和色谱特点,亲和色谱被广泛用于酶、治疗蛋白、抗体、
37、核酸、辅助因子等生物大分子以及细胞、细胞器、病毒等超分子物质的分离与纯化。,亲和色谱操作示意图(-目标产物，-杂蛋白),7.5.2亲和色谱原理,根据选择性的高低，可将亲和色谱分为专一性和基团性两类。前者的配基仅对某种生物物质有特别强的亲和性，如单克隆抗体对抗原的特异性吸附就属此类。后者则指固定相配基对一类基团有极强的亲和关系，如一些辅酶(NAD+，NADP+，ATP等)能与许多需要这些辅酶才起催化作用的酶发生亲和结合。,亲和载体选择性好，但不是任何生物高分子都有特定配基。针对某一生物大分子的分离，需要制备专一的配基，并选择特定的色谱条件。这使亲和色谱吸附剂的商品化受到限制。亲和色谱所用固定相载
38、体是由对生化物质有特异亲和力的配位体偶联在惰性载体上构成。载体制备过程一般包括3步，即载体(基质)的选择、载体的活化和配基的连接。,7.5.3 亲和色谱载体,国际知名牌号的亲和色谱载体基质：美国Amicon公司的Matrex CellufineTM(交联纤维系)法国IBF公司的UltrogelR(聚丙烯酰胺琼脂糖)英国Shandon公司的Hyperil WP300TM(硅)日本东洋曹达公司的Toyopearl，等等,载体基质的特性对分离纯化效果至关重要。常规的亲和色谱载体都是以软质凝胶，诸如葡聚糖、琼脂糖、聚丙烯酰胺等作为载体材料的。这些载体材料虽然机械强度较差，传质速率低，但在生物技术领域中
39、仍被广泛采用。,亲和色谱中常用一些小分子化合物作为配基制备亲和载体，但小分子的配基直接连接于琼脂糖上常产生无效吸附剂，其原因是由于载体的空间位阻关系，使大分子化合物(亲和物)不能直接接触到配基。解决的办法是在载体和配基之间引入适当长度的“手臂”(间隔基)，以减少载体的空间位阻，增加配基的活动度。作为“手臂”的烃链可以先连接于载体，再通过它连接于配基上。,亲和色谱中引入“手臂”原理,亲和色谱一般采用柱色谱法。洗脱方法有两类：普通洗脱法和专一性洗脱法。,与其他色谱分离一样，可通过改变溶剂或缓冲液的类型，改变缓冲液的pH和离子强度，改变洗脱温度，以及添加促溶剂等措施进行洗脱。,7.5.4 亲和色谱操
40、作和应用,亲和色谱分离在生物制品分离和分析领域有宽广的应用开发前景。应用亲和色谱分离技术分析血液中纤维蛋白溶酶和纤维蛋白溶酶原的含量，所用的载体基质为Toyopearl HW65(粒径2040m，排除相对分子质量5106Da)，使用甘氨酰酞替甘氨酸作隔离体，而固定化配位体为p-氨基苯酰脒。其色增分析系统如图所示。用免疫亲和色谱柱纯化干扰素，产品纯度比原用方法提高近10倍。,亲和色谱分离纤维蛋白溶酶和纤维蛋白溶酶原分析系统图1切换阀门；2 泵(1mlmin)；3 调节阀；4 压力表；5 注样器；6 过滤器；7 色谱柱(2530)；8 萤光检出器(蛋白质用)；9 集样器(4)；10 两点记录仪；1
41、1 蠕动泵；12 压力表；13 反应盘管(37)；14 萤光检出器(酶活性测定定用),高效液相层析（HPLC）,特点：使用的固相支持剂颗粒很细，表面积很大,因而分辨率很高。溶剂系统采用高压，因此洗脱速度增大。许多类型的柱层析都可用HPLC来代替，如分配层析、离子交换层析、吸附层析、凝胶过滤等。,高效液相色谱仪,Fermentation,Culture supernatant,Centrifugation to remove cells,Liquid preparation to animal feed market,Fermentation,Culture supernatant,Fermen
42、tation,Cell pellet,Intracellular fraction,Animal feed enzyme Analytical enzyme Therapeutic protein,Centrifugation to remove cells,Centrifugation to remove medium,Proteinprecipitation,Cell lysis&Centrifugation,Protein fraction,Proteinprecipitation,Protein fraction,1 or 2 purificationsteps,Semi-purifi
43、edprotein,3-4 purificationsteps,Homogeneousprotein,Sterile bottling,To pharmaceuticals market,LyophilisationBottling,To chemicals market,C 细胞膜蛋白质,1为什么说色谱分离的效率是所有分离纯化技术中最高的?2各种色谱分离(吸附、分配、离子交换、凝胶、亲和)的机理是什么?3分析色谱与制备和工业色谱的主要区别是什么?4色谱分离中吸附剂的基本要求是什么?常用色谱载体基质材料有哪些?5 亲和色谱载体中引入“手臂”的原理是什么?6含有3种溶质A、B、C的混合液，它们与固定相的作用力依次增强(即ABC)，其浓度分别为A：0.5、B：1.2、C：0.8。试分别绘出采用洗脱展开法、前沿分析法和置换展开法操作时的流出曲线图。,思 考 题,
