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1、第三章 紫外可见分光光度法,紫外可见吸收光谱紫外可见分光光度计朗伯比尔定律分析条件的选择测定方法,第一节 紫外可见吸收光谱,光学分析基础紫外-可见吸收光谱影响紫外-可见吸收光谱的因素紫外可见吸收光谱的应用,1.1光学分析基础,一 电磁辐射的性质 1、光学分析法：根据物质发射的电磁辐射或电磁辐射与物质相互作用建立起来的一类分析方法。 2、电磁辐射:以巨大速度通过空间、不需要任何物质作为传播媒介的一种能量(交变电场和磁场 )。 3、波动性和粒子性,(1)波动性:电磁辐射为正弦波（波长、频率、速度、振幅）。与其它波，如声波不同，电磁波不需传播介质，可在真空中传输 。,频率：为空间某点的电场每秒钟达到
2、正极大值的次数（单位时间电磁场振动次数）。 周期：两个相邻矢量极大（或极小）通过空间某固定点所需的时间间隔叫做辐射的周期。 波长：相邻两个波峰或波谷间的距离。 波数：是1cm内波的数目=1/。,普朗克方程：E = hv，式中的h叫普朗克常量(Planck constant), 其值为6.62610-34 Js。,普朗克认为, 物体只能按h的整数倍一份一份地吸收或释出光能, 而不可能是0.5h等任何非整数倍。即所谓的能量量子化概念，但它只涉及光作用于物体时能量的传递过程。,2 能态 (1)量子理论:物质粒子总是处于特定的不连续的能量状态，即能量是量子化的。 (2)当粒子的状态发生变化时，该粒子将
3、吸收或发射完全等于两个能级之间的能量差； 反之亦是成立的，即：,二 电磁波谱,白光为一复合光,三 物质的颜色,能复合成白光的两种颜色的光叫互补色光。物质所显示的颜色是吸收光的互补色，即透过光颜色,物质颜色和吸收光的关系,1.2 紫外-可见吸收光谱的产生,1 原理 运动的分子外层电子-吸收紫外-可见光区的辐射 - 产生电子能级跃迁 -紫外-可见吸收光谱。,能级组成：除了电子能级外，分子吸收能量将伴随着分子的振动和转动，即同时将发生振动能级和转动能级的跃迁！据量子力学理论，分子的振-转跃迁也是量子化的或者说将产生非连续谱。因此，分子的能量变化E为各种形式能量变化的总和：,其中Ee最大：1-20eV
4、; Ev次之： 0.05-1eV; Er最小：0.05eV,2分子吸收光谱跃迁类型,1. *跃迁： 饱和烃（乙烷:max=135nm） E很高，150nm（远紫外区）2. n *跃迁： 含杂原子饱和基团（OH，NH2） E较大，150250nm（远紫外区）3. *跃迁： 不饱和基团（CC，C O ） E较小， 200nm 体系共轭，E更小，更大4. n *跃迁： 含杂原子不饱和基团（C N ，C O ） E最小， 200400nm（近紫外区）,备注：,紫外可见光谱电子跃迁类型：n*跃迁 *跃迁饱和化合物无紫外吸收电子跃迁类型与分子结构及基团有密切联系。根据分子结构推测可能产生的电子跃迁类型。根
5、据吸收谱带波长和电子跃迁类型推测分子中可能存在的基团（分子结构鉴定）。,3、相关的基本概念,(1)吸收光谱（吸收曲线）： 不同波长光对样品的作用不同，吸收强度不同,以A作图所得的曲线 。 (2)吸收光谱特征：定性依据 吸收峰max 吸收谷min 肩峰sh,(3)生色团（发色团）：分子中含有非键或键的电子体系，能吸收紫外可见光的原子基团或结构单元。 例： CC；CO；CN；NN注：当出现几个发色团共轭，则几个发色团所产生的吸收带将消失，代之出现新的共轭吸收带，其波长将比单个发色团的吸收波长长，强度也增强。(4)助色团:本身无紫外吸收，含有孤对电子，可使生色团吸收峰向长波方向移动并提高吸收强度的一
6、些官能团。,(5)红移和蓝移： 由于化合物结构变化（共轭、引入助色团取代基）或采用不同溶剂后吸收峰位置向长波方向的移动，叫红移（长移）吸收峰位置向短波方向移动，叫蓝移（紫移，短移）。(6)增色效应和减色效应 增色效应：吸收强度增强的效应。 减色效应：吸收强度减小的效应。(7)强带和弱带： max105 强带;min103 弱带,4 有机化合物的紫外可见吸收光谱,（1）饱和烃及取代烃 饱和单键碳氢化合物含有C-H和C-C键，只含有键电子, 一般在远紫外区才有吸收，又称为真空紫外区，因为小于160nm的紫外光要被空气中的氧所吸收，因此需要在无氧或真空中进行测定，应用不多；这类化合物在2001000
7、nm范围内无吸收带，在紫外吸收光谱中常用作溶剂，如己烷，庚烷，环己烷等。当饱和单键碳氢化合物中的氢被氧，氮，卤素，硫等杂原子取代时，即其取代物如卤代烃，醇，胺等，由于这类原子中有n电子，可产生n* ，从而产生红移。,（2）不饱和烃及共轭烯烃 这类化合物含有孤立双键和共轭双键，都含有电子，吸收能量后可产生*跃迁 。 由共轭双键（两个双键被一个单键隔开时称为共轭体系）中跃迁产生的吸收带称为K（*）带。 特点：强度大，摩尔吸收系数大，通常在1042104L mol-1cm-1，吸收峰的位置一般在217280nm；K带的波长和强度与共轭体系的数目，位置和取代基的种类有关。,丁二烯max =217nm
8、max ：104 巴豆醛max=217.5nm max :1.5104 芳香环上如有生色团取代时，也会出现K带，如：苯乙烯max：248nm max ：1.4104苯甲醛max=249nm max ：1.1104,（3）羰基化合物（醛酮） 醛酮中均含有羰基，含有n，和电子，可产生n*，* 和n*三个吸收带，n*又称为R带，落于近紫外或紫外光区，吸收带出现在270300nm，强度低，吸收系数为1020，并且谱带略宽。 醛酮的羰基与双键共轭时，形成不饱和醛酮类化合物，发生红移，强度增强。,（4）苯及其取代物苯有三个吸收带，它们都由*跃迁引起的：B带是由苯环本身振动及闭合环状共轭双键-*跃迁而产生的
9、吸收带，是芳香族（包括杂环芳香族）的主要特征吸收带。其特点是：在230270nm呈现一宽峰，且具有精细结构，max= 255nm，max约200，属弱吸收,常用来识别芳香族化合物。B带在气态或非极性溶剂中，有许多的精细结构，是由于振动跃迁在基态电子跃迁上的叠加，在极性溶剂中，溶质与溶剂分子的相互作用使这种精细结构消失。,E吸收带 E带也是芳香族化合物的特征吸收谱带，可以认为是苯环内三个乙烯基共轭发生的-*跃迁所发生的。 E带可分为E1和E2二个吸收带。E1带的吸收峰大约在180nm（104）；E2带约在200nm（7000），都属强吸收。一般来说，El带是观察不到的，当苯环上有生色团取代且与苯
10、环共轭时，E2带常与K带合并，吸收峰向长波移动。,苯乙酮的紫外吸收光谱,溶剂:正庚烷,K带：max= 240nm，=13000B带：max= 278nm，=1100R带：max= 319nm，=50,取代基能影响苯原有的三个吸收带，其中影响较大的是E2带和B带，当苯环上引入OH, CHO, NO2, NH2时，苯的B带显著红移，吸收强度也有所增加，但B带的精细结构也消失，这是由于n*共轭所致；而当烷基取代时，对苯的吸收光谱影响不大 稠环芳香族化合物的紫外吸收光谱的最大特征是共轭体系增加，使波长红移，吸收强度增强 。,1.3影响紫外可见吸收光谱的因素,1 溶剂效应(1)对max影响：,溶剂对亚异
11、丙酮吸收带的影响,一般来说,随着溶剂极性增大, * 跃迁吸收峰红移, n* 跃迁吸收峰紫移。,(2)对吸收光谱精细结构影响 随着溶剂极性的增大,分子振动受到限制,精细结构就会逐渐消失,合并为一条宽而低的吸收带。选择收光谱曲线的溶剂时，应注意如下几点：（1）尽量选用低极性溶剂。（2）能很好地溶解被测物，并且形成的溶液具有良好的化学和光化学稳定性。 （3）溶剂在样品的吸收光谱区无明显吸收。下表列出紫外、可见吸收光谱中常用的溶剂，以供选择时参考。,2 共轭体系的存在 - 红移 CH2=CH2 的* 跃迁， max 165200nm ；而 1,3- 丁二烯， max =217nm 由于键与键相互作用，
12、产生共轭效应，生成大键，使*轨道的能量降低，*跃迁所需的能量也减小，所以生色团的吸收谱带移向长波区和吸收强度增加.,共轭双键数增加，红移增大,1.4 紫外-可见吸收光谱的应用,1 定性分析 不同的有机化合物具有不同的吸收光谱。根据化合物的特征吸收峰波长和强度可以进行物质的鉴定，结合红外光谱，质谱和核磁共振谱进行定性鉴定和结构分析,2 有机化合物的构型，构象测定（1）顺反异构 一般，反式异构体的max和max比相应的顺式异构体大。 在顺式肉桂酸和反式肉桂酸中，顺式空间位阻大，苯环与侧链双键共平面性差，不易产生共轭；反式空间位阻小，双键与苯环在同一平面上，容易产生共轭。因此，反式的最大吸收波长ma
13、x =295 nm，而顺式的最大吸收波长max =280 nm。,（2）互变异构体 根据紫外吸收光谱的max判断是否存在互变异构体,酮式没有共轭双键，它在204nm处仅有弱吸收；而烯醇式由于有共轭双键，因此在245nm处有强的K吸收带（=18000Lmol-1cm-1),3 定量分析 根据朗伯比尔定律，物质在一定波长处的吸光度与它的浓度成正比，因此，选择合适的波长，测定溶液的吸光度就可求出溶液的浓度和物质的量。,第二节 紫外可见分光光度计,图3.6 紫外-可见分光光度计,1：光源；2：单色器；3吸收池；4检测系统；5显示系统,一 主要部件与性能,（一） 光源,白炽光源：钨灯或卤钨灯可见光源 3
14、501000nm气体放电光源：氢灯或氘灯紫外光源 200360 nm,基本要求,所需的光谱区域内能够发射连续辐射足够的辐射强度良好的稳定性辐射能量随波长的变化应尽可能小,（二） 单色器,1 单色器：能从光源辐射的复合光中分出单色光的装置2 组成：狭缝、色散元件（棱镜，光栅）3 棱镜色散原理：依据不同的波长光通过棱镜时有不同的折射率而将不同波长的光分开。(1) 玻璃棱镜：由于玻璃可吸收紫外光，玻璃棱镜只能用于350 3200 nm的波长范围，能用于可见光域内。(2) 石英棱镜：石英棱镜可使用的波长范围较宽，可从185 4000nm，可用于紫外、可见和近红外三 个光域 。,4 光栅原理：利用光的衍
15、射与干涉作用制成的范围：紫外、可见及红外光域，在整个波长区具有良好的、几乎均匀一致的分辨能力。优点：它具有色散波长范围宽、分辨本领高、成本低、便于保存和易于制备等优点。缺点：各级光谱会重叠而产生干扰,可用二维色散技术克服。,（三）吸收池,1、吸收池功能：用于盛放分析试样2、材料 玻璃能吸收UV光，仅适用于可见光区 石英不能吸收紫外光，适用于紫外和可见光区。3、要求：匹配性（对光的吸收和反射应一致），为减少光的损失，吸收池的光学面必须完全垂直于光束方向。,（四）检测系统,1 功能：检测信号、测量单色光透过溶液后光强度变化的一种装置。2 检测器类型：光电池、光电管和光电倍增管。3 硒光电池：范围为
16、300800nm，其中500 600nm最为灵敏。用于低档的分光光度计中。4 光电管：在紫外-可见分光光度计上应用广泛。5 光电倍增管：检测微弱光最常用的光电元件，它的灵敏度比光电管要高200倍，因此可使用较窄的单色器狭缝，从而对光谱的精细结构有较好的分辨能力。,（五）显示系统,作用：放大信号并以适当方式指示或记录下来。常用装置：直读检流计、电位调节指零装置，数字显示或自动记录装置，现在用工作站。,二、紫外-可见分光光度计的类型,单光束分光光度计双光束分光光度计双波长分光光度计,特点：使用时来回拉动吸收池（轮流通过参比溶液和样品溶液）移动误差结构简单，操作方便，维修容易,（一）单光束分光光度计
17、,光电倍增管,切光器,光闸,比色皿,单色器,单光束分光光度计原理图,（二）单波长双光束分光光度计,特点：不用拉动吸收池(同时通过参比溶液和待测溶液），可以减小移动误差可以自动扫描吸收光谱,样品溶液,（三）双波长分光光度计,双波长分光光度计原理图,特点：定量基础：A=A1- A2可消除干扰和吸收池不匹配引起的误差，不需要参比溶液。适用于分析多组分混合物，混浊试样（生物组织液）,第三节 LamberBeer定律,透射比和吸光度LamberBeer定律吸光系数偏离LamberBeer定律的因素,透过光的强度(t )和入射光强度(o)之比称为透光度（T)： T=t / o为表示物质吸收光的程度引入吸光
18、度(A)概念：,一 、透光度和吸光度,二 、Lamber-Beer定律,描述物质对单色光吸收强弱(吸光度）与液层厚度和待测物浓度的关系,A= Elc=E bc=bc=abc,讨论：,1Lamber-Beer定律的适用条件（前提） （1）入射光为单色光 （2）溶液是稀溶液 （3）均相体系2在同一波长下，各组分吸光度具有加和性 应用：多组分测定。,吸光度的加和性,如有一复杂试样，其中含有几个组分，各个组分都有各自的吸光系数 ，浓度c和吸光度A，那么溶液的吸光度等于各组分的吸光度之和： A=A1+A2+A3+An = 1c1b+ 2c2b+ 3c3b+ncnb,例1 某有色溶液，用1cm比色皿时其透
19、射比为T，如改用2cm比色皿时其透射比为多少？ 解例2 已知某一有机化合物，在波长520 nm处的摩尔吸光系数为9.29104L/（mol cm)，今用2cm的吸收池，在该波长处测得的吸光度为0.89，求有色化合物的浓度？ 解：c=A/b=0.89/(9.291042)=4.7910-6,三、 吸光系数,1吸光系数的物理意义：单位浓度、单位厚度的吸光度E=A/(bc),当b以cm, c以g/L为单位时, 吸光系数以a表示: A=acb当b以cm, c以mol/L为单位时, 摩尔吸光系数以表示 A=cb,四、偏离朗伯比尔定律的因素,依据Lamber-Beer定律，A与C关系应为经过原点的直线。偏
20、离Lamber-Beer定律的主要因素表现为以下两个方面。,（一）光学因素（二）化学因素,A= bc,（一）光学因素,1非单色光的影响：Lamber-Beer定律应用的重要前提入射光为单色光,一般仪器所获得的入射光是具有一定波长范围的复合光，由于物质对不同波长的光有不同的吸光系数，从而使得吸光度的变化偏离Lamber-Beer定律消除方法：选择较窄的入射狭缝宽度和提高单色器分辨率决定,2杂散光的影响： 杂散光：指与测量波长相同，在仪器内部不通过试样而到达检测器的那部分辐射，以及单色器通带范围以外的额外辐射。杂散光来源：仪器本身缺陷；光学元件污染（灰尘散射，光学部件反射，散射）。当杂散光可以被试
21、样吸收，所得的吸光度大于真实值，出现正偏差；若不被吸收，吸光度小于真实值，出现负偏差。消除办法：提高仪器自身的性能。,3反射光和散射光的影响：反射光（吸收池内外界面间产生的）和散射光（颗粒较大的吸收质点产生的）均是入射光谱带宽度内的光直接对T产生影响，产生假吸收的现象，使T，A，吸收光谱变形。注：一般可用空白对比校正消除。4非平行光的影响：使光程，A，吸收光谱变形,（二）化学因素,Beer定律适用的另一个前提：稀溶液；浓度过高会使C与A关系偏离定律。溶质浓度过高（0.01mol/L), 吸光物质分子或离子间的平均距离缩小，使相邻吸光分子的电荷分布相互影响，从而改变它对光的吸收能力 ，浓度越大，
22、这种影响就越大。溶质浓度改变可能会引起其离解，缔合，光化学反应，互变异构，络合物配位数变化等作用，使被测组分的吸收曲线发生变化。 消除办法：采用稀溶液分析,第四节 分析条件的选择,仪器测量条件的选择显色反应条件的选择参比溶液的选择,一 仪器测量条件的选择,1，入射光波长的选择： 一般用最大吸收波长，如有干扰则选用其他波长。2，吸光度读数范围的选择：透射比读数误差是常数，但不同读数范围误差不同；通常可通过调节溶液浓度或改变光程b来控制A的读数在 0.15-0.8 范围内，此时吸光度读数误差最小 。,二 显色反应条件的选择,（一 ）显色反应和显色剂1 显色反应：被测元素（金属离子）在某种试剂作用下
23、,转变为有色化合物的反应2 显色剂：所用的试剂3 对显色反应的要求:（1）选择性好（2）灵敏度要高（3）有色配合物的组成一定并且稳定,（二）影响显色反应的条件1 显色剂用量：配位数与显色剂用量有关；在形成逐级配合物，其用量更要严格控制 2 溶液酸度：配位数和水解等与 pH 有关3 显色时间、温度、放置时间通过条件实验确定显色反应条件,三 参比溶液的选择,参比溶液目的：消除溶液中其它成分（溶剂，试剂，样品基体）以及吸收池对光的反射和吸收所带来的误差1. 溶剂参比：试样组成简单、共存组份少(基体干扰少)、显色剂不吸收时，直接采用溶剂(多为蒸馏水)为参比； 2. 试剂参比：当显色剂或其它试剂在测定波
24、长处有吸收时，采用试剂作参比(不加待测物)； 3. 试样参比：如试样基体在测定波长处有吸收，但不与显色剂反应时，可以试样作参比(不能加显色剂),第五节 测定方法,单组分定量方法多组分定量方法,一 单组分定量方法,1吸光系数法 2标准曲线法,定量依据： A= bc,1吸光系数法,例：维生素B12 的水溶液在361nm处的百分吸光系数为207，用1cm比色池测得某维生素B12溶液的吸光度是0.414，求该溶液的浓度例：精密称取B12样品25.0mg，用水溶液配成100ml。精密吸取10.00ml，又置100ml容量瓶中，加水至刻度。取此溶液在1cm的吸收池中，于361nm处测定吸光度为0.507，求B12的百分含量？,2标准曲线法,前提：固定测定条件和仪器条件,芦丁含量测定,二 多组分定量方法,1两组分吸收光谱不重叠（互不干扰） 两组分在各自max下不重叠分别按单组分定量,2两组分吸收光谱部分重叠 1测A1b组分不干扰可按单组分定量测Ca 2测A2a组分干扰不能按单组分定量测Cb,3两组分吸收光谱完全重叠混合样品测定方法：解线性方程组法,紫外可见光谱小结,紫外可见吸收光谱的产生定量基础：Lamber-Beer 定律紫外可见分光光度计分析条件的选择测定方法（单组分，双组分）,
