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1、荧光光谱分析仪,分析测试中心 陈仕云,分子荧光光谱仪,A,原子荧光光谱仪,B,第一节 荧光光谱分析仪,一、概 述,荧光：某些物质吸收光能量后，可发射波长与激发光波长相同或不同的光，当激发光源停止照射试样时，再发射过程立即停止，这种再发射的光称为荧光（fluorescence）。荧光包括分子荧光和原子荧光。荧光分析法：通过测定物质分子产生的荧光强度进行物质的定性与定量分析的方法。荧光光谱仪：采用荧光分析法来测量的仪器。,一、概 述,荧光产生机制 物质的分子吸收了照射光的能量后，处于基态最低能级的分子被激发到电子激发态的各个振动能级。被激发的分子与周围的分子碰撞，并把部分能量以热能的形式传给周围的
2、分子，自己降落到单线第二电子激发态的最低振动能级。然后，由此最低振动能级向基态的各个振动能级跃迁，同时以发光的形式释放出其能量。这种光即为荧光。,一、概 述,1.振动弛豫,2.内转换,3.猝灭,4.系间跨越,s单重态,T多重态,1 ,2激发波长;,荧光,3磷光,分子去活化过程及荧光产生示意图,一、概 述,荧光分析的特点优点：灵敏度高（可达1012g数量级）；选择性强，有利于分析复杂的多组分混合物；用样量少、特异性好、操作简便。缺点：对温度、pH值等因素变化比较敏感；应用范围较窄，只能用来测量发荧光的物质，或与某些试剂作用后发荧光的物质。,二、荧光分析的基本原理,（一）激发光谱和荧光光谱 任何发
3、射荧光的物质都具有两个特征光谱，即激发光谱（excitation spectrum）和荧光光谱(fluorescence spectrum)。激发光谱和荧光光谱是荧光分析中定性和定量的基础。,激发光谱：连续改变激发光波长，固定荧光发射波长，测定不同波长的激发光照射下，物质溶液发射的荧光强度的变化。以激发光波长为横坐标，荧光强度为纵坐标作图，即可得到荧光物质 的激发光谱。 从激发光谱图上可找到 发生荧光强度最强的 激发波长ex。,荧光光谱：用ex作激发光源，并固定强度，测定不同波长的荧光强度。以荧光波长为横坐标，荧光强度为纵坐标作图，便得荧光光谱。荧光强度最强的波长为em 。荧光物质的ex和em
4、 是鉴定物质的依据，也 是定量测定中所选用的 最灵敏的波长。,（二）物质的分子结构和荧光的关系强荧光物质的分子结构特征： 具有大的共轭- 双键结构，共轭体系越大，越容易产生荧光； 具有刚性平面结构； 具有最低的单线电子激发态，S1为- 型； 若取代基团为给电子取代基，荧光强度增加。,三、荧光光谱仪的原理与分类,荧光光谱仪的工作原理 在激发光的频率、强度以及液层厚度不变的情况下，荧光物质所发射的荧光强度与溶液的浓度成正比。因此，可以通过测定荧光强度来求出该物质的含量。 荧光分析法所测量的是待测物质所发射的荧光强弱，属于发射光谱分析，荧光光度计和荧光分光光度计属于发射光谱仪器。,三、荧光光谱仪的原
5、理与分类,荧光光谱仪分类荧光光度计（fluorophotometer）：采用滤光片做单色器，结构较简单，功能也较差。荧光分光光度计（fluorospectrophotometer）： 采用棱镜或光栅为色散元件，结构较复杂，功能较强，但价格远远高于荧光光度计。,三、荧光光谱仪的原理与分类,FP-6500荧光分光光度计,三、荧光光谱仪的原理与分类,Jasco FP8500 荧光光谱仪,三、荧光光谱仪的原理与分类,ARL 9800 系列 X射线荧光光谱仪,三、荧光光谱仪的原理与分类,荧光光谱仪的主要结构激光光源：单色器：样品池：检测器：记录显示系统：,荧光分光光度计光路图,PF8500 荧光光谱仪的
6、性能指标主要包括：灵敏度:800:1波长范围:Ex:200-850nm Em:200-850nm波长精度:0.3nm分辨率:1nm光谱带通:0.3nm信噪比,灵敏度灵敏度是指能被仪器检出的最低信号，或某一标准荧光物质稀溶液在选定波长的激发光照射下能检出的最低浓度，是仪器最重要的性能指标之一。多数荧光光谱仪的灵敏度较高，可达10-10g10-12g水平，有利于检测体液中的微量物质。,波长范围波长范围指荧光光谱仪的有效工作波段，包括激发通道波长范围、投射通道波长范围和荧光通道波长范围。波长范围越大，应用范围越广。一般荧光分光光度计都采用氙灯作光源，光栅为单色器分光元件，其有效工作波段在200nm1
7、000nm范围之内。,波长精度指其波长计数器的指示值与真实光波长的数值相符的程度。特定的激发波长和发射波长是定性分析和定量测定的基础，因此波长精度也是荧光光谱仪的核心指标之一。目前荧光分光光度计的波长精度误差在（0.2nm2nm）范围之内。,分辨率指荧光仪器对靠近的峰尖分开的能力，它与波长精度有密切关系，决定着对混合物成分分析特异性的好坏。常用仪器的分辨率在0.2nm5nm之间，主要由光栅的每毫米刻线数决定。,光谱带通指仪器主机狭缝宽窄程度的指数。以一定狭缝几何密度对应的光谱半宽度来直接表示光谱纯度。光谱纯度直接影响仪器的分辨率、灵敏度以及背景干扰。目前的荧光分光光度计的光谱带通在0.15nm
8、20nm之间，一般都采用连续可调方式。,信噪比与响应速度用空白样品测得的峰值叫做噪声峰值，待测样品测得的峰值和噪声峰值之比就叫做信噪比。信噪比越高，检测结果的准确性也越高。仪器的响应速度是指电路样品通道对光电信号反映的快慢。响应速度关系到波长扫描速度的选择、光谱峰的尖锐程度以及随机噪声的大小。,PF8500 荧光光谱仪的操作,PF8500 荧光光谱仪的操作,PF8500 荧光光谱仪的操作,PF8500 荧光光谱仪的操作开机：插上电源插头，打开仪器power，再打开电脑。双击桌面“SpectraManger”，打开测试软件，双击Spectra Measurement。点击Search Maxim
9、un 进行 Ex、Em 的最大波长扫描（最大波长扫描时 Ex、Em 灯打开）。,PF8500 荧光光谱仪的操作单击“Measure”菜单中“Paramenters”，进行参数设置，测量Em：固定Ex，起始波长与Ex相差10-20nm波长，终止波长不作要求；测量Ex：固定Em，终止波长小于Em，起始波长不作要求；参数设置好后点ok，设置完毕。关闭“Ex”、“Em”，点击“auto zero”进行调零。,PF8500 荧光光谱仪的操作打开“Ex、Em”，点“S”进行样品测试。点击“File”菜单中“Export”保存“txt”文件。关机：先关测试软件和电脑，再关仪器。,荧光光谱仪的使用与维护严格按
10、照仪器规定的操作步骤进行操作。电源：电压、电流、电源的稳定须符合仪器规定。 光源：需预热20min，灯及其窗口要保持清洁。 单色器：应注意防潮、防尘、防污和防机械损伤。 光电倍增管：加高压时切不可受外来光线直接照射。 样品池：使用时应同一个方向插放，不能经常磨擦。,荧光光谱仪的使用与维护放入样品后注意关闭样品仓盖，避免入射光露出样品仓。样品检测完毕后，需要对样品进行专门的回收处理，不得随意倒入水池中，避免污染环境，造成对自己和他人健康的危害。,荧光光谱仪的故障排除,仪器出现故障，必须请专门人员进行检修。安全防护：操作者不能直视光源，以免紫外线损伤眼睛。遇到突发事件，要先关仪器，再关电闸。,七、
11、荧光光谱仪的临床应用,七、荧光光谱仪的临床应用,七、荧光光谱仪的临床应用,七、荧光光谱仪的临床应用,七、荧光光谱仪的临床应用,七、荧光光谱仪的临床应用,七、荧光光谱仪的临床应用,七、荧光光谱仪的临床应用,七、荧光光谱仪的临床应用,七、荧光光谱仪的临床应用,第二节 原子光谱分析仪,一、概 述,原子光谱分析仪的特点优点：分析速度快、操作简便、选择性好、灵敏度高、测定范围广、试剂用量少等，可同时测定多种元素，不必进行复杂的分离处理。缺点：对温度、pH值等因素变化比较敏感；应用范围较窄，只能用来测量发荧光的物质，或与某些试剂作用后发荧光的物质。,一、概 述,原子光谱分析仪的分类,二、原子荧光光谱仪,原
12、子荧光光谱分析法（AFS）： 利用原子荧光谱线的波长和强度进行物质的定性与定量分析的方法。在一定实验条件下，被测元素的浓度与荧光强度成正比，据此可对物质进行定量分析。特点：设备简单、灵敏度高、光谱干扰少，工作曲线线性范围宽，可以进行多元素测定，应用广泛。,原子荧光光谱仪分类色散型原子荧光光谱仪非色散型原子荧光光谱仪 两类仪器的结构基本相似，差别在于非色散型仪器不用单色器。,二、原子荧光光谱仪,色散型原子荧光光谱仪结构特点辐射光源：激发产生原子荧光；单色器：选择荧光谱线，排除其他光的干扰；原子化器：将被测元素转化为原子蒸气；检测器：检测光信号并转换为电信号，常用光电倍增管；显示和记录装置：显示和
13、记录测量结果，包括了电表、数字表、记录仪等。,二、原子荧光光谱仪,二、原子荧光光谱仪,AF-610D环保型原子荧光光谱仪,二、原子荧光光谱仪,AF-630环保型原子荧光光谱仪,我国最新推出的AF-630环保型原子荧光光谱仪是世界上第一台三通道环保型原子荧光光谱仪，实现了世界首创的“高效除汞技术”，有效解决了汞污染。,二、原子荧光光谱仪,荧光光谱仪的性能指标：检测灵敏度特征浓度分辨率基线稳定度波长精度测量精度,检测灵敏度检测灵敏度是指在一定浓度时，测量值的变量（dA）与相应的待测元素浓度的变量（dC）之比，即s = dA/dC。就是校准工作曲线的斜率，表明吸光度对浓度的变化率，可以理解为单位被测
14、元素浓度变化量引起的吸光度变化量。变化率越大，灵敏度越高。,特征浓度指产生1吸收或0.0044吸光度时所对应的被测元素的浓度或质量。特征浓度S值越小，表示分析灵敏度越高。特征浓度还不能用来表征某仪器对某元素能被检出所需要的最小浓度，但它可以用于估算较适宜的浓度测量范围及取样量。,检出限指在选定的实验条件下，被测元素溶液能给出的测量信号3倍于标准偏差时所对应的浓度（mg/L）或质量(mg或g)，反映仪器对某元素在一定条件下的检出能力。既反映仪器的质量和稳定性，也反映仪器对某元素在一定条件下的检出能力范围越大，应用范围越广。检出限越低，说明仪器性能越好，对元素的检出能力越强。,原子光谱分析仪的使用严格按照仪器规定的操作步骤进行操作：,原子光谱分析仪的常见故障,开机故障或没有吸收；灵敏度低；精密度差；表针回零不好；基线不稳，噪音过大。 出现故障，必须请专门人员进行检修。,原子光谱分析仪在临床检验中的应用血浆（或血清）中钠、钾离子火焰光度法测定血清锌的原子吸收法测定石墨炉原子吸收光谱法测定血铅石墨炉原子吸收光谱法测定血中镉含量 砷元素测定,原子光谱分析仪的新进展全谱直读功能智能化、小型化、实用化、低分析成本,全谱直读等离子体发射光谱仪,便携式光谱仪,谢谢！,
