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1、现代遗传学,Modern Genetics,长江大学生命科学学院,2,第七章遗传物质的分子基础Chapter 7 Molecular basis of inheritance,第一节DNA作为主要遗传物质的证据第二节DNA的结构及其复制第三节遗传信息的表达与调控第四节基因的概念与发展第五节核酸研究技术简介本章要求复习思考题,3,遗传学在微观水平的深入,基因的化学基础是什么？遗传的染色体理论认为：基因位于细胞核内染色体上；染色体的主要化学成份蛋白质和核酸何者为基因的化学基础？“蛋白质是遗传物质”观点及其主要论据。基因化学本质的条件：具有三种功能遗传功能(复制与世代传递)表型功能(具有适当的控制性
2、状的表达机制)进化功能(能够产生变异满足生物进化的要求),4,三个学派,E. Schrdinger(薛定谔，1945)：What is life?二十世纪，由于物理学、化学和数学研究工作者的加入，在生物学与遗传学研究领域形成了三个学派：物理学结构结构学派化学生化生化学派数学信息信息学派,5,第一节 DNA作为主要遗传物质的证据,一、DNA作为主要遗传物质的间接证据二、DNA作为主要遗传物质的直接证据、细菌转化试验、噬菌体侵染与繁殖试验 、烟草花叶病毒拆合实验,6,一、DNA作为主要遗传物质的间接证据,基因存在于染色体上（真核生物）:,7,8,9,二、DNA作为主要遗传物质的直接证据,、细菌的转
3、化肺炎双球菌（Streptococcus pneumoniae）:,光滑型（S型）有荚膜，有毒性，形成光滑菌落粗糙型（R型）无荚膜，无毒性，形成粗糙菌落按血清免疫反应分为许多抗原型，常用R、R和S、S、S等加以区别。,10,Frederick Griffiths Transformation Experiment 1928,首次将一种类型的肺炎双球菌R转化为另一种类型S ，实现了细菌遗传性状的定向转化。,推测: 被加热杀死的 S型肺炎双球菌必然含有某种促成以上结果的活性物质。,11,Oswald T. Averys Transformation Experiment - 1944,证据：此物质
4、不受蛋白酶、多糖酶和核糖核酶（Rnase）的影响，而只能为DNA酶所破坏。,用生物化学方法证明以上活性物质是DNA。,12,13,14,、 噬菌体侵染与繁殖试验,噬菌体侵染与繁殖基本过程P是DNA的组成部分，不存在于蛋白质中S存在于蛋白质中，DNA中没有,Structure of T2 phage,15,Life cycle of virulent T2 phage,T2噬菌体浸染大肠杆菌后，遗传物质进入细菌细胞,利用大肠杆菌的遗传信息表达系统合成噬菌体组件,16,Bacteriophage Experiment (Hershey和Chase) - 1953,1.T2 bacteriophag
5、e is composed of DNA and proteins:2.Set-up two replicates:Label DNA with 32PLabel Protein with 35S3.Infected E. coli bacteria with two types of labeled T24.32P is discovered within the bacteria and progeny phages, whereas 35S is not found within the bacteria but released with phage ghosts.,17,试验结果表明
6、：主要是由于DNA进入细胞内才产生完整的噬菌体结论：DNA才是(噬菌体的)遗传物质,1969: Alfred Hershey,18,、烟草花叶病毒拆合实验,烟草花叶病毒(TMV)是由RNA与蛋白质构成的管状微粒：中心是单链螺旋RNA、外部是蛋白质外壳,19,Gierer & Schramm Tobacco Mosaic Virus (TMV) Experiment - 1956Fraenkel-Conrat & Singer - 1957,Used 2 viral strains to demonstrate RNA is the genetic material of TMV,20,综上所述
7、：到上世纪中期，多方面证据都直接或间接地表明DNA是主要的遗传物质，而在缺乏DNA的某些病毒中RNA就是遗传物质。,21,第二节DNA的结构及其复制,一、DNA的结构二、DNA的复制半保留半不连续复制,22,一、 DNA的结构,23,、Levene 的四核苷酸假说1930s,四核苷酸假说奠定了核酸化学基础核苷酸是核酸的基本组成单位核酸是“磷酸核糖(碱基)磷酸”的核苷多聚体核酸多聚体是由“四核苷酸结构”重复形成每个四核苷酸结构包含四种碱基各一个,24,核酸是以核苷酸（nucleotide）为单元构成的多聚体，是一种高分子化合物。,含氮碱基,磷酸,五碳糖,核苷酸,25,DNA核苷酸RNA核苷酸,五
8、碳糖：脱氧核糖碱基：A、T、C、G,五碳糖：核糖碱基：A、U、C、G,26,DNA四种脱氧核苷酸,27,、Chargaffs 定则1950s,四种碱基的数量不是等量的嘌呤碱基总量与嘧啶碱基的总量(克分子总量)相等(A+G=T+C)，且A=T、G=C。DNA碱基组成具有物种特异性，而无组织特异性。,28,、DNA 双螺旋结构的发现,29,1、DNA分子结构的研究,、鲍林(Pauling)研究小组主要工作：1951年(提出蛋白质-螺旋模型后)开始研究DNA分子结构根据阿斯伯利（Astbury）等1938年获得的DNA分子晶体X射线衍射图像(显示DNA分子晶体呈螺旋结构)进行研究提出DNA分子三链螺
9、旋结构模型：引入多链、螺旋和氢链等概念。,评价：虽然他们提出的模型并不正确，但是其研究方向和所采用的方法却为DNA分子结构模型研究确立了方向。注：1954年鲍林因研究物质聚合力而获得诺贝尔化学奖,30,1、DNA分子结构的研究,、威尔金斯、富兰克林研究小组Wilkins和Franklin改进了DNA分子晶体X射线衍射图谱技术，于1951年获得了更为清晰的图像。X-ray diffraction studies of Rosalind Franklin & Maurice H. F. WilkinsConclusion：DNA is a helical structure with distin
10、ctive regularities, 0.34 nm & 3.4 nm.,31,Xray photograph of DNA with high quality,核糖与磷酸连接成的扭曲绳子，每一节上都有配对的碱基碱基位于螺旋内侧而磷酸基团在外侧，同时测得了DNA螺旋的直径和螺距。,Wilkins, Maurice (1916-),Franklin, Rosalind (1920-1958),DNA X-ray crystallography,32,1、DNA分子结构的研究,、瓦特森（Waston）、克里克（Crick）研究小组(1951-1953)研究手段非常简单：用纸板等做磷酸、核糖和碱基
11、模型，拼凑DNA分子的三维结构。理论知识深厚、富于创造性；视野广阔、收集信息全面并善于分析利用。,33,拿来主义,主要基于Chargaff、Pauling和Wilkins等三个方研究成果，Waston和Crick于1953年提出了他们的第三个DNA双螺旋结构模型。,1962: Nobel Prize in Physiology and Medicine,What about?Rosalind Franklin,It is a regret that she died in 1958,34,2、 DNA分子双螺旋结构模型,35,DNA分子双螺旋结构模型要点（六点）,Two polynucleot
12、ide chains wound in a right-handed (clockwise) double-helix.Nucleotide chains are antiparallel: 5 33 5Sugar-phosphate backbones are on the outside of the double helix, and the bases are oriented towards the central axis.Complementary base pairs from opposite strands are bound together by relatively
13、weak hydrogen bonds.A pairs with T (2 H-bonds), and G pairs with C (3 H-bonds).e.g.,5-TATTCCGA-33-ATAAGGCT-3 Base pairs are 0.34 nm apart. One complete turn of the helix requires 3.4 nm (10 bases/turn).Sugar-phosphate backbones are not equally-spaced, resulting in major and minor grooves.,36,3、DNA分子
14、构型的多态性,DNA的构象现已知有A，B，C，D，E，T，Z 7种引起DNA双链构象改变有以下因素：,核苷酸顺序碱基组成盐的种类相对湿度,37,B-DNA生理状态，每螺圈10.4个碱基对，右手螺旋A-DNA高盐浓度下，每螺圈11个碱基对，右手螺旋Z-DNA序列富含GC，嘌呤和嘧啶交替出现，每螺圈12个碱基对，左手螺旋,38,4、DNA的三级结构,所谓DNA的三级结构，是指在一二结构基础上的多聚核苷酸链上的卷曲。在一定意义上，是指双螺旋基础上的卷曲。三级结构包括链的扭结和超螺旋或者是单链形成的环或是环状DNA中的连环体。松驰型 DNA(relax form)超螺旋(Supercoied) DNA
15、：负超螺旋、正超螺旋,39,40,、RNA的分子结构,RNA (A pairs with U and C pairs with G)Examples:mRNAmessenger RNAtRNAtransfer RNArRNAribosomal RNAsnRNAsmall nuclear RNA,single-stranded,Yeast Alanine tRNA,41,二、DNA的复制半保留半不连续复制,The model of DNA Replication一端沿氢键逐渐断开以单链为模板，碱基互补氢键结合，聚合酶等连接形成新的互补链形成了两个新DNA分子,42,Alternative mod
16、els of DNA replication,43,1958: Matthew Meselson & Frank Stahls Experiment,Semiconservative model of DNA replication,44,45,、复制起点和复制方向,原核生物：大多数细菌和病毒只有一个复制起点，控制整个染色体的复制，且为双向复制（例外：噬菌体P2）。真核生物：每条染色体的DNA复制都是多起点；每条染色体有多个复制子；且为双向复制。,复制子(Replicon )：在同一个复制起点控制下的一段DNA序列。,46,、复制起点和复制方向,原核生物：大多数细菌和病毒只有一个复制起点，控制
17、整个染色体的复制，且为双向复制（例外：噬菌体P2）。真核生物：每条染色体的DNA复制都是多起点；每条染色体有多个复制子；且为双向复制。,复制子(Replicon )：在同一个复制起点控制下的一段DNA序列。,47,、原核生物DNA合成,1、有关DNA合成的酶DNA聚合酶DNA聚合酶DNA聚合酶,48,、原核生物DNA合成,2、DNA复制的过程DNA双螺旋的解链DNA解旋酶在ATP供能下，每分钟旋转3000次解开双螺旋,单链DNA结合蛋白马上结合在分开的单链上，以避免产生单链内配对DNA拓扑异构酶来解决由于复制叉的推进而产生超螺旋,49,、原核生物DNA合成,2、DNA复制的过程DNA合成的开始
18、合成DNA片段之前，先由RNA聚合酶合成一小段RNA引物(约有20个碱基对)。然后DNA聚合酶才开始起作用合成DNA片段。,复制叉结构,50,、原核生物DNA合成,2、DNA复制的过程后随链的不连续复制DNA聚合酶，以5 3 方向发挥作用从3 5 合成方向的一条链，就会遇到麻烦,Kornberg A. (1967)提出不连续复制假说：在3 5方向链上，仍按从5 3的方向一段段地合成DNA单链小片段“冈崎片段”(10002000个bp) 由连接酶连接这些片段形成一条连续的单链。,51,Leading and lagging strand synthesis,52,、RNA病毒中RNA的自我复制,
19、单链RNA病毒先以自己（+链）为模板合成一条互补的单链（链)这样就形成了双螺旋的复制型。链从+链模板中放释出来。以链为模板复制一条互补的+链，形成了一条新的病毒RNA。,53,、真核生物DNA合成的特点,1、DNA合成发生的时间：仅为细胞周期的S期。 2、复制的起始点为多起点。3、合成所需的RNA引物和冈崎片断都比原核生物的短。,4、控制前导链和后随链的聚合酶不同。5、染色体端体的复制。,54,Telomerase: Replication of Chromosome Termini,55,Replication of Telomeres,56,真核生物与原核生物DNA合成的区别,57,第三节
20、遗传信息的表达与调控,一、RNA的种类和功能二、遗传密码及其特点三、遗传信息的转录与RNA的加工四、蛋白质的生物合成五、中心法则及其发展六、基因表达调控（自学）,58,一、RNA的种类和功能,信使RNA (mRNA, messenger RNA)携带并传递DNA中的遗传信息核糖体RNA (rRNA, ribosomal RNA)与蛋白质结合形成核糖体的前体转移RNA (tRNA, transfer RNA)在蛋白质合成过程中转运AAsnRNA(small nuclear RNA)DNA转录及hnRNAmRNA过程中起调控作用,59,tRNA的二、三级结构,60,二、遗传密码及其特点,遗传密码D
21、NA分子中核苷酸的排列顺序与蛋白质中氨基酸排列顺序之间的对应关系。遗传密码是由三个碱基组成的，因此叫三联体密码。遗传密码的特点简并现象 具有起始密码子和终止密码子 具有连续可读性和不重叠性 普遍通用性,61,1、简并现象,色氨酸(UGG)和甲硫氨酸(AUG)例外，仅一个三联体密码其余氨基酸都有一种以上的密码子,62,2、具有起始密码子和终止密码子,61个为有义密码，起始密码为GUG、AUG(甲硫氨酸)3个为无义密码，UAA、UAG、UGA为蛋白质合成终止信号,63,3、具有连续可读性和不重叠性,密码子与密码子之间无逗号，按三个三个的顺序一直阅读下去，不漏不重复。如果中间某个碱基增加或缺失后，阅
22、读就会按新的顺序进行下去，最终形成的多肽链就与原先的完全不一样(称为移码突变)。,在一个mRNA上每个碱基只属于一个密码子；均以3个一组的形成氨基酸密码。,64,4、普遍通用性,在整个生物界中，从病毒到人类，遗传密码通用,脊椎动物,果蝇,酿酒酵母,丝状真菌,睡病虫,65,三、遗传信息的转录与RNA的加工,66,RNA和DNA合成的区别,67,、原核生物RNA的合成,转录后形成一个RNA分子的一段DNA序列称为一个转录单位。 一个转录单位可能刚好是一个基因，也可能含有多个基因。,RNA转录分三步：RNA链的起始RNA链的延伸RNA链的终止及新链的释放,68,1、RNA聚合酶,亚基与四聚体核心酶形
23、成有关亚基存在核苷三磷酸的结合位点含有与DNA模板结合的位点因子只与RNA转录的起始有关,69,2、RNA链合成的起始,70,3、RNA链的延伸,71,4、RNA链的终止,不依赖因子的终止,依赖因子的终止,72,1、原核生物与真核生物RNA转录的区别、 真核生物RNA的转录是在细胞核内，翻译在细胞质中进行原核生物则在核区同时进行转录翻译,、真核生物RNA的转录及加工,73,1、原核生物与真核生物RNA转录的区别,、真核生物一个mRNA只编码一个基因原核生物一个mRNA编码多个基因、真核生物有RNA聚合酶、等三种不同的酶原核生物则只有一种RNA聚合酶,74,1、原核生物与真核生物RNA转录的区别
24、,、真核生物中转录的起始更复杂，RNA的合成需要转录因子的协助进行转录原核生物则较为简单,75,1、原核生物与真核生物RNA转录的区别,、真核生物的mRNA 转录后进行加工，然后运送到细胞质中进行翻译原核生物无需进行加工，边转录边翻译,76,2、真核生物RNA转录后的加工,5端戴帽3端加尾内含子剪切,77,四、蛋白质的生物合成,合成场所合成体系(合成起始、肽链延伸、翻译终止）合成后的加工与修饰（肽链中AA残基的化学修饰，N端部分AA的切除，信号肽的切除，肽链的折叠，切除前体中功能不需要的肽段，二硫键的形成等）合成后的贮存、转运与功能行使,78,The specific differences
25、between prokaryotic and eukaryotic ribosomes are summarized,79,80,、多肽链的起始,81,、多肽链的延伸,The increase of the growing polypeptide chain by one amino acid is called elongation. The sequence of the second triplet in mRNA dictates which charged tRNA molecule will become positioned at the A site (step 1). On
26、ce it is present, peptidyl transferase catalyzes the formation of the pep-tide bond, which links the two amino acids (step 2). This enzyme is part of the large subunit of the ribosome. At the same time, the covalent bond between the amino acid and the tRNA occupying the P site is hydrolyzed (broken)
27、. The product of this reaction is a dipeptide, which is attached to the 3;-end of tRNA still residing in the A site.,82,在核糖体上合成蛋白质,83,多聚核糖体提高蛋白质的合成效率,84,、多肽链的终止,UAG, UAA, or UGA. These codons do not specify an amino acid, nor do they call for a tRNA in the A site. These codons are called stop codons
28、, termination codons, or nonsense codons. The finished polypeptide is therefore still attached to the terminal tRNA at the P site, and the A site is empty. The termination codon signals the action of GTP-dependent release factors, which cleave the polypeptide chain from the terminal tRNA, releasing
29、it from the translation complex (step I).,85,五、中心法则及其发展,中心法则遗传信息从DNA转录到mRNA再翻译成蛋白质，以及遗传信息从DNA到DNA的复制过程，这就是分子生物学的中心法则。这一法则提示了基因的两个基本属性：自我复制和控制蛋白质合成。,86,中心法则的发展,87,RNA的反转录,RNA肿瘤病毒：反转录酶，以RNA为模板来合成DNA。,逆转录过程中cDNA的合成,88,六、基因表达调控（自学）,原核生物基因表达调控正调控和负调控乳糖操纵子色氨酸操纵子与衰减作用基因表达的时序调控DNA序列重排的调控真核生物基因表达调控DNA及染色体水平的
30、调控转录水平的调控（顺式作用元件和反式作用元件）转录后水平的调控（RNA编辑，mRNA前体的选择性拼接，反义RNA的调控）,89,90,第四节基因的概念与发展,一、Evolution of the concept of the gene: Function二、Evolution of the concept of the gene: Structure三、现代分子遗传学关于基因的概念,91,一、Evolution of the concept of the gene: Function,Mendel: Unit factors controlling phenotypic traits,92,
31、Garrod: One mutant gene One metabolic block,在20世纪初，英国医生A.Garrod首先发现人类中几种先天性代谢缺陷疾病，如苯丙酮尿症（phenylketonuria简称PKU）就是由一个常染色体隐性基因决定的。,93,Beadle & Tatum(1941)：“one gene one enzyme”,用X射线诱导处理红色面包霉，筛选出被诱导的突变体来进行实验。根据遗传分析和大量研究 ，他们认为基因发生突变，就可能导致酶活性的丧失。,94,基因： arg1 arg2 arg3 酶： E1 E2 E3 前体：前体 鸟氨酸 瓜氨酸 精氨酸,95,研究血红
32、蛋白时发现，正常HbA有四条多肽链（2条链，2条链）Vernon M.Ingram证明链第六位氨基酸HbA是谷氨酸，HbS是缬氨酸（镰刀形细胞贫血症）。这是证明基因与氨基酸之间存在直接对应关系的第一个直接证据。,One Gene, One Protein；One Gene, One Polypeptide Chain,96,二、Evolution of the concept of the gene: Structure,The Beads-on-astring conceptAccording to this beads-on-a-string concept, the gene wasth
33、e basic unit of genetic information defined by three criteria: (1) function, (2) recombination, and (3) mutation. The unit of function, the unit of genetic material that controlled the inheritance of one character or one attribute of phenotype.The unit of structure, operationally defined in two ways
34、:By recombination: as the unit of genetic information not subdivisible by recombination.By mutation: as the unit of genetic material capable of independent mutation.,97,、Discovery of recombination within the gene,In 1940, C.P.Oliver studied mutations at the lozenge locus on the X chr. of Drosophila:
35、 alleles lzs “spectacle” eye lzg “glassy” eye female lzs / lzg lozenge x male lzs or lzg 0.2% wild-type progeny ?Reversion ?1. The freq. of reversion of lzs or lzg to w.t. in hemi- zygous lozenge males was much lower than 0.2% ;2. The rare w.t. progeny always carried an X chr. With lz+ that was flan
36、ked by recombinant out-sider markers.,98,The results of these pioneering studies first indicated that the gene was more complex than a bead on a string: the gene was divisible, containing sites that were separable by crossing over.,99,、基因的微细结构,1955年，美国的S.Benzer（本泽）用大肠杆菌T4噬菌体作为材料，研究快速溶菌（rapid lysis）突
37、变型r的基因精细结构1、重组测验 2、互补测验,100,T4野生型在E. Coli 菌苔上产生小而不规则的噬菌斑。T4突变品系按表型可分为：rI、rII、rIII三类。,其中rII在E.Coli B上产生快速溶菌现象，形成大而圆噬菌斑，在E.Coli K()上不能生长。,101,r mutant :large, sharp-edged plaques,Wild type:small, fuzzy plaques,102,1、重组测验,操作方法：用两种rII突变型双重感染B品系，收集溶菌液；分别接种到B品系、K()品系菌苔上；考察两个品系菌苔上的噬菌斑数目，就可以计算两个突变位点间的重组值；绘制
38、连锁遗传图。由于采用了条件致死选择系统(即在E. Coli K()上rII不能生长)，分辨率极高，可以检测到十万分之一的重组值。,103,Benzers method for identifying recombinants of two rII mutants of T4.,104,Benzers map of the rII region generated from crosses of 60 different mutant T4 strains.,第三节 基因内部的精细结构,105,2、互补测验,互补作用两个突变型细胞的两条同源染色体同处在一个杂合体细胞或局部合子时，野生型基因补偿突
39、变基因的缺陷而使细胞的表型恢复正常的作用。否则，两种突变型一定具有相同功能损伤。互补测验（complementation test，顺反位置效应测验） 比较顺式和反式构型的细胞，从而判断两个突变是 否属于同一基因的测验测验基因间是否互补。,第三节 基因内部的精细结构,106,反式构型两个突变分别位于两条同源染色体上的基因组合。 顺式构型两个突变位于同一个染色体上的基因组合。,107,Benzer 顺反子概念和基因内重组 Discovery of Recombination Within the Gene,Benzer 以T4噬菌体为材料进行了研究工作 ，正式提出“顺反子”这个术语,108,10
40、9,三、现代分子遗传学关于基因的概念,基因是DNA分子上带有遗传信息的特定核苷酸序列区段基因由重组子、突变子序列构成重组子是DNA重组的最小可交换单位突变子是基因突变的最小单位重组子和突变子都是一个核苷酸对或碱基对(bp)基因(决定某一性状表现)可以包含多个功能单位(顺反子),110,相关概念,突变子（Muton）指性状突变时，产生突变的最小单位。一个突变子可以小到只是一个核糖核酸对。重组子（recon）指在发生性状重组时，可交换的最小单位。一个交换子只包含一个核糖核酸对。顺反子（作用子）（cistron）一个起作用的单位，即通常指的基因。一个作用子所包括的一段DNA与一个多肽链的合成相对应。
41、,111,Development of the concept of gene,60年代，Jacod和Monod研究细菌基因调控时发现基因是可分的，功能上是有差别的。、结构基因（structural gene）可编码RNA或蛋白质的一段DNA序列。、调控基因（regulator gene）其产物参与调控其他结构基因表达的基因。,112,、重叠基因（overlapping gene）,指同一段DNA的编码顺序，由于阅读框架（open reading frame, ORF）的不同或终止早晚的不同，同时编码两个或两个以上多肽链的基因。,Overlapping gene: gene within ge
42、ne,113,、隔裂基因（split gene）,指一个结构基因内部为一个或更多的不翻译的编码顺序，如内含子（intron）所隔裂的现象。外显子：参加蛋白质编码的DNA片段内含子：不参加蛋白质编码的DNA片段,114,、跳跃基因（jumping gene）,指可作为插入因子和转座因子移动的DNA序列。,115,、假基因（pseudogene）,同已知的基因相似，但位于不同位点，因缺失或突变而不能转录或翻译，是没有功能的基因。,116,第五节核酸研究技术简介,一、Analysis of DNA二、核酸分子杂交三、DNA重组技术四、基因文库与cDNA文库五、聚合酶链式反应（PCR）六、核酸分子标记
43、技术七、DNA芯片(DNA Chip)技术,117,一、Analysis of DNA,118,1、UV absorption,DNA absorb UV light most strongly at wavelength of 260nm.,119,2、Sedimentation behavior density gradient centrifugation ( CsCl ),the percentage of G-C pairs in DNA is directly proportional to the buoyant density of the DNA molecule.,120,
44、3、(Pulsed-field)Electrophoresis DNA size(Kb,Mb),121,4、Digestion restriction map,122,二、核酸分子杂交,Southern blotNorthern blotWestern blotIn Situ Chromosome,DNA杂交原理示意图,123,1、Southern blot(DNA/DNA),124,2、Northern blot(RNA/DNA),125,3、Western blot(Protein),126,4、 In Situ Chromosome,127,Auto-radiograph showing
45、 chr. locations of mouse satellite DNA seq.,Visualization of human telomeres by using fluorescent dyes and in situ hybridization.,128,129,三、DNA重组技术,130,四、基因文库与cDNA文库,基因文库是指整套由基因组DNA片段插入克隆载体获得的分子克隆之总和。应用DNA重组技术，可以将各种生物体全部基因组的遗传信息，贮存在可以长期保存的稳定重组体中，以备需要时应用。好象将文献资料贮存于图书馆一样，所以称其为genomic library。,131,基因文库
46、中应包含多少DNA克隆才能使任意所需要的基因以极高的概率存在于该文库中？其计算公式如下：N=ln(1-p)/ln(1-f)N 基因文库所包含克隆的数目p 任意所需基因存在于基因文库中的概率，要求大于99%f 克隆的DNA片段大小（bp）占基因组大小(bp)的分数,132,现在已构建的基因组文库主要有,BAC(细菌人工染色体)，以细菌作为对象，将DNA片段与质粒重组后转入细菌中繁殖。YAC(酵母人工染色体)，以酵母作为对象。PAC(噬菌体人工染色体), 以噬菌体作为对象。TAC(可转化的细菌人工染色体)MAC(哺乳类人工染色体）,133,cDNA文库,将细胞全部mRNA反转录成cDNA并被克隆的
47、总和称为cDNA文库。真核细胞基因是断裂的，在基因最后产物中表达的编码序列（外显子）被非编码序列（内含子）分隔开，需经RNA转录后加工才使编码序列拼接在一起真核生物基因不能在原核生物中表达，只有将成熟的mRNA反转录成cDNA （complemental DNA）接上原核生物表达控制元件，才能在原核生物中表达真核生物的基因通常只有一小部分进行表达，由于mRNA的不稳定性，对基因表达和有关mRNA通常都通过其cDNA来进行研究RNA病毒的基因组是RNA，也必须将RNA先转录成cDNA，再建立文库,134,为使低丰度的mRNA的cDNA克隆存在的概率大于99%，cDNA文库应含的克隆数的计算公式如
48、下：N=ln(1-p)/ln(1-1/n)N cDNA文库所包含克隆的数目；p 低丰度cDNA存在于基因文库中的概率,要求其大于99%；1/n 每一种低丰度的mRNA占总 mRNA的分数。,135,基因文库和cDNA文库的建立,136,五、聚合酶链式反应（PCR）,PCR原理 1985年，Mullis发明了PCR（ polymerase chain reaction）快速扩增DNA的方法。该法模仿体内DNA的复制过程：变性；退火；延伸扩增的公式为:Y=(1+X)n式中，Y一产量; X-扩增效率; n一循环次数。,137,PCR的应用,用于合成特异探针用于DNA的测序将逆转录与PCR相偶联（RT
49、-PCR）用于基因定位诱变 未知序列的PCR扩增基因组序列的比较研究用于临床诊断,138,六、核酸分子标记技术,限制性片段长度多态性（RFLP, restriction fragment length polymorphism）随机扩增多态DNA（RAPD, random amplified polymorphic DNA）扩增片段长度多态性（AFLP, amplified fragment length polymorphism）简单串联重复序列（SSR，simple sequence repeat）单核苷酸多态性（SNP，simple nucleotide polymorphism）,13
50、9,RFLP （ restriction fragment length polymorphism）,由限制性内切酶把很大的DNA分子降解成许多长短不同的较小片段，其数目和长度反映了限制性内切酶的切点在DNA分子上的分布，它能作为某DNA或含这种DNA生物所特有的“指纹”，不同个体的等位基因之间碱基代换、重排、插入、缺失等都会引起这种“指纹”的多态性。对于复杂的真核基因，要检测限制性片段长度多态性必须借助于放射性同位素(通常用32p)或非放射性物质(如地高辛等)标记的探针,与经限制性内切酶消化的基因组DNA杂交,再通过电泳显示限制性酶切片段的大小来检测不同遗传位点的等位变异(多态性)。,140
