第一专题生物大分子的结构与功能ppt课件.ppt

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1、,生物大分子的结构与功能,第一章,核酸的结构和功能 Structure and Function of Nucleic Acid,目 录,第一节 核酸的种类、分布和化学组成第二节 核酸的分子结构第三节 核酸的理化性质及其应用第四节 核酸的制备、测定及研究技术,核 酸 (nucleic acid),核酸是一类重要的生物大分子，担负着生命信息的储存与传递。核酸是现代生物化学、分子生物学的重要研究领域，是基因工程操作的核心分子。,核酸的发现和研究工作进展,1868年 Fridrich Miescher从脓细胞中提取“核素” 1944年 Avery等人证实DNA是遗传物质1953年 Watson和Cr

2、ick提出DNA双螺旋结构模型1966年 Nirenberg发现遗传密码1975年 Temin和Baltimore发现逆转录酶;Sanger建立DNA测序方法1981年 T.Cech发现了核酶1985年 Mullis发明PCR 技术1990年 美国启动人类基因组计划(HGP) 2019年 中国获准加入人类基因组计划2019年 美、英等国完成人类基因组计划基本框架,第一节 核酸的种类、分布和化学组成,一、核酸的生物学功能二、核酸的种类和分布三、核酸的化学组成,一、核酸的生物学功能,or,and,肺炎球菌转化实验,生物学的中心法则,二、核酸的种类及分布,RNA主要存在于细胞质中，约占90%，少量存

3、在于细胞核。 RNA有三种：信使RNA（mRNA），占总RNA 5%。 核糖体RNA （rRNA），占总RNA 80%。 转移RNA （ tRNA），占总RNA 10-15%。,真核,98%核中（染色体中）,核外,线粒体（mDNA）,叶绿体（ctDNA）,原核,拟核,核外：质粒（plasmid）,病毒：DNA病毒,三、核酸的化学组成,核酸,核苷酸,核苷,磷酸,碱基,戊糖,元素组成： C H O N P,A、G、C、U（RNA)A、G、C、T (DNA),核糖（RNA）脱氧核糖（DNA）,两类核酸的基本化学组成,（一）戊糖,组成核酸的戊糖有两种。DNA所含的糖为D-2-脱氧核糖；RNA所含的糖则

4、为D-核糖。,(二）碱基,1. 嘌呤（Purine）,2. 嘧啶（Pyrimidine）,CH3,稀有碱基,除上述5种基本的碱基外，核酸中还有一些含量甚少的碱基，通常称为稀有碱基。稀有碱基的种类很多，大部分是上述碱基的甲基化产物。,N ,N -二甲基腺嘌呤：m2,6,6,6,A,（三）核苷,核苷 戊糖+碱基 糖与碱基之间的C-N键，称为C-N糖苷键,Adenosine Guanosine Cytidine Uridine,核酸中的各种核苷,几种稀有核苷,6,A,）,（m2,N ,N -二甲基腺嘌呤,6,6,（四）核苷酸,腺嘌呤核苷酸（ AMP） Adenosine monophosphate,

5、脱氧腺嘌呤核苷酸（dAMP） Deoxyadenosine monophosphate,鸟嘌呤核苷酸（GMP）胞嘧啶核苷酸（CMP）尿嘧啶核苷酸（UMP）,脱氧鸟嘌呤核苷酸（dGMP）脱氧胞嘧啶核苷酸（dCMP）脱氧胸腺嘧啶核苷酸（dTMP）,OH,H,腺嘌呤核苷酸（AMP）,鸟嘌呤核苷酸（GMP）,尿嘧啶核苷酸（UMP）,胞嘧啶核苷酸（CMP）,脱氧腺嘌呤核苷酸（dAMP）,脱氧鸟嘌呤核苷酸（dGMP）,脱氧胸腺嘧啶核苷酸（dTMP）,脱氧胞嘧啶核苷酸（dCMP）,（五）细胞内游离核苷酸及其衍生物,多磷酸核苷酸环化核苷酸辅酶类核苷酸,1.多磷酸核苷酸,2.环化核苷酸,cAMP(cGMP)的结

6、构,3.辅酶类核苷酸,Vit B2,FMN,AMP,FAD,第二节 核酸的分子结构,一、DNA的分子结构二、RNA的分子结构,一、DNA的分子结构,（一）DNA 一级结构（二）DNA碱基组成的Chargaff规则（三）DNA的二级结构（四）DNA的三级结构,（一）DNA 一级结构,DNA的一级结构是由数量极其庞大的四种脱氧核苷酸，dAMP,dGMP,dCMP,dTMP通过35-磷酸二酯键连接起来的线形或环形多核苷酸链。 DNA分子中核苷酸的排列顺序叫做DNA的一级结构，简称为碱基序列。 一级结构的走向规定为53。不同的DNA分子具有不同的核苷酸排列顺序，因此携带有不同的遗传信息,3 -5 磷酸

7、二酯键,核酸分子中核苷酸之间的共价键,一级结构表示法：结构式，线条式，字母式,5 pApTpCpGpCpT-OH 3,字母式,线条式,（二）DNA碱基组成的Chargaff规则,Chargaff首先注意到DNA碱基组成的某些规律性，在年总结出DNA碱基组成的规律：1. 同一生物的不同组织的DNA碱基组成相同；2. 同一种生物DNA碱基组成不随生物体的年龄、营养状态或者环境变化而改变； 3. 几乎所有的DNA，无论种属来源如何，其腺嘌呤摩尔含量与胸腺嘧啶摩尔含量相同A =T，鸟嘌呤摩尔含量与胞嘧啶摩尔含量相同G =C，总的嘌呤摩尔含量与总的嘧啶摩尔含量相同AG=CT。4. 不同生物来源的DNA碱

8、基组成不同，表现在AT/GC比值的不同。这些结果后来为DNA的双螺旋结构模型提供了一个有力的佐证。,（三）DNA二级结构,双螺旋结构,1. DNA双螺旋结构的研究背景,碱基组成分析Chargaff 规则：A = TG C,碱基的理化数据分析A-T、G-C以氢键配对较合理,DNA纤维的X-光衍射图谱分析,2. DNA双螺旋结构模型要点 （Watson, Crick, 1953）,（1） DNA分子由两条反向平行的多核苷酸链构成双螺旋结构。两条链围绕同一个“中心轴”形成右手螺旋，螺旋表面有一条大沟和一条小沟。（2）嘌呤碱和嘧啶碱层叠于螺旋内侧，碱基平面与纵轴垂直，碱基之间的堆积距离为0.34nm

9、。磷酸与脱氧核糖在外侧，彼此之间通过磷酸二酯键连接，形成DNA的骨架。糖环平面与中轴平行。,2. DNA双螺旋结构模型要点 （Watson, Crick, 1953）,（3）双螺旋的直径为2nm，顺轴方向每隔0.34nm有一个核苷酸,两个核苷酸之间的夹角为36，因此，沿中心轴每旋转一周有10个核苷酸。（4）一条多核苷酸链上的嘌呤碱基与另一条链上的嘧啶碱基以氢键相连，匹配成对，配对的原则是A= T之间形成二个氢键，G C之间形成三个氢键。因此， DNA的一条链为另一条链的互补链。,碱基的配对,A T,C G,3. DNA双螺旋结构的稳定因素, 氢键 碱基堆集力带负电荷的磷酸基与带正电荷的阳离子形

10、成离子键,4. DNA双螺旋结构的多态性,Z-DNA,B-DNA,A-DNA,三种DNA双螺旋构象比较,A B Z,外型 粗短 适中 细长,螺旋方向 右手 右手 左手,螺旋直径 2.3nm 2.0nm 1.8nm,螺距 2.8nm 3.4nm 4.5nm,碱基夹角 33 36 60,每圈碱基数 11 10 12,碱基对间垂直距离,0.255nm 0.34nm 0.37nm,碱基对倾角 20 0 7,大沟 很窄很深 很宽较深 平坦,小沟 很宽、浅 窄、深 较窄很深,5. 三链 DNA,DNA分子内的三链结构,（四）DNA的三级结构,DNA双螺旋进一步扭曲成三级结构。,1. DNA的超螺旋结构,某

11、些小病毒、细菌的质粒、噬菌体、真核生物线粒体和叶绿体以及某些细菌染色体中的DNA为双链环形，其三级结构为麻花状超螺旋形式。,DNA超螺旋的形成,超螺旋的拓扑学公式：L=T+W,超螺旋状态的定量描述,公式1： L=T+W L连环数，DNA双螺旋中一条链以右手螺旋绕另一条链缠绕的次数。 TDNA分子中的螺旋数 W超螺旋周数或扭曲数,公式2： =（L-L0）/L0 超螺旋度 L0松驰态DNA连环数如上述超螺旋DNA的L=23 L0=25， =-0.08,DNA超螺旋结构整体或局部的拓扑学变化及其调控对于DNA复制和RNA转录过程具有关键作用。,DNA超螺旋结构形成的意义,2. DNA在真核生物细胞核

12、内的组装,真核生物染色体由DNA和蛋白质构成，其基本单位是 核小体(nucleosome)。,核小体的组成 DNA：约200bp 组蛋白：H1 H2A，H2B H3 H4,各2分子,核小体的直径10-11nm，DNA分子在组蛋白核心外面缠绕约1.8圈，有大约160bp。连接核小体的DNA片段约为32-34bp,核小体盘绕及染色质示意图,二、RNA的分子结构,（一）RNA一级结构 和类别（二） tRNA 的分子结构（三） rRNA的分子结构（四）mRNA的分子结构,（一）RNA的类别和一级结构,信使RNA（messenger RNA，mRNA）：在蛋白质合成中起模板作用； 核糖体RNA（ribo

13、soal RNA，rRNA）：与蛋白质结合构成核糖体（ribosome）,核糖体是蛋白质合成的场所； 转移RNA（transfor RNA，tRNA）：在蛋白质合成时起着携带活化氨基酸的作用。,RNA分子中各核苷之间的连接方式（3-5磷酸二酯键）和排列顺序叫做RNA的一级结构,RNA与DNA的差异 DNA RNA糖 脱氧核糖 核糖碱基 AGCT AGCU 不含稀有碱基 含稀有碱基,（二) tRNA 的分子结构,二级结构特征： 单链 三叶草叶形 四臂四环,三级结构 特征： 在二级结构基础上进一步折叠扭曲形成倒L型,tRNA 的二级结构 三叶草形,3,5,氨基酸臂 DHU环 反密码环 额外环 TC

14、环,tRNA的三级结构 倒L形,*,真核生物5S rRNA28S rRNA5.8S rRNA18S rRNA,原核生物5S rRNA23S rRNA16S rRNA,rRNA的种类（根据沉降系数）,（三） rRNA的分子结构,结构特征：单链，螺旋化程度较tRNA低 与蛋白质组成核糖体后方能发挥其功能,5S RNA的二级结构,（四）mRNA的分子结构,内含子(intron),* mRNA成熟过程,外显子(exon),* mRNA结构特点：,1. 大多数真核mRNA的5末端均在转录后加上一个7-甲基鸟苷，同时第一个核苷酸的C2也是甲基化，形成帽子结构：m7GpppNm-。,2. 大多数真核mRNA

15、的3末端有一个多聚腺苷酸(polyA)结构，称为多聚A尾。,帽子结构,帽子结构,帽子结构,OCH3,mRNA由核内向胞质的转移mRNA的稳定性翻译起始的调控,帽子结构和多聚A尾的功能,* mRNA的功能 把DNA所携带的遗传信息，按碱基互补配对原则，抄录并传送至核糖体，用以决定其合成蛋白质的氨基酸排列顺序。,其他小分子RNA,除了上述三种RNA外，细胞的不同部位存在的许多其他种类的小分子RNA，统称为非mRNA小RNA(small non-messenger RNAs, snmRNAs)。,snmRNAs,第三节 核酸的理化性质及其应用,一、核酸的一般性质二、核酸的紫外吸收性质三、核酸的变性、

16、复性和分子杂交,一、核酸的一般性质,1、性状：DNA为白色纤维状固体，RNA为白色粉末。2、粘性：核酸的水溶液粘度很大，DNA分子粘度大于RNA。核酸变性后，粘度下降。,3、溶解性：RNA和DNA都是极性的化合物，两者都微溶于水，不溶于乙醇、乙醚、氯仿等有机溶剂。它们的钠盐易溶于水。 核酸的提取？,4、核酸的酸碱性质 核酸的磷酸基具有酸性，碱基具有碱性，因此，核酸具有两性电离的性质。但核酸中磷酸基的酸性大于碱基的碱性，其等电点偏酸性。DNA的pI约为45，RNA的pI约为2.02.5，在pH78电泳时泳向正极。,二、核酸的紫外吸收性质,1、光吸收： 紫外吸收波段：240290nm 最大吸收峰：

17、260nm2、变性后的光学性质：（1）增色效应： 与天然DNA相比，变性DNA因其双螺旋结构破坏，使碱基充分外露，因此，紫外吸收增加，这种现象叫增色效应。（2）减色效应： 若变性DNA复性形成双螺旋结构后，其紫外吸收降低，这种现象叫减色效应。,DNA的紫外吸收光谱,天然DNA变性DNA核苷酸总吸收值,123,OD260的应用,1. DNA或RNA的定量,RNA浓度（ug/mL）=,OD260,0.022XL,X稀释倍数,DNA浓度（ug/mL）=,0.02XL,OD260,X稀释倍数,式中：OD260为260nm波长处光密度值；L为比色杯的光程，一般为1cm；0.022为每毫升溶液含1微克RN

18、A的光密度； 0.02为每毫升溶液内含1微克DNA钠盐时的光密度。,2.判断核酸样品的纯度,DNA纯品: OD260/OD280 = 1.8RNA纯品: OD260/OD280 = 2.0,三、核酸的变性、复性和分子杂交,（一）变性（二）复性（三）核酸的分子杂交,(一）变性,1、DNA变性的概念：指DNA分子中的双螺旋结构解链为无规则线性结构的现象。2、DNA变性的本质：维持双螺旋稳定性的氢键断裂，碱基间的堆积力遭到破坏，但不涉及到其一级结构的改变。3、导致DNA变性的因素：凡能破坏双螺旋稳定性的因素，如加热、极端的pH、有机试剂甲醇、乙醇、尿素及甲醛等，均可引起核酸分子变性,DNA的变性过程

19、,加热,部分双螺旋解开 无规则线团 链内碱基配对,4、变性后其它理化性质变化：,OD260增高粘度下降比旋度下降浮力密度升高酸碱滴定曲线改变生物活性丧失,Tm：熔解温度,DNA的变性发生在一个很窄的温度范围内，通常把热变性过程中光吸收达到最大吸收一半时的温度称为该DNA的熔点或熔解温度，用Tm表示。 DNA的Tm值一般在70 85之间。,DNA的Tm值与下列的因素有关：,1、 DNA的均一性:均一性愈高的样品，熔解过程的温度范围愈小。2、 G-C的含量： （ G-C）%=（tm-69.3）x2.443、介质离子强度：介质离子强度较低，DNA的tm也低。,（二）复性,DNA复性(renatura

20、tion)：变性DNA在适当条件下，又可使两条彼此分开的链重新缔合成为双螺旋结构，这一现象称为复性。热变性的DNA经缓慢冷却后即可复性，这一过程称为退火(annealing) 。,（三）分子杂交,当两条不同来源的DNA链或DNA链与RNA链之间存在互补顺序时，在复性时可发生碱基互补配对形成局部双螺旋区，称分子杂交 Southern 杂交（Southern bolting）Northern 杂交（Northern bolting）Western 杂交 （Western bolting）,分子杂交的原理示意图,核酸杂交技术是目前研究核酸结构、功能常用手段之一。用来检验核酸的缺失、插入；制备特定的探

21、针（probe）通过杂交技术可进行基因的检测和定位研究。,核酸杂交及其应用示意图,.变性、复性和杂交 粗细线分别代表不同DNA。 A是杂化双链,.突变体的鉴别。B代表天然DNA；C是B的缺失突变体；虚线框内是已缺失的部分；D是显示从天然DNA链鼓出小泡,.粗线代表探针 粗线上的X表示放射性标记,Southern印迹法,DNA分子,限制片段,限制性酶切割,琼脂糖电泳,转移至硝酸纤维素膜上,与放射性标记DNA探针杂交,放射自显影,带有DNA片段的凝胶,凝胶,滤膜,用缓冲液转移DNA,吸附有DNA片段的膜,第四节 核酸的制备、测定及研究技术,一、核酸制备的一般原则 二、核酸的制备三、核酸的测定方法四

22、、核酸的研究技术,一、核酸制备的一般原则,因为遗传信息全部贮存在核酸的一级结构中，故完整的一级结构是保证核酸结构与功能研究的基础。,（一）核酸制备时应遵循两个原则：,保证核酸一级结构的完整性；排除其它分子的污染。,（二）核酸的纯度要求, 核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子； 其它生物大分子如蛋白质、多糖和脂类分子的污染应降低到最低程度； 排除其它核酸分子的污染，如提取DNA分子时，应去除RNA，反之亦然。,（三）核酸制备的注意事项, 尽量简化操作步骤，缩短提取过程，以减少各种有害因素对核酸的破坏； 减少化学物质对核酸的降解(避免过酸、过碱对核酸链中磷酸二酯键的破坏)

23、 ； 防止核酸的生物降解。细胞内或外来的各种核酸酶水解核酸链中的磷酸二酯键，直接破坏核酸的一级结构。其中DNA酶需要二价阳离子Mg2+，Ca2+的激活，因此使用金属离子螯合剂，如EDTA或柠檬酸盐等基本上可以抑制DNA酶的活性。而RNA酶不但分布广泛、极易污染样品，而且耐高温、耐酸碱、不易失活，所以生物降解是RNA提取过程中的主要危害因素；, 减少物理因素对核酸的降解，物理降解因素主要是机械剪切力，其次是高温。,机械剪切力包括强力高速的溶液振荡、搅拌，细胞突然置于低渗液中；DNA样品的反复冻融等。这些操作细节在实验操作中应加倍注意。机械剪切作用的主要危害对象是大分子量的线性DNA分子，如真核细

24、胞的染色体DNA等。高温，如长时间煮沸，除水沸腾带来的剪切力外，高温本身对核酸分子中的某些化合键也有破坏作用。核酸提取过程中常规操作温度为04以降低核酸酶的活性从而减少对核酸的生物降解。,I.材料准备II.破碎细胞或包膜内容物释放III.核酸分离、纯化IV.沉淀或吸附核酸，并去除杂质V.核酸溶解在适量缓冲液或水中,破碎细胞,提取,纯化,二、核酸的制备,(一）核酸制备的一般方法和原理,1、核酸酶的抑制和抑制剂 降低温度，改变pH及盐的浓度，都利于对核酸酶活性的抑制，但均不如利用核酸酶抑制剂更有利，当然，几个条件并用更好。 对于DNA，抑制DNase活力很容易，但防止机械张力拉断则更重要。 对于R

25、NA，因分子较小，不易被机械张力拉断，但抑制RNase活力较难，故在RNA提取中设法抑制RNase更重要。,DNase抑制 加入少量金属离子螯合剂，如0.01 mol/L EDTA或柠檬酸钠，DNase基本可以全部失活。 去垢剂、蛋白变性剂及DNase抑制剂也可使DNase失活。,RNase抑制 操作要带手套 所有器皿要严格消毒 试剂处理 低温操作 在分离过程中要加入一定的RNase抑制剂,2、核酸制备中常用的去垢剂 核酸本身带负电荷，结合带正电荷的蛋白质。用于核酸提取的去垢剂，一般都是阴离子去垢剂，去垢剂的作用： 1溶解膜蛋白及脂肪，使细胞膜破裂； 2溶解核糖体上面的蛋白质，使其解聚，将核酸

26、释放出来； 3对RNase、DNase有一定的抑制作用。如：SDS、脱氧胆酸钠、4-氨基水杨酸钠、萘-1.5-二磺酸钠、 三异丙基萘磺酸钠,3、核酸制备中常用的蛋白质变性剂,蛋白质变性剂的作用：（1）使蛋白质变性、沉淀，从核酸提取液中分离除去，以防造成蛋白污染。（2）使蛋白质变性，故可使核糖体解聚释放出核酸。（3）某些蛋白质变性剂也有抑制RNase活性和破裂细胞的作用。如：苯酚、氯仿、盐酸胍、DEPC,4、核酸提取的一般过程,（1）破碎细胞 微生物：溶菌酶、SDS裂解。 高等植物：捣碎器破碎、液氮研磨。 动物：液氮处理后用匀浆器破碎。 细胞器DNA：首先纯化细胞器。 以上处理时均要同时加入核酸

27、酶抑制剂,（2）抽提核酸除去杂质,a首先使脱氧核糖核蛋白、核糖体、病毒的核蛋白与其它成分分离； b使核酸与蛋白质分离； c除去脂类； d多糖的除去。,（3）核酸的纯化,根据所需核酸的性质和特点除去其它核酸污染,并除去提取过程中的系列试剂(盐、有机溶剂等）杂质，最后得到均一的核酸样品。,（4）核酸质量的鉴定,DNA纯品: OD260/OD280 = 1.8RNA纯品: OD260/OD280 = 2.0,a.应用OD260：,b.琼脂糖凝胶电泳,（5）核酸样品的保存,核酸保存的主要条件是温度和介质 温度： -70是长期保存的良好温度，为一次性保存。 -20保存。 保存介质： TE缓冲溶液(最常用

28、) 10mmol/L Tris-Cl pH8.0 1mmol/L EDTA pH8.0,（二）注意事项 材料准备,最好使用新鲜材料，低温保存的样品材料不要反复冻融组培细胞培养时间不能过长，否则会造成DNA降解含病毒的液体材料DNA含量较少，提取前先富集,（二）注意事项 细胞裂解,材料应适量，过多会影响裂解，导致DNA量少，纯度低针对不同材料，选择适当的裂解预处理方式：植物材料液氮研磨动物组织匀浆或液氮研磨组培细胞蛋白酶K细菌溶菌酶破壁酵母破壁酶或玻璃珠,（二）注意事项 核酸分离、纯化,采用吸附材料吸附的方式分离DNA时，应提供相应的缓冲体系采用有机（酚/氯仿）抽提时应充分混匀，但动作要轻柔离心

29、分离两相时，应保证一定的转速和时间针对不同材料的特点，在提取过程中辅以相应的去杂质的方法,（二）注意事项 核酸沉淀、溶解,当沉淀时间有限时，用预冷的乙醇或异丙醇沉淀，沉淀会更充分沉淀时加入1/10体积的NaAc（pH5.2，3M），有利于充分沉淀沉淀后应用70的乙醇洗涤，以除去盐离子等晾干DNA，让乙醇充分挥发（不要过分干燥）若长期储存建议使用TE缓冲液溶解TE中的EDTA能螯和Mg2+或Mn2+离子，抑制DNasepH值为8.0，可防止DNA发生酸解,（三）DNA提取常见问题,问题一：DNA样品不纯，抑制后续酶切和PCR反应。,原因,DNA中含有蛋白、多糖、多酚类杂质DNA在溶解前，有酒精残

30、留，酒精抑制后续酶解反应DNA中残留有金属离子,对策,重新纯化DNA，去除蛋白、多糖、多酚等杂质重新沉淀DNA，让酒精充分挥发增加70乙醇洗涤的次数（2-3次）,（三）DNA提取常见问题,问题二：DNA降解,原因,材料不新鲜或反复冻融未很好抑制内源核酸酶的活性提取过程操作过于剧烈，DNA被机械打断外源核酸酶污染反复冻融,对策,尽量取新鲜材料，低温保存材料避免反复冻融液氮研磨或匀浆组织后，应在解冻前加入裂解缓冲液在提取内源核酸酶含量丰富的材料的DNA时，可增加裂解液中螯合剂含量细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔所有试剂用无菌水配制，耗材经高温灭菌将DNA分装保存于缓冲液中，避免反复冻融,（三）DNA

31、提取常见问题,问题三：DNA提取量少,原因,实验材料不佳或量少破壁或裂解不充分沉淀不完全洗涤时DNA丢失,对策,尽量选用新鲜（幼嫩）的材料动植物要匀浆研磨充分；细菌、酵母裂解前先用生物酶或机械方式破壁高温裂解时，时间适当延长（对于动物细胞、细菌可增加PK的用量）低温沉淀，延长沉淀时间洗涤时，最好用枪头将洗涤液吸出，勿倾倒,三、核酸的测定方法,RNA浓度（ug/mL）=,OD260,0.022XL,X稀释倍数,DNA浓度（ug/mL）=,0.02XL,OD260,X稀释倍数,式中：OD260为260nm波长处光密度值；L为比色杯的光程，一般为1cm；0.022为每毫升溶液含1微克RNA的光密度；

32、 0.02为每毫升溶液内含1微克DNA钠盐时的光密度。,1、紫外吸收法,2、定糖法,RNA的测定：RNA分子中所含的核糖经浓硫酸或浓盐酸作用脱水生成糠醛，糠醛可与3，5-二羟甲苯（苔黑酚或地衣酚）反应生成绿色化合物，该化合物可在670-680nm波长下进行比色测定。 DNA的测定：DNA分子中的脱氧核糖在冰醋酸或浓硫酸存在下可与二苯胺反应生成兰色化合物，该化合物可在595-620nm波长下进行比色测定。,3、定磷法,RNA和DNA中都含有磷酸，可以进行磷的测定。纯的核酸中含磷量在9.5%左右，因此，测出核酸中的磷含量就可计算核酸的含量。测定时先将核酸用强酸消化成无机磷酸，后者与定磷试剂中的钼酸

33、反应生成磷钼酸，在经过还原作用而生成蓝色的复合物，最后在650-660nm进行比色测定。,四核酸研究技术,（一）核酸的沉降特性,溶液中的核酸在引力场中可以下沉。在超速离心机造成的强大的离心力场中，核酸分子下沉的速度大大加快。核酸的超速离心用于：,1、测定核酸的浮力密度；2、测定溶液中核酸的构象，核酸经染料氯化铯密度梯度离心以后，在离心管里，沉降的速度由大到小依次为：超螺旋DNA、闭环质粒DNA、开环及线型DNA，若样品中含有蛋白质，蛋白质沉降速度最小。3、核酸的制备。,（二）核酸的凝胶电泳,凝胶电泳是当前核酸研究中最常用的方法，有琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳。,水平板电泳,（三）核酸的序

34、列测定,DNA测序的基本战略：,设法产生带标记的不同长度的成套DNA片段，各带有标记的片段起点相同、终点不同。通过PAGE电泳，能够将相差一个核苷酸的DNA片段分开，放射自显影后，根据长短排列，根据特定末端碱基的DNA片段就可读出待测DNA的碱基序列。,1.Sanger双脱氧链终止法(酶法测序）,DNA的合成总是从5端向3端进行的。DNA的合成需要模板以及相应的引物链。DNA的合成过程中，在合成的DNA链的3末端，依据碱基配对的原则，通过生成新的3,5磷酸二酯键，产生短的DNA链。具体测序工作中，平行进行四组反应，每组反应均使用相同的模板，相同的引物以及四种脱氧核苷酸；并在四组反应中各加入适量

35、的四种之一的双脱氧核苷酸，使其随机地接入DNA链中，使链合成终止，产生相应的四组具有特定长度的、不同长短的DNA链。这四组DNA链再经过聚丙烯酸胺凝胶电泳按链的长短分离开，经过放射自显影显示区带，就可以直接读出被测DNA的核苷酸序列,如下图所示：,引物,5,3,酶反应,dATPdCTPdGTPdTTP,+ddATP,dATPdCTPdGTPdTTP,+ddCTP,dATPdCTPdGTPdTTP,+ddGTP,dATPdCTPdGTPdTTP,+ddTTP,GGCCA,GGCCATCGTTGA,GGC,GGCC,GGCCATC,GGCCATCG,GGCCATCGTTG,GGCCAT,GGCCA

36、TCGT,GGCCATCGTT,A C G T,电泳方向,GGCCATCGTTGA,GGCCATCGTTG,GGCCATCGTT,GGCCATCGT,GGCCATCG,GGCCATC,GGCCAT,GGCCA,GGCC,GGC,酶法序列分析的原理,DNA的测序仪示意图,computer analysis,成象透镜,聚焦透镜,高灵敏度相机,旋光镜/棱镜组件,样品槽,凝胶中DNA移动方向,输入光学系统,激光器,2.化学法（Maxam和Gilbert） ,这一方法的基本步骤为:,(1)先将DNA的末端之一进行标记(通常为放射性同位素32P；(2)在多组互相独立的化学反应中分别进行特定碱基的化学修饰；

37、(3)在修饰碱基位置化学法断开DNA链；(4)聚丙烯酰胺凝胶电泳将DNA链按长短分开；(5)根据放射自显影显示区带，直接读出DNA的核苷酸序列,如下图所示：,DNA的化学测序示意图,反应试剂G反应：硫酸二甲酯G+A反应：甲酸T+C反应：肼C反应：NaCl+肼,1、G反应：用硫酸二甲酯（DMS）使鸟嘌呤上的N7原子甲基化。甲基化的鸟嘌呤与脱氧戊糖之间的糖苷键在中性环境中加热而断裂，鸟嘌呤碱基脱落，多核苷酸骨架在鸟嘌呤处发生断裂。2、G+A反应：用甲酸使A和G嘌呤环上的N原子质子化，从而使其糖苷键变得不稳定，再用哌啶使嘌呤脱落。3、T+C反应：用肼使T和C的嘧啶环断裂，再用哌啶除去碱基。4、C反应

38、：当有NaCl存在时，只有C与肼发生反应，T不发生反应。断裂的C可用哌啶除去。,3、测序技术进展同位素标记到荧光标记,平板电泳到毛细管电泳,同位素标记平板电泳,单色荧光标记平板电泳,多色荧光标记毛细管电泳,A,C,G,T,测序图谱,T A TTG CAT TG TC TGCATTG T CT,PCR是模拟体内DNA复制条件，应用DNA聚合酶反应，特异性扩增某一DNA片段的技术。体外程序化的DNA合成技术。,（四）聚合酶链反应（polymerase chain reaction,PCR）,5,Primer 1,5,Primer 2,5,5,Template DNA,1、基本工作原理,2、PCR反

39、应体系,引物（primer）酶 （Taq DNA polymerase） dNTP （dATP,dGTP,dCTP,dTTP） 模板 （template） Mg2+ （magnesium）,PCR影响因素,引物的长度、碱基组成和浓度、模板的浓度、镁离子的浓度、退火温度、延伸时间及循环周期数。, 引物设计,对整个PCR扩增体系，引物的设计占有十分重要的地位。PCR效率和特异性取决于两个方面。一是引物与模板的特异结合，二是多聚酶对引物的有效延伸。引物设计的总原则就是提高扩增的效率和特异性。,引物设计的一般原则：,引物长度以15-25为宜。引物过短时会使特异性降低，过长时则成本增加，且也会降低特异性

40、。引物碱基尽可能随机分布，避免出现嘌呤、嘧啶堆积现象。引物G+C含量宜在45%-55%。引物内部不应形成二级结构，两个引物之间尤其在3末端不应有互补链存在。,引物的碱基顺序不应与非扩增区域有同源性。要求在引物设计时采用计算机进行辅助检索分析。引物3末端碱基：要求3末端与模板DNA一定要配对。3末端的末位碱基最好选T、C、G，而不选A。引物5末端碱基：没有严格的限制，只要与模板DNA结合的引物长度足够，其5末端碱基可以不与模板DNA匹配而呈游离状态。,引物浓度,一般为10-100pmol/L，引物浓度偏高会引起错配和非特异性产物扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机率，这两者还由于竞争使用酶，dN

41、TP和引物，这一切均会使DNA合成产率下降。, 模板的浓度,靶序列：10 -10 拷贝基因组DNA：0.2-2g质粒DNA：20ng,2,5, 镁离子浓度,范围1.5-8mmol/L。一般为1.5mmol/L。镁离子过量能增加非特异性扩增并影响产率。当样品中含有EDTA时适当增加镁离子浓度, 退火温度,由引物的碱基组成及长度决定，经验公式为：4（G+C）+2（A+T）-5在Tm允许的范围内，选择较高的退火温度可大大减少引物和模板之间的非特异结合，提高PCR反应的特异性。, 延伸时间,扩增片段小于1000bp时延伸时间1min。扩增片段大于1000bp时可适当延长延伸时间。但太长的延伸时间易引起

42、非特异性扩增。, 循环周期数,由模板DNA浓度决定，一般为25-30个周期为宜。模板拷贝数极低时，可扩增40个周期，但循环次数增加，非特异性扩增增加。,3、PCR的基本反应步骤,变性94C,延伸72C,退火Tm-5C,PCR反应条件的选择,变性温度：一般情况下，选择94 30s可使各种复杂的DNA分子完全变性。过高温度或高温持续时间过长，可对TaqDNA聚合酶和dNTP造成损伤。退火温度：Tm-5。退火时间设置为30s，足以使引物和模板之间完全结合。,PCR的延伸温度：70-75 之间，此时TaqDNA聚合酶具有最高活性。当引物在16bp以下时，过高的延伸温度不利于引物和模板结合。PCR的延伸

43、时间：可根据待扩增片段长度而定。PCR的循环数：主要取决于模板DNA的浓度。理论上说20-25次循环后，PCR产物的积累即可达最大值，实际操作中由于每步反应的产率不可能达到100%，因此不管模板浓度是多少，20-30次是比较合理的循环次数。循环反应的次数越多非特异性产物的量也会增加。,PCR产物积累规律：在反应初期，目的片段的增加呈指数形式。随着目的DNA产物逐渐积累，而进入相对稳定状态，即平台期。而用TaqDNA聚合酶则可进行25次以上PCR循环，积累410 目的基因的拷贝。,8,经过30-35循环，可使长2kb的DNA从原来的1pg扩增到0.5-1g。,（一）目的基因的克隆（二）基因的体外

44、突变（三）基因组DNA分析（四）遗传物质的鉴定（五）遗传病的诊断,4、PCR的主要用途,PCR相关技术：,增效PCR（booster PCR） 当扩增少于1000拷贝的模板DNA时会遇到两个问题：一是形成引物二聚体，一是非特异扩增，消耗了引物和酶，而特异扩增片段产量降低。对于这种情况，可设置二步PCR，先用较低浓度的引物进行初级PCR，此时由于引物少，形成引物二聚体的可能减少，但它并不影响靶序列的扩增，只是由于引物少产量不高。约经1520个循环后补充产物量，以初级PCR产物为模板进行扩增，靶序列的产量将相应增加。,巢式PCR（nest PCR）,此时也是进行二步PCR，与上面不同的是，第二级P

45、CR需另行设置反应体系，并应用另外的PCR引物，此时引物的位置位于初级PCR引物的内侧，用初级PCR产物做模板，进行第二步PCR，这样只有初级PCR中特异的扩增片段才能被二级引物扩增。除了达到增效PCR同样的目的外，还提高了最终产物的特异性。,在同一PCR体系中加入数对PCR引物，如果这些引物的退火温度相近，并且所覆盖的区域不重叠，这样的反应体系可同时扩增多个DNA片段。多重PCR常用来检测同一基因的多个外显子的缺失.,多重PCR,RT-PCR,RT-PCR是以mRNA为模板，经逆转录酶作用合成cDNA。使微量的mRNA（pg水平）迅速扩增（达ngug水平），大大提高mRNA的检出灵敏度。应用于基因表达与调控的研究。,RT-PCR,RT-PCR,cDNA,