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1、血站核酸检测 甘肃省红十字血液中心 王玮蓉,血站核酸检测的意义,核酸检测（NAT）可以 有效地缩短病毒特异抗原和抗体免疫测定的“窗口期”，从而减少输血风险，提高输血安全。,乙型肝炎病毒（HBV）感染检测中，NAT除可缩短HBV感染检测的窗口期外，还可以减少HBV急性感染恢复期、慢性隐匿性HBV感染以及变异病毒株感染的漏检。丙型肝炎病毒（HCV）感染检测中，可将HCV感染检测的窗口期缩短，减少免疫静默感染的漏检。人类免疫缺陷病毒（HIV）感染检测中，可将HIV感染检测的窗口期缩短。,检测窗口期 Window Period,核酸研究的历史 1869 米舍尔（Friedrich Miescher）从
2、脓球分离出细胞核，不受蛋白酶分解，磷含量高，命名为“核素”(nuclein)。1944 美国微生物学家埃弗里（O.T.Avery）等的肺炎球菌转化实验。1953 沃森和克里克（WATSON，CRICK）-DNA双螺旋Francis Crick,核酸研究的历史 1960年代中期桑格(Sanger)的DNA测序法 1972 伯格(Paul Berg)重组DNA技术 引起人肿瘤的猴病毒基因与噬菌体lambda的重组 1973 博耶（Herbert Boyer）和科恩（Stanley Cohen）-使用重组DNA技术首次得到了重组DNA微生物(基因工程技术)1983 穆利斯（Kary Mullis)P
3、CR技术,核酸的种类,DEOXYRIBONUCLEICACID（DNA）RIBONUCLEIC ACID（RNA）ribosome RNA(rRNA)transfer RNA(tRNA)messenger RNA(mRNA),核酸的分子组成,元素组成 C H O N P（恒定，910%）基本结构单位核苷酸 磷酸 核苷（戊糖、碱基）,核酸的理化性质,核酸分子具有强烈的紫外吸收DNA变性是双链解离为单链的过程 DNA的增色效应 Tm值变性的核酸可以复性或形成杂交双链 复性 退火,核酸分子复性和杂交示意图,磁珠提取的原理：,第一步：细胞的裂解：破碎细胞，并向溶液中加入磁珠第二步：结合核酸：pH较低，
4、在高盐环境下，硅胶磁珠带正电荷，选择性的与 优化试剂中的核酸结合第三步：洗涤：用洗涤液将非核酸成分冲洗分离（为清洗干净该步骤可以重复多次）第四步：核酸的洗脱：pH升高，在低盐环境下，核酸被洗脱下来,核酸检测基本原理,核酸检测：一系列直接检测病原体核酸的技术的总称，对靶核酸直接扩增或对其附带的信号扩增，使看不见的极微量的核酸变成直观的光电或可视信号。,NAT检测技术方法,PCR扩增技术转录介导的扩增方法（TMA、NASBA）其它NAT技术（bDNA、LAMP、LCR、SDA等）,PCR 原理,DNA,DNA,TMA的原理,Transcription-Mediated Amplification
5、转录介导的扩增技术模拟DNA 转录成mRNA 的自然过程DNA模板在反应中作为中介利用2个引物和2种酶(RNA聚合酶和逆转录酶）RNA聚合酶与DNA 模板的启动子序列结合等温扩增（41.5）,转录,翻译,逆转录,TMA的原理,特异性靶标捕获特异性捕获探针与病毒核酸分子及内标物杂交结合，并将其固定在磁珠表面。对体系进行重复的洗涤，去除血液样品中除病毒核酸外的其他成分。,转录介导的扩增借助逆转录酶和RNA多聚酶的共同作用，在等温条件下，经过一小时的扩增得到约10亿个目标产物片断。,双动力学化学发光检测 试剂消除未结合的检测探针，双动力学化学发光检测，分别检测内标与病毒分子信号。,理想的核酸扩增实验
6、室设计A,理想的核酸扩增实验室设计B,核酸扩增检测实验室设计的一般原则,各区独立注意风向因地制宜方便工作,关于“区域”合并,如使用扩增和产物分析同时完成的实时荧光PCR仪进行核酸扩增检测，扩增区和产物分析区可以合并。如使用核酸提取、扩增及产物分析等均在一台仪器上完成的全自动核酸检测分析仪，标本制备区、扩增区和产物分析区可合并。,符合基本要求的核酸扩增检测实验室的条件,（1）试剂准备区、标本制备区和扩增及产物分析区等三个或四个区域在物理空间上，必须是完全相互独立的，各区域无论是在空间还是在使用中，应始终处于完全的分隔状态，不能有空气的直接相通。（2）各区的可移动的仪器设备及各种物品包括实验记录本
7、、记号笔、试管架及清洁用具等必须专用。（3）应在标本制备区、扩增及产物分析区等相对有可能出现“污染物”的区域安装排风扇或其它排风和有效的装置，以使空气按试剂准备区标本制备区扩增（及产物分析）区方向流动。,核酸扩增实验室的工作流程,试剂准备区 标本制备区 扩增区及扩增产物分析区,试剂贮存准备区,核酸扩增实验室中最为“洁净”的区域，不应有任何核酸的存在，包括试剂中所带的标准品和阳性对照。所有实验用洁净物品如离心管、吸头等的存放和准备处。商品试剂盒自制试剂：一次较大量配制，然后分装成小瓶保存，每次检测时，取出一小瓶使用，未用完的即弃掉，不再使用。仪器设备主要有加样器、天平、离心机和冰箱等，最好配备超
8、净工作台。,标本制备区,仪器设备主要有混样设备、核酸提取仪、生物安全柜、加样器、高速台式（冷冻）离心机、加热模块或水浴箱、冰箱等。生物安全柜不应放在实验室门口等易受人员走动影响的地方，也不应直对分体式空调。主要是用于血液样本的混样、核酸样本的提取。加样器吸头必须带滤芯。使用加热模块时，如在模块孔中填入二氧化硅细砂，然后将标本管置于细砂中温育，可得到较为一致的温育温度。,扩增及产物分析区,扩增反应体系的配制和提取核酸的加入，可在标本制备区也可在本区内进行，关键是要防止产物的污染。如果空间允许的话，也可在一个独立的区域内进行。加样时，先加提取的核酸模板样本，每加完一个即盖好盖子，然后加阳性质控核酸
9、模板，再就是标本制备阴性质控和仅含按样本一样稀释的主反应混合液的扩增阴性质控，这样做的目的是，最大可能地测出以前扩增产物的交叉污染。,扩增及产物分析区,热循环仪的电源应专用，并配备一个不间断电源（UPS）或稳压电源。每次扩增后，可使用可移动紫外灯对扩增热循环仪进行照射。扩增仪应定期进行校准。,工作流程,关注采集、保存、运输的关键点,留样方式、采血管采血后什么时间离心采血后保存温度、时间离心后保存温度、时间（运输）检测前的保存温度、时间长期保存的样本,第一步：标本的采集-采血管,无菌真空采血管一、血清管普通血清管带分离胶的血清管二、抗凝管EDTA 2K或3K抗凝管EDTA 2K抗凝间分离胶（PP
10、T)枸橼酸钠抗凝管,第一步：标本的采集-留样方式,最佳方式：旁袋1管 5ml用于核酸检测 2管 5ml用于酶免疫测定等 3管用于长期保存留样 旁路采样1管 5ml用于核酸检测 2管 5ml用于酶免疫测定等 3管用于长期保存留样 小辫留样(不可取)1管 5ml用于核酸检测 2管 5ml用于酶免疫测定等,第二步：标本的采集-离心,离心条件 800-1600g 20min离心时间 4小时以内 以免RNA的降解,第三步：标本的运送,应采用不易破碎的容器装载标本温度2-8 C符合生物安全标准,第四步：标本的接收保存,确认标本数量 运输状态 标本状态：溶血、脂血保存：用于检测的样本管：检测前保存 4小时内
11、离心，离心后2天内进行检测的可存放2-8 C。用于留样备查的样本：3个月以内存放于-20 C以下，3个月以上置于-70 C以下。,样本汇集,在Star上进行准备工作：将采血管开盖后装载到专用32孔样品架上。采血管上条形码一律面向条码扫描器，以方便扫描条码。按照要求，将TIP头、PCR板、24深孔板、洗脱管、磁套、废弃管放置于平台相应位置。,样本汇集,样本汇集,样本汇集,核酸提取,同样在Star核酸提取仪上进行，紧跟Pooling之后，利用自动移液配置裂解液、结合液、洗液、洗脱液等，利用磁性分离功能自动完成核酸样本的裂解、提取、纯化、PCR试剂配制、PCR上样等实验操作。,核酸扩增,结果确认,阴
12、性反应：进入合格血液的放行程序。阳性反应：单检分项目检测呈阳性反应单检混合项目检测呈阳性反应混样分项目检测呈阳性反应混样混合项目检测呈阳性反应,混样分项目检测呈阳性反应,按照试剂说明书进行双孔拆分检测,检出阳性标本,阳性反应标本,阴性反应标本,进入血液的隔离程序，填写相关报表，将标本及血液筛查检测报告送卫生部临床检验中心,进入合格血液的放行程序,全部标本为阴性反应,进入合格血液的放行程序，实验室需查找原因并完成分析报告,质量控制,室内质量控制室间质量评价,辽宁省血液中心,实验室工作调整工作模式:早8晚4标本接收-采血当天 EIA检测-采集后第2天,当天出最终结论报告.核酸检测:全血EIA(合格
13、)NAT(第3天)血小板:EIA与NAT平行检测(第2天)采用依据:快筛、阳性率低确保报告时限 血小板30小时 全血54小时7+1检测模式,标本质量的控制,采血管选择采样方式 旁袋采样（理想）血袋导管采样(被稀释的可能、规定顺序-风险降到最低)标本正确标识 措施：动作连续不能中断 清场 计算机控制（PDA实物核查、及时传输采集信息）离心时间 4小时内,计算机控制保证标本、血液同源,标本采集人员采用PDA 对血袋、标本管等实物进行核查,离心处理,一、标本采集后离心,离心处理,二、标本接收后实验室再离心,江苏省血液中心,核酸检测实验室的设置应关注的细节各实验区可以移动的物品最好用不同颜色进行标记。
14、以防各区混用。样品制备室最好多配备一台4样品冰箱，用于混样后样品的临时保存；阴阳性对照试剂盒的保存。样品制备室最好配备开盖机，用于真空采血管的去帽。在样品制备室，实验耗材、试剂准备区域和样品处理区域最好分开。,核酸检测实验室的设置应关注的细节,各区还需配备：无粉手套，专用工作服，一次性鞋套、口罩，一次性吸水纸，纱布块。55.5g/100ml的次氯酸钠溶液，的乙醇溶液等。在样本制备区，生物安全柜不应放在实验室门口等易受人员走动影响的地方，也不应直对分体式空调。混样仪的加样吸头必须带滤芯。样品制备区和核酸检测区的仪器还应配备电源。,核酸检测实验室的设置江苏省血液中心核酸检测实验室简介,实验分区：分
15、4个室(区)：试剂准备室(区)，为蓝色标记；标本制备室(区)，为绿色标记；核酸扩增检测室(区)，为黄色标记；全自动核酸检测室(区)，为灰色标记。采用的检测系统：科华和罗氏两套检测系统,两者共用试剂准备室(区)和标本制备室(区)，核酸扩增检测分别在各自的扩增检测区。,核酸检测样品的质量保证应注意的细节,首先要制定样品采集手册，并对采血人员进行全员培训。采血管的选择：最好选择EDTA 2K或3K抗凝带分离胶的抗凝管。注意样品采集后的充分混匀，一般颠倒次以上。样品离心：应采用大容量低温离心机，离心要充分，离心条件最好g、分钟。样品的开盖：应在离心后，放冰箱静置min后，再开盖。应在生物安全柜中进行。混样至拆分检测其间,将样品放冰箱临时保存。,核酸检测样品的质量保证,标本的采集:采用无DNA酶、无RNA酶、带分离胶、EDTA-K2抗凝、无菌真空采血管(BD PPTTM血浆制备管）。为保证标本采集后能在4小时左右离心(1)对市内采血点采集的标本由专人用低温运输箱冷链运送，每3个小时运送一次，集中运送到实验室后，由实验室人员立即离心处理。(2)较远的采血点，配备水平离心机，实验室人员对采血人员进行培训后，由采血人员进行离心处理。制定核酸检测标本采集手册，并对血液采集人员进行全员培训，以确保标本采集质量。,仪器的维护和保养,谢谢！,
