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1、第六章 质 粒 (plasmid),质粒：是指存在于细菌、真菌等微生物细胞中、独立于染 色体外、能进行自我复制的遗传因子。,a、可以整合到染色体上，又可以游离于染色体外（附加体）b、质粒通常是共价、闭合、环状双链DNA(covalent closed circular DNA，简称cccDNA)，c、分子大小范围从l kb左右到1000 kb。自20世纪80年代中期以来，在链霉菌、酵母、丝状真菌等微生物中都发现了线状DNA质粒，甚至还有RNA质粒。,质粒对宿主细胞是非必需的，但在某些条件下，质粒能赋予宿主细胞以特殊的机能，从而使宿主得到生长的优势。如抗药性质粒和降解性质粒就能使宿主细胞在有相应
2、药物或化学毒物的环境中生存。质粒也像染色体一样携带编码多种遗传性状的基因，并授予宿主细胞一定的遗传特性，许多与医学、农业、工业和环境密切相关的重要细菌的特殊特征便是由质粒编码的，如植物结瘤、固氮、对有机物的代谢等。,在基因工程和分子生物学的发展过程中，质粒也起着非常重要的作用。以质粒为载体进行的基因克隆技术，在原核生物和真核生物中表达外源蛋白的方法和技术已在工、农、医各个领域中得到广泛应用。因此，对质粒的研究无论在理论上或应用上均具有十分重要的意义，是现代生物学研究中的重要课题之一。,第一节 质粒的发现和命名,大肠杆菌的F因子是第一个被发现(1946年)的细菌质粒，它的发现对细菌遗传学的发展产
3、生了深远的影响。日本学者(1957年)报道了志贺菌(Shigella)中质粒介导抗生素抗性的转移现象。在以后的20多年中，陆续发现各种细菌携带质粒，且它们的表型特征已远远超过了致育性和药物抗性的范围。70年代末，随着遗传工程的崛起，质粒作为载体己被广泛应用在遗传工程和分子生物学的研究中。对很多不同微生物中的质粒进行了基因克隆和生物学功能分析，使质粒的生物学跨入了空前繁荣的研究时期。,一、质粒的发现,二、质粒的命名原则,质粒可以依据其表型效应、大小、复制特性、转移性或亲和性差异划分为不同的类型。最初发现的质粒均由研究者根据表型、大小等特征自行命名，如F因子(fertility factor，致育
4、因子)、R质粒(resistance factor，抗性质粒)和Col质粒(colicin，大肠杆菌毒素质粒)等。随着研究工作的深入和发展，愈来愈多的含有质粒的微生物新类群和新质粒被发现，由于缺乏统一的命名规则而导致文献中质粒名称的混乱。直至1976年Novick等才提出一个可为质粒研究者普遍接受和遵循的命名原则。,其规则是：质粒的名称一般由三个英文字母及编号组成，第一个字母一律用小写p表示，后两个字母应大写，可以采用发现者人名、实验室名称、表型性状或其他特征的英文缩写。编号为阿拉伯数字，用于区分属于同一类型的不同质粒，如pUC18和pUC19等。,第二节 质粒的遗传特征,一、 质粒的大小和拷
5、贝数,质粒的大小：以分子质量MD或碱基对数kb表示，1MD的双链DNA=1.65kb。质粒的大小一般在1-200kb，最大的可达1400kb(如苜蓿根瘤菌质粒pRm141a)。质粒的拷贝数是指同一质粒在每个细胞中的数量，不同的质粒在同一细胞中的拷贝数有差异。质粒拷贝数是确定某种质粒特性的一个重要参数，从中也可获得其复制本质的基本信息。一般而言，质粒的拷贝数与其分子质量成反比关系，分子质量大的拷贝数低，分子质量小的拷贝数高。,质粒可根据其拷贝数分为严谨型质粒（Stringent plasmid）和松弛型质粒（Relaxed plasmid）。 质粒在细胞内复制时受到控制而与染色体复制同步进行，被
6、称为严谨型质粒。其拷贝数也低，通常只有1-3个拷贝。 如F质粒，每个细胞中只有1-2个拷贝，它们的复制受到严格控制，属于严谨型质粒或低拷贝质粒。,另一类质粒的复制与染色体复制不同步，称为松驰型质粒。通常每个细胞含有10-100个拷贝，属于高拷贝质粒。 分子量小的CoLEl质粒，每个细胞中有10-100个拷贝，它们的复制不受到严格控制，称为松弛型质粒或高拷贝质粒。 含有松弛型质粒的菌株在含有氯霉素的培养液中细胞分裂受到抑制，染色体DNA也停止了复制，但所含的ColEl质粒可持续复制1015小时，直到每一个细胞中含有1 0003 000个质粒。基因工程研究中所用的载体质粒大多数是这一类型的质粒。
7、控制拷贝数的基因存在质粒上，同时也是宿主和质粒相互作用的结果。,质粒大小和类型,二、 质粒的复制,复制子(replicon)是一个复制单位，细菌染色体是一个复制子，每一个质粒也是一个复制子。 复制起点是复制子起始复制的部位，作为一个复制子，至少需要有一个复制起点，即ori位点。大肠杆菌染色体的复制起点称为oriC，质粒的复制起点叫做oriV。,几种常见质粒载体所携带的复制子,质粒的复制主要是通过型复制和滚环复制两种方式之一进行的，其中以型复制为主。在型复制中，有单向复制和双向复制两种类型。革兰氏阴性细菌中多数质粒是以型方式复制，R1、R100等是单向复制，F、R6k等是双向复制类型。,1. 质
8、粒复制的方式,质粒滚环复制示意图,质粒只编码一种或少数几种与复制有关的蛋白质，而复制所需要的其他蛋白，如DNA聚合酶、引物酶、连接酶、RNA-H酶、旋转酶(gyrase)和拓扑异构酶I、DnaB和DnaC等都是利用寄主的复制酶体系。,在革兰氏阳性细菌中大多数质粒是以滚环方式复制。,复制起点是一段特定的DNA序列，长约几百碱基对，在其相关的调控元件中含有由质粒或宿主染色体编码的、参与DNA合成起始调控因子的结合位点。 在大多数质粒中，与复制有关的蛋白质基因位于它们的作用位点ori序列附近，因此ori位点周围的小范围DNA是质粒复制所必需的。 如果质粒DNA的大部分区域被去掉，而只保留质粒的ori
9、序列，而且质粒是环状的，则质粒仍然能进行复制。,2. 复制起点(ori)区的功能,将ori区克隆到一个不能自主复制的环状双链DNA分子上并引入到原核细胞后，该重组DNA具有自主复制能力。分子克隆中常用的质粒载体就是以这种方法构建的，同时用这种方法可以确定哪部分DNA是ori区并研究ori区的功能。ori区域常决定了质粒的许多特性，如质粒的寄主范围和质粒的拷贝数。,质粒的寄主是指质粒能在其中自我复制的生物种类。质粒的寄主范围通常是由ori区决定的。有些质粒如ColEl类型的质粒，包括pBR322、pET和pUC具有较窄的寄主范围，这些质粒只在E.coli及一些亲缘关系较近的如沙门菌和克氏杆菌(K
10、lebsiella)中复制。,相反，RP4、RK2和RSFl010及从G+细菌中分离的滚环复制的质粒都属于广寄主范围(broad host range)质粒。广寄主范围的质粒一般能编码与复制起始有关的所有蛋白，这样就不依赖于寄主的功能。,三、质粒复制的调控,质粒的复制机理与细菌染色体的基本相同，但二者之间的复制调控则有区别。至今所研究的质粒，其复制调控一般采用直接或间接的负调控机制，负调控因子可以是蛋白质、RNA或DNA重复序列。,目前关于质粒的调控大致可以分为两种类型： 抑制物-靶位调控（inhibitor-target regulation） 重复子-竞争结合调控（iteron-bindi
11、ng regulation）,1. 抑制物-靶位调控,特点是依赖一小段反向转录的RNA作为抑制物，通过与目标RNA的互补结合阻止质粒复制的起始。目标RNA是质粒DNA复制的引物或用于编码复制所需的Rep蛋白的mRNA。属于这一类复制调控的质粒有ColE1、pT181、p15A、pMB1、RSF1010、CloDF13、R1等。,1）ColE1质粒的复制调控,ColE1为6.6kb的小质粒，拷贝数1020。其复制不需任何质粒编码的蛋白质，而是完全依赖于宿主提供的寿命较长的酶和蛋白质，包括分子伴侣、DNA聚合酶I和, DNA依赖的RNA聚合酶、核糖核酸酶H (RNase H), DNA促旋酶和拓扑
12、异构酶I。,ColE1质粒DNA的复制，从oriV开始，单向进行。控制此种质粒DNA复制启动的两种关键因素RNAI和RNA，以及另一种负调控因子Rop蛋白，都是由ColE1 DNA转录产生的。,RNA也叫做复制引物。RNA分子在转录起点附近同互补的模板DNA形成一种杂交分子，被RNaseH酶所切割，从而释放出3-OH末端，作为供DNA聚合酶合成DNA的引物。 RNA前体的合成起始于其复制起点上游555bp处的启动子区，继而穿过复制起点，终止于下游大约150个核苷酸附近的一个位点。此约750个核苷酸的起始转录物的5端折叠成复杂的二级结构，从而使RNA产生一个富G环，后者与位于模板链复制起点上游2
13、0个核苷酸处的质粒DNA富C区正好匹配。随后，该RNA转录产物由RNaseH加工为成熟引物，其切割位点位于复制起点内5个A序列中。所得的555个核苷酸的成熟RNA II被DNA聚合酶I用作引物启动前导链的合成。,质粒DNA的复制过程,RNA是复制的负调节物 RNA可以通过同RNA结合，以阻止其与模板DNA发生杂交作用。colE1复制子不能影响质粒复制所必需的宿主酶的活性，因此，一旦DNA合成启动后，便不能改变其速度或进程。故而拷贝数的控制必须在DNA复制启动时或启动前进行。质粒DNA的合成依赖于复制起点处稳定的DNA-RNA II杂交体的形成。正常情况下，复制的起始是由正确折叠与不当折叠的RN
14、A II间相互转化的平衡来控制的，前者可形成稳定的杂交体，后者则不能。这一平衡的改变主要由RNA来控制，RNA是由RNA基因的反义链编码的108个碱基小分子转录物。它折叠成可与新生RNA II前体结合的三叶草结构，从而阻止后者折叠成形成稳定杂交体所必需的二级结构。,ColE1质粒复制起点结构,与RNA I的配对有可能引起引物RNA二级结构的改变，从而阻止了3-OH 的产生（ RNaseH 不能切割）。,ROM/ROP蛋白对RNA负调节活性的调控由质粒编码的一种被称为ROM(RNA modulator)或ROP(repressor of primer)的蛋白质可提高RNA与RNA结合的效率。RO
15、M蛋白通过促进RNA和RNA杂交体的形成，增强RNA的负调节作用。ROM是含有63个氨基酸的多肽的同型二聚体，它由位于colE1复制起点下游400个核苷酸处的一个基因所编码。该二聚体每个亚单位含有由一个转角连接的两个螺旋，因而此二聚体是由4个螺旋组成的呈双重对称的紧密束状结构。ROM蛋白与RNA和RNA具有相似的亲和力。它促使这两种RNA分子的互补结合物由不稳定的中间体变为更稳定的结构。,rom/rop基因缺失至少可使colE1质粒拷贝数提高两个数量级。例 如，rom /rop基因的缺失可使较早期组建的载体pBR322在每个细菌细胞中的质粒拷贝数从1520个增至500个以上，在rom/rop基
16、因中插入一段外源DNA片段，则可导致致死性的大量质粒DNA复制。,2）R1质粒的复制调控,R1质粒是IncF类型的代表质粒，其复制调控也是在RNA和蛋白质的作用下进行的，但RNA是间接调控的。质粒复制起始所必需的RepA蛋白能在两个启动子的作用下转录。质粒刚进入细胞尚无CopB时，RepA在自身启动子下迅速转录；当达到适当的拷贝数时，PrepA启动子被CopB阻遏，RepA只能从PcopB转录。copA自身启动子带动下从repA基因的互补链进行转录，因此其RNA与repA的翻译起始区重叠但转录方向相反，二者之间形成双链结构，被染色体编码的切割双链RNA的RNase降解。,2. 重复子-竞争结合
17、调控,F、P1、R6k、RK2、RP4和pSC101等质粒是通过RepA进行复制调控的，它们在复制起始位点（ori）和复制基因（rep）附近存在多个17-22bp的DNA短片段，这些短片段被叫做重复子（iteron），含有重复子序列的质粒也叫重复子质粒（iteron plasmid）。重复子能与复制必需的RepA蛋白竞争性结合，从而抑制了质粒的复制和拷贝数的增加。,转录自体调控（transcriptional autoregulation）：RepA蛋白通过与自身启动子区结合而抑制自身的合成,质粒浓度较低时，RepA只与一个质粒结合；质粒浓度较高时，RepA通过与重复子序列的结合使两个质粒联结
18、在一起，因此阻止了质粒的复制。重复子质粒的复制不仅受RepA蛋白浓度的控制，而且受质粒浓度，更确切地说重复子序列浓度的控制。,偶联模型（coupling or handcuffing model）：重复子序列间的相互作用使两个质粒偶联在一起，从而抑制了质粒复制的起始。,四、不相容性和质粒的类群,质粒不相容性：是指亲缘关系相近的两种质粒，在非选择性条件下常不能稳定地存在于同一个细胞中，经过若干代的培养，只含有同一种质粒的细胞越来越多，而含有两种质粒的细胞相对减少。这种现象称为质粒的不相容性（incompatibility）。一般来说，同种质粒衍生物是不相容的，而不同质粒的衍生物则可能是相容性的，
19、也可能是不相容性的。,质粒的不相容性也是与质粒复制起始的控制密切相关的。由于性状相近的质粒通常具有相同或相似的复制调控机制，其阻遏物(抑制物或重复序列)亦相似，在调控时，它们也能随机地与其中的任一质粒的复制区结合而阻遏了其复制过程，并进而使之在子代细胞中丢失。,由于阻遏物的结合是随机的，因此两个质粒在子代细胞中的出现几率相等，即各占50。对于高拷贝数质粒而言，质粒在子代细胞中的丢失需要多次分裂才能实现。,有些质粒能够稳定地存在于同一细胞中，是因为控制拷贝数的机制完全不同。例如，F质粒和ColE1质粒二者是相容的，也就是说，它们分别属于不同的不相容群（different incompatibil
20、ity group）。有些细菌在同一个细胞中可以含有几种不同类型的质粒，例如，Borrelia burgdorferi （博氏疏螺旋体 ）含有17种不同类型的环状和线状质粒。,在细菌中已区分出大量的不相容群（Inc），同一种不相容群的质粒享有调节它们复制子的共同机制。因此，也可以根据复制子是否相同来划分质粒的不相容群，携带有相同复制子的不同质粒属于同一不相容群，它们不能共存于同一细菌中。带有不同复制子的质粒属于不同的不相容群，它们可以共存于同一细菌中。例如p15A、R6K、F能与colE1质粒相容。,五、质粒的稳定性 (细胞分裂中的质粒分配),质粒的不稳定性（plasmid instabili
21、ty）包括两个方面：,分离的不稳定性（segregation instability）：指在细胞分裂过程中，有一个细胞没有获得质粒DNA，并最终增殖成为无质粒的优势群体结构的不稳定性（structural instability）：指由于转座作用或重组作用引起的质粒DNA的重排或缺失。,1、每个世代每个质粒平均都必须至少发生一次复制；2、当细胞分裂时，复制产生的质粒拷贝必须平均分配 到两个子细胞中去。,要使质粒能够保持稳定的遗传，至少需要满足下面两个方面的条件：,在细胞分裂过程中，质粒分配到子细胞的途径可分为： 随机分配(random distribution) 主动分配(active dis
22、tribution),这些质粒的稳定性是通过两种机制来实现的：（1）质粒编码的基因产物，如质粒编码的致死蛋白来抑制不含质粒的子细胞。（2）质粒上的分配体系（par）。,1.主动分配的机理,对低拷贝质粒而言，需要某种特定机制，将细胞分裂与质粒复制协调起来，以保证每个细胞至少获得一个拷贝。目前已对F、R1分配机制进行了深入研究。,ar区叫做分配区(partition region)或分配座位(partition locus)：是指在细胞分裂过程中使质粒拷贝数均等的分配到子细胞中的质粒DNA序列。,在F质粒中par区是同复制起点紧密相邻的，而在R1质粒中则是远离其复制起点。质粒的复制与分配是分开独立
23、进行的，而且par区还会使无亲缘关系的其他质粒保持稳定。,主动分配体系的par区,GGTCTGATTATTAGTCTGGGACCACGGTCCCACTCGTATCGTCCCAGACTAATAATCAGACCCTGGTGCCAGGGTGAGCATAGCAG,-35,-10,SD,sopA,sopB,sopC,SopA,在F质粒中，par区由sopA和sopB两个基因及sopC区组成,sopA和sopB反式作用基因,sopC:顺式作用位点，也叫类着丝粒位点,12个43bp的正向重复序列,SopB与sopC区结合，形成蛋白-核酸复合物，该复合物参与质粒的分配。,sopA和sopB构成一个转录单位，其
24、产物SopA和SopB两种蛋白协同抑制sopAB操纵子的转录，属于自体阻遏蛋白。,有一对7bp的反向重复序列,SopA蛋白与sopAB转录单位的启动子区的操纵基因结合，对其转录进行调控；SopB蛋白虽不能与sopAB操纵子的启动子结合，但它能促进SopA蛋白的结合能力。因此，SopB蛋白必须维持在适当的浓度，才能保证F质粒在细胞内的稳定性。,复制,质粒分配,细胞分裂,质粒,分配复合体,复制体,一种尚未知的结构很快地将两个质粒移向细胞的两极。,细菌质粒DNA的分配模型图,质粒DNA在位于细胞中央的复制体(replisome)的作用下进行复制。质粒复制后，分配蛋白与sopC位点结合形成分配复合物。
25、,复制后的质粒均等地分配到两个子细胞中，分配后的质粒可能在分配蛋白的作用下，定位于细胞的特定区域。,F质粒基因组中控制寄主致死功能的基因ccdA和ccdB，属于同一个自我调节的操纵子，分别编码8.3kD和11.7kD的两种蛋白。在含质粒的细胞中，CcdA蛋白作为解毒剂专门与毒剂CcdB蛋白结合，并使之失效。在没有CcdA蛋白的情况下，CcdB蛋白通过抑制DNA解旋酶的活性，或引发解旋酶诱导寄主染色体DNA发生双链断裂，从而使染色体在细胞分裂过程中无法进行正确的分配。,寄主致死体系（host-killing mechanism）,在新产生的无质粒的子细胞中，开始的时候是含有CcdA和CcdB这两
26、种蛋白质的。但由于无ccd操纵子可发生进一步的转录，因此随后这两种蛋白质的浓度便逐渐下降。毒剂CcdB和解毒剂CcdA具有不同的稳定性，是导致分裂后细胞致死的关键因素。CcdA蛋白质不稳定，易被蛋白水解酶(protease)降解，于是较稳定的CcdB蛋白质便可行使其对寄主细胞的致死作用。,随机分配：是指在细胞分裂过程中质粒拷贝数在两个子细胞之间是随机分配的。在一般情况下，通过随机分配质粒也能够得到稳定的遗传，但在分裂中也会出现无质粒的子细胞。,2.随机分配机制(random distribution),ColEl等多数高拷贝质粒一般没有par基因，它们依赖于高拷贝质粒的随机分配来实现分裂过程中
27、的稳定性。但在某些情况下，尤其是在recA+的宿主细胞中，ColE1常能彼此重组而形成多聚体(multimer)，从而使单个细胞内质粒的拷贝数减少，并增加产生无质粒细胞的可能性。,另外，ColEl质粒含有不依赖于recA的cer基因，负责多聚体的解聚作用，使之重新转变为单体质粒以保证质粒在细胞分裂时的稳定性。,人工构建的质粒载体如pBR322等，在构建过程中并不携带par区，因此它们在细胞分裂过程中是被随机分配的。尽管在大肠杆菌培养物中出现无pBR322质粒细胞的可能性较低，但在一定的条件下，如培养基耗尽或是寄主细胞快速生长分裂的过程中，仍有可能产生出无质粒的细胞。,因此，人工构建的质粒载体，
28、都必须具有选择性遗传标记如：抗药性、营养缺陷型等，以保持选择压力。,质粒转移性：是指质粒能自动地从一个细胞转移到另一个细胞，甚至还能带动供体细胞的染色体DNA向受体细胞转移，这类质粒常常被叫做自主转移质粒(self-transmissible plasmid)。质粒在细菌间的转移，需要供体和受体细胞间的直接接触才能进行，即接合作用(conjugation)，这类质粒又被称接合质粒(conjugative plasmid)。,六、质粒的转移性-分为转移性和非转移性两大类型,有些质粒虽然不能自主转移，但能被其他一些自主转移质粒所转移，这类质粒又被叫做可移动质粒(mobilizable plasmi
29、d)。,几种不同质粒的转移性能,已知大肠杆菌的F质粒、R1、R100、ColV、Collb-P9、R6k、RP4等均属于自主转移质粒，它们是低拷贝的大质粒，其中较小的R6k质粒也有38kb。G+细菌如链霉菌中的自主转移质粒，除SCPl是巨大质粒外，很多都是10kb左右的小质粒，而与转移有关的区域只有2kb左右。自主转移质粒的大小差异可能是因为它们的转移机制不同，G+细菌中质粒的转移不需要性菌毛，因此质粒的容量就较小。,1.自主转移质粒的特点,许多G-细菌中的自主转移质粒需要大于30kb的DNA来编码与接合转移有关的蛋白质，如F质粒的转移操纵子(tra)就包含23个基因，大小为33 kb。,tr
30、a基因和oriT在质粒自主转移过程中起着重要作用，所以大多数自主转移质粒都有tra基因和oriT位点。,自主转移质粒能诱导含有与自己相同或相似的oriT位点的非自主转移质粒进行转移，如将自主转移质粒整合到染色体上后，带动染色体转移也是从质粒的oriT位点开始的。,(1) tra基因：大多数tra基因的产物与性菌毛的形成(F、RP4和pKMl01都编码一根性菌毛)、杂交对的形成有关；有些tra基因编码作用于oriT位点的内切酶，使质粒中的一条DNA链产生切口，从而开始转移；有些tra基因则与质粒转移调控等有关。,(2) oriT位点：oriT位点不仅是质粒转移的起始位点，也是质粒转移后DNA末端
31、再环化的位点，因此质粒必须具有oriT位点才能进行自主转移。,2.可移动质粒的特点,G-细菌中可移动质粒缺少与性菌毛合成有关的基因(约10个左右) 。因此，在进行转移时，必须利用位于同一细胞内的自主转移质粒编码合成的性菌毛才能进行。,如ColEl具有独特的bom位点和负责DNA转移的mob基因。ColEl的bom位点类似于F质粒的oriT。mob基因的功能类似于tra基因，mob基因也能编码特异的核酸内切酶，在bom位点进行切割，但没有编码性菌毛的tra基因，所以它不能自主转移。,但它们含有与F质粒的oriT类似的bom位点和可移动基因mob(mobilization)，因而能够被带有tra基
32、因的质粒诱动转移。,mob产物,bom,F- mob,F+ mob bom,F+ mob-,F+ mob+ bom-,不能转移,性菌毛,转移,不能转移,不能转移,F质粒,F质粒诱动ColEl转移的模型图,七、IncP组质粒的特征和接合转移,F质粒能在大肠杆菌细胞间自主转移，而且能带动供体细胞的染色体向受体细胞转移，也能带动ColE质粒的转移。但F质粒的转移只限于亲缘关系较近的肠杆菌，其寄主范围较窄。IncP、IncN、IncQ、IncW组的质粒属于广寄主范围质粒(broad host range plasmid)。 广寄主范围质粒：指质粒能通过接合作用转移到很多不同种甚至不同属的寄主内，并能稳
33、定地存在于这些寄主细胞内。,下面以IncP为例对这一类质粒进行介绍,IncP组的质粒的寄主较广，IncP质粒自身或带动其他质粒能从大肠杆菌转移到几乎所有的G-细菌中;有研究表明IncP质粒还能接合转移到G+细菌、酵母、植物细胞中;IncP质粒虽然能通过接合作用转移到酵母、植物等这些寄主中，但质粒却不能在这些寄主中复制，属于转移寄主;大肠杆菌IncP组包括很多种天然质粒，大小在60-90kb，具有多种抗性基因，如：卡那霉素(Kan)、四环素(Tet)、氨苄青霉素(Amp)、链霉素(Str)、磺胺(Sul)、汞离子(met)、氯霉素(Cam)、庆大霉素(Gen)、甲氧苄二氨嘧啶(Tp)、环丝氨酸(
34、Ox)等。,1. IncP质粒的特征,在IncP组中，RK2、RPl、RP4的特征极为类似，也是IncP组中研究最深入的质粒。这类质粒的大小为60kb，在大肠杆菌中的拷贝数为4-7个，oriV是质粒的营养复制区，具有与接合转移有关的tra基因和oriT位点，含有氨苄青霉素抗性、卡那霉素抗性及四环素抗性。另外，质粒上还携带有转座子Tn1和插入序列IS21。,RK2和RP4质粒的接合转移机制类似于F质粒，即接合转移需要两个功能区：oriT区和tra区。tra基因编码性菌毛、DNA内切酶等与质粒转移有关的蛋白。oriT是质粒DNA转移的起始位点，当质粒转移时tra基因编码的内切酶在oriT位点造成缺
35、口，质粒的一条DNA开始从供体细胞向受体细胞转移。,2. IncP质粒的接合转移,1. 构建广寄主范围的质粒载体根据自主转移质粒能自主转移及其能带动可移动质粒的转移这两个特征而设计的。从理论上讲，可移动质粒只要含有与自主转移质粒相同的oriT位点就能被转移。对自然界中不能自主转移的质粒，可人工加上oriT位点，然后诱动其转移。,八、广寄主范围质粒载体,一般把RP4或RK2质粒中DNA转移位点，即oriT DNA序列称为mob-site。常用的大肠杆菌质粒载体如pBR322、pBR325、pACYCl84，既不能自主转移也不能被高效诱动。如果这些质粒上带有RP4质粒或其他质粒的mob-site，
36、则能被RP4质粒诱动转移到不含质粒的大肠杆菌或其他G-细菌中。,pBR325-mob,在pBR325质粒上插入RP4质粒的mob-site后，构建成的几种pSUP可移动质粒载体，又称为广寄主范围质粒载体。,2. 广寄主范围质粒载体的接合转移,1）分别含有tra和oriT的双质粒接合转移系统 利用广寄主范围质粒载体和自主转移质粒或其衍生质粒进行转移，通过双亲杂交或三亲杂交的方法进行。,双亲杂交：将两种质粒共同导入大肠杆菌细胞，再以此带有双质粒的菌株与受体菌（如根瘤菌）进行杂交，广寄主范围质粒就能以高频率转移到受体菌中。,三亲杂交：将两种质粒分别导入不同的大肠杆菌细胞，再将含有不同质粒的两个菌株与
37、受体菌混合培养。,2）tra整合到染色体上的接合转移系统 一般将整合有自主转移质粒的大肠杆菌供体菌叫做诱动菌株。 接合转移时，先将可移动质粒载体导入诱动菌株，然后将该菌株与受体菌混合，从而诱动可移动质粒向受体转移，而自主转移质粒本身并不转移。,第三节 质粒的检测和遗传表型,目前用来检测质粒的方法主要根据质粒两方面的特性：遗传学特性：指质粒具有与染色体DNA不同的特征，如独特的表型效应、能独立地从一个细胞转移至另一个细胞、消除后不影响宿主的生存等。根据这些遗传学特性，可采用质粒消除、遗传转移、分子杂交等初步检测菌株中是否含有质粒。分子结构特性：质粒DNA在细胞中处于共价、闭合、环状的超螺旋状态，
38、与染色体相比，它们对碱、高温等理化因子处理有更强的抗性。根据这些特性可以容易地对宿主中的质粒进行检测、分离和纯化。,一、质粒消除,理化因子消除法 常用的理化因子：吖啶橙、溴化乙锭、利福平、亚硝基胍、高温、紫外线等。,如何区别某一遗传性状的丧失是质粒消除还是染色体基因突变的结果？,回复突变：质粒消除不可逆，基因突变（缺失突变除外）可以经回复突变而恢复原有性状。突变率：质粒消除的效率可从菌体数的百分之几到百分之百，而基因突变的频率要低得多。,影响质粒消除的因素：消除剂、宿主状态、消除条件等。,消除质粒的作用机制：对质粒本身的复制和分离产生抑制作用，从而在细菌生长繁殖过程中逐步淘汰；选择性抑制带有质
39、粒的菌生长。 吖啶橙染料等是质粒复制子的复制抑制剂，大炭霉素、SDS等是选择性杀菌剂，它们对有性菌毛的菌产生作用。,2. 原生质体诱导的质粒消除 使待消除质粒的菌株在一定条件下形成原生质体，在再生后生长的菌株中可以出现高频率（约94%）质粒消除菌。,二、遗传转移,自主转移、诱动转移、转化、电转化等方法进行质粒转移。,三、分子杂交,在初步确定某菌株可能含有质粒的情况下，利用已知表型性状的基因片段作探针进行分子杂交，来检测其菌株是否含有该质粒，这也是目前用于质粒检测的重要手段。,四、质粒的分离、检测与纯化,质粒存在的直接证明取决于从宿主细胞中直接检测、分离和纯化质粒DNA。,常用的质粒分离方法是碱
40、变性法。质粒的纯化和检测可用：琼脂糖凝胶电泳 一般同一分子量、不同构型的DNA电泳速度是：cccDNAocDNA（缺刻环状DNA）L DNA （线性DNA）。CsCL-EB密度梯度离心 CsCL溶液在超速离心力的作用下能形成密度1.15-1.80g/mL的连续密度，因而常用于分离纯化DNA和进行DNA的G+C含量的测定。电镜观察,五、质粒编码的遗传表型,大多数质粒均控制着宿主细胞的一种或几种特殊性状，即具有一定的表型。据其表型可将质粒划分为八种。,1致育质粒：具有促进细胞结合的表型效应。F质粒、SCP1、SCP2等。,2抗性质粒（R）：能使宿主对抗生素、化学药物、重金属等杀菌剂表现出抗性的一大
41、类质粒的统称。,质粒赋予宿主的抗药性遗传是以下机制实现的：1）改变抗菌素作用的靶位点；2）修饰抗菌素使其失活；3）阻止抗菌素进入细胞；4）生成一种能代替宿主细胞中被抗菌素作用的靶酶。,3产生抗生素的质粒和产生细菌素的质粒抗生素和细菌素都属于抗菌物质，很多放线菌能产生抗生素，如SCP1质粒是能使宿主产生抗生素的典型代表，与次甲霉素A合成有关的基因都位于这个巨型的线性质粒上。细菌素（bacteriocin）是细菌产生的一般只能抑制或杀死种内不同亚种或菌株中敏感细菌的特殊多肽类代谢产物。细菌素能与敏感菌细胞壁上的专一性受体蛋白结合，进而抑制或杀死敏感细菌；细菌素产生菌株因含有免疫基因（imm）而不受
42、其产物的危害。产生大肠杆菌素的Col质粒有非接合型的如ColE1、ColE2、ColE3和接合型的ColB、ColV、ColIb等，后者具有编码性菌毛的基因。,5降解质粒：这一类质粒编码的降解酶能降解一些特殊的有机物，从而使宿主菌能利用许多不容易为一般细菌分解的物质作为碳源和能源生长。目前只在假单胞菌中发现。 降解性质粒一般也有接合能力和大的分子量。,4产生毒素的质粒：有些使昆虫致病乃至死亡的细菌毒素也是质粒编码的。目前研究较多且应用广泛的苏云金芽孢杆菌的毒素蛋白基因大多定位在质粒上。,6致病性质粒：Ti（Tumor inducing）质粒是一种寄生在根瘤农杆菌（Agradacterium t
43、umefacxiens）中，并能感染植物（主要是双子叶）的茎形成冠瘿瘤的一种质粒。,8共生固氮质粒：存在于不同根瘤菌中，并能与相应的豆科植物进行共生固氮的一类质粒。,7隐蔽质粒：已从微生物细胞中检测和分离出来，但其表型效应尚未确定的质粒。,复习思考题,1. Stringent plasmid、Relaxed plasmid、 segregation instability、 broad host range plasmid2. 质粒复制的方式及其复制起点(ori)区的功能？3. 什么是质粒的不相容性？产生原因？4. 质粒主动分配的机理？5. 质粒转移性？可移动质粒的特点？ 6. 何谓自主转移质粒？在G-细菌中，自主转移质粒有何特征？7. tra基因和oriT在质粒自主转移过程中的作用？8. 绘图说明F质粒诱动ColE1质粒转移的原理？9. 广寄主范围质粒的构建？10. ColE1质粒的复制调控机制？11. 检测质粒的方法主要根据什么？12. 质粒的遗传表型有哪些？,
