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1、第三章 农药残留分析的前处理技术,3.1 样品制备目的和原理 3.2 样品制备常规技术 3.3 样品制备新技术,3.1 样品制备的目的和原理,样品制备（sample preparation）是农药残留分析方法的重要部分。包括从样品中提取残留农药，浓缩提取液和去除提取液中干扰性杂质的分离净化等步骤，是将实验室样品处理成适合测定的检测溶液的过程。,样品制备的目的 1）提高灵敏度和降低检测限。 2）提高测试精度。 3）提高方法的选择性。（衍生化） 4）延长仪器的使用寿命。,样品制备原理 主要是利用残留农药与样品基质的物理化学特性差异，使其从对检测系统有干扰作用的样品基质中提取分离出来。 农药的极性和
2、溶解性是选择提取和净化条件的重要依据，在残留农药的溶剂提取中常采用“相似相溶”原理：使用与农药极性相近的溶剂为提取剂，使残留农药在溶剂中达到最大溶解度。 1）极性：共价键电子密度不均衡分布结果产生了键偶极。 常用溶剂的极性大小： 己烷（石油醚）苯乙醚氯仿二氯甲烷丙酮乙酸乙酯乙腈二甲亚砜甲醇水,2）溶解性 指农药在水相和有机相中的溶解能力。 溶解度的大小很大程度上取决于农药分子所含官能团的种类、数量、溶剂的性质和其他外部因素。 农药的水溶性还受温度、含盐量、有机质、PH值的影响。,3.2 样品制备常规技术,提取技术 提取（extraction）是指通过溶解、吸着或挥发等方式将样品中的残留农药分离
3、出来的操作步骤，也称为萃取。,提取原则：根据农药理化性质按“相似相溶”原理进行。溶剂的选择是关键。 1. 溶剂的极性（“相似相溶”原理） 2. 溶剂的纯度（分析纯以上） 3. 溶剂的沸点（4580之间）。常用的提取溶剂： 石油醚、正己烷、二氯甲烷、丙酮、乙酸乙酯、乙腈、甲醇、水等,提取方法- 液固提取法：将固体放入提取剂中，加以振荡，必要时加热，再利用离心或过滤的方法使液、固分离，欲提取的农药组分进入溶剂。 常用提取方法有振荡法、捣碎法、超声波法、索氏提取法、吹扫捕集法。,振荡提取法,振荡浸提法是最常用的一种方法。它是将样品粉碎后置于具塞三角瓶中，加入一定量的提取溶剂，用振荡器振荡13次，每次
4、振荡0.51h，过滤出溶剂后，再用溶剂洗涤滤渣一次或数次，合并提取液后进行浓缩净化。适用于土壤、谷物等 样品中农药的提取。,组织捣碎法,组织捣碎法也是一种常用的方法。它是将样品先进行适当的切碎，再放入组织捣碎机中，加入适当的溶剂，快速捣碎35min，过滤后进行浓缩净化。适用于蔬菜、水果等新鲜动植物组织 样品中农药的提取。,超声波法,目前一般是用超声波清洗机来进行超声波提取。在超声波清洗槽中装入一定量的水，将装有样品和提取溶剂的玻璃瓶放入其中，提取溶剂的液面要与槽中水面齐平。,索式提取法,用适当的提取溶剂在索式提取器中连续回流提取几小时，获得提取液。提取效率高，但耗时长8h以上）适用于匀浆法等难
5、提取样品中 残留农药的提取或是作为其他 提取方法提取效率的参照标准。 不适合于热不稳定农药的提取。,吹扫捕集法,主要用于水样中挥发性有机物的分析。主要构件有吹沸器、捕集管，气相色谱仪操作步骤： 吹沸 捕集 解吸 GC分析,提取方法-液-液提取法：常用于水样或其他液体样品中残留农药的提取。将一种溶剂加入被测溶液中，利用被测组分在两相中的分配不同而进入有机相，其他组分仍留在原液中而达到分离的目的。通常使用的是分液漏斗。常用的二相溶剂对系统有：乙酸乙酯-水、二氯甲烷-水，石油醚-水、石油醚-丙酮等。,液液分配提取效率的高低取决于化合物与提取溶剂的亲和性、二相的体积比和提取次数三个因素。影响提取效率的
6、因素： 1. 提取溶剂的选择 2. 水相的盐浓度 3. 水相的PH值,乳化现象,有机相、水相、乳化物和外力是乳化形成的主要因素。 破除乳化的方法：离心(2000rpm，2min）过滤（滤纸或无水硫酸钠）在水相中加入一定量的盐（氯化钠或其水溶液）加入少量不同的有机溶剂（无水乙醇） 在振摇时，采用轻缓地向一个方向振摇的方式。,净化技术 净化（cleanup）是指通过物理的或化学的方法除去提取物中对测定有干扰作用的杂质的过程。主要是利用分析物与基体中干扰物质的理化特性的差异，将干扰物质的量减少到能正常检测目标残留农药的水平。,主要干扰杂质及性质,常用净化方法,柱层析法浓硫酸处理法（水解脂类和色素，如
7、净化含有机氯类样品）低温冷冻（-80）法（净化动物样品，除去脂肪和某些色素）,柱层析法,柱层析法是应用最普遍的传统净化方法。 原理是将提取液中的农药和杂质一起通过一支装有吸附剂的层析柱，它们即被吸附在具有表面活性的吸附剂上，然后用溶剂进行淋洗，以达到目标物与杂质分离的目的。 吸附剂的基本要求：具有较大的比表面；适宜的表面孔径和吸附活性；粒度分布范围尽量窄，并具有一定的强度。,常用四种吸附剂的比较,柱层析法操作步骤：,装柱（湿法或干法，一般210g）：用适当的溶剂（弱极性）预淋柱子，让柱处于湿润和适于接受溶液的状态。上样：将用溶剂稀释的样品溶液加在柱上，使样品通过柱子。洗脱：以洗脱分析物而让杂质
8、保留的溶剂（一般为混合淋洗液）梯度洗脱柱子，回收分析物。,样品浓缩技术,样品浓缩的目的是使检测溶液中待测物达到分析仪器灵敏度以上的浓度。 常用的浓缩方法有： 减压旋转蒸发法 K-D浓缩法 氮气吹干法,减压旋转蒸发法,减压旋转蒸发法是利用旋转蒸发器在较低温度下使大体积（50500mL）提取液得到快速浓缩的方法，操作方便，但残留农药容易损失，且样品还须转移、定容。原理是利用旋转浓缩瓶对浓缩液起搅拌作用，并在瓶壁上形成液膜，扩大蒸发面积，同时又通过减压，使溶剂的沸点降低，从而达到高效率浓缩目的。,K-D浓缩法,K-D浓缩法是利用K-D浓缩器直接浓缩到刻度试管中的方法，适合于中等体积(1050mL)提
9、取液的浓缩。特点是可有效减少浓缩过程中农药 的损失，且能直接定容测定，无需 转移样品。但只适用于少量体积的 的样品，且操作较烦琐。,氮气吹干法,氮气吹干法是直接利用氮气 流轻缓吹拂提取液及提高水浴 温度，加速溶剂的蒸发速度来 浓缩样品，可以有效防止氧化 反应但只适合于小体积浓缩。,3 样品制备新技术,固相萃取（solid phase extraction,SPE）固相微萃取（ solid phase microextraction，SPME）基质固相分散（Matrix SolidPhase Dispersion, MSPD）QuEChERS 法免疫亲和层析（immunoaffinity chr
10、omatography, IAC）凝胶渗透色谱（gel permeation chromatography, GPC）加速溶剂萃取（accelerated solvent extraction, ASE）超临界流体萃取（supercritical fluid extraction, SFE）,固相提取法（SPE）,SPE利用颗粒细小的多孔固相吸附剂将液体样品中的目标化合物选择性地吸附，然后再用洗脱液洗脱或加热解吸附，达到分离和富集目标 化合物的目的。只能分离性质差别较大的物质。,固相萃取分离模式正相萃取：吸附剂极性大于洗脱液极性，用于萃取极性物质。如硅胶、弗罗里硅土、氧化铝、氨基等。 反相萃取
11、：吸附剂极性小于洗脱液极性，用于萃取中等极性到非极性化合物。如C18、C8等。 离子交换萃取：吸附剂都是带有电荷的离子交换树脂，用于萃取带有电荷的化合物。如SAX，SCX等。,固相萃取流程吸附柱的选择：根据待分离对象的特点选择合适的吸附柱。活化吸附剂：萃取样品前用适当的溶剂淋洗固相柱。加样：将已经浓缩后的样品采用适当溶剂溶解后加入到吸附小柱上。洗去干扰杂质：选择合适的淋洗溶剂将干扰杂质先淋洗出小柱，农药保留在小柱中。洗脱分析物：选择合适的淋洗溶剂将保留在小柱中的目标农药洗脱出来并收集。,影响萃取效率的因素 吸附剂选择：尽量选择与目标化合物极性相似的吸附剂。 淋洗剂选择：与目标化合物性质及吸附剂
12、有关。 流速：样品溶液的流速一般不超过5mL/min。,固相萃取的优缺点 高的回收率和富集系数 不需要大量溶剂 萃取时间短（是液液萃取的1/2） 操作简单、快速、易实现自动化 缺点：复杂样品有时会堵塞填料空隙； 复杂样品的杂质干扰等,固相微萃取（SPME）,SPME是在SPE基础上发展起来高效的样品预处理技术。它是利用固相提取的方法实现对样品的分离和净化，但所用的固相材料和分离机制不同。,SPME不是将待测物全部分离出来，而是通过残留农药在样品与固相涂层之间的平衡来达到分离目的。其固相是一支覆盖着一层高聚物固定相（聚丙烯酸酯）的熔融石英纤维。浸入样品中，待测组分扩散吸附到石英纤维表面的涂层，当
13、吸附平衡后，与GC或HPLC联用进行分析测定。,固相微萃取流程 吸附：萃取过程中应用磁力搅拌、超声振荡等方式，可缩短达到平衡的时间。 解吸：高温解吸（GC）或溶剂洗脱（HPLC） 纤维的老化和清洗：使用前都需要0.5-4h的老化。,固相微萃取的影响因素固相涂层的性质：非极性固相涂层（聚二甲基硅氧烷）；极性固相涂层（聚丙烯酸酯）液膜厚度：液膜越厚，吸附量越大，但平衡时间越长。搅拌效率：有利于缩短平衡时间。温度：有利于缩短平衡时间，但会减少吸附量。盐的作用和溶液酸度：可改变被分离物质在水中的溶解度，提高灵敏度。,SPME的优缺点 操作时间短(一般只需15min，是液液萃取的30%) 操作简便 无需
14、萃取溶剂 所需样品量少 适用范围广泛 缺点：石英纤维非常脆弱，易折断，重复性较差。,基质固相分散萃取（MSPD）,MSPD是将样品与吸附填料（与SPE吸附材料一致）一起混合研磨，得到半干状态的混合物并将其作为填料装柱，然后用不同的溶剂淋洗柱子，将各种待测物洗脱下来。,反相吸附剂，如C8，C18，主要用来分离亲脂性物质正相吸附剂，用于分离极性较大的农药,优点：样品分析时间短溶剂用量少避免了样品均化、转溶、乳化等带来的损失缺点：取样量小造成检测限较高杂质净化方面不如其他提取技术理想,QuEChERS 法,QuEChERS法是利用固相分散材料与样品或样品提取液充分接触，吸附其中的杂质而得到净化的目的
15、，或者是利用固相吸附剂吸附目标分析物，再进行解析而净化。,其核心技术是净化材料或萃取剂能够选择性地吸附样品溶液中的目标化合物或干扰物质，以达到净化样品的目的，PSA,优点：快速、简单、廉价、有效、可靠、安全（Quick, easy, cheap,effective, rugged and safe）缺点：PSA价格较贵，不适合大批量农药残留的检测 浓缩倍数小，需要灵敏度高的检测仪器，如UPLC-MS-MS,免疫亲和层析（IAC）,IAC是以抗原抗体中的一方作为配基，亲和吸附另一方的分离系统。是将抗体与惰性微珠（如，琼脂糖、纤维素）共价结合，然后装柱，将抗原溶液过免疫亲和柱，非目标化合物不保留，
16、最后用洗脱缓冲液洗脱抗原，从而得到纯化的抗原。,免疫亲和层析流程 装填亲和层析柱 加样本 样本和抗体反应 洗去未结合的物质 再洗去疏松结合的物质 洗脱和抗体紧密结合的部分,免疫亲和柱的优缺点特异性强、净化效率高过程简单、统一缺点：载体价格昂贵特异性抗体难得,凝胶渗透色谱（GPC）,GPC又称为体积排阻色谱，是按溶质分子的大小进行分离的一种色谱技术。其原理是根据多孔凝胶对不同大小分子的排阻效应进行分离，样品中的大分子先被洗脱出来，小分子后被洗脱出来。,凝胶类型： 交联葡聚糖凝胶（Sephadex LH-20 ) 交联聚苯乙烯凝胶（Bio-Beads S-X）。溶剂的选择：所选用的溶剂应该 对目标
17、物有良好的溶解度，并对 凝胶有一定的膨胀力。 常用的洗脱溶剂有：二氯甲烷、 氯仿、乙酸乙酯、己烷等。.,优点：自动化程度高净化效率高回收率高柱子可以重复使用缺点：小分子的干扰物会与目标化合物一起流出，有时须再增加净化步骤。,加速溶剂萃取（ASE）,1995年，推出的一种新的全自动提取技术。原理是选择合适的溶剂、通过提高温度(50200)和压力（1.52.0MPa）来加快萃取速度，提高萃取效率。适用于固体、半固体样品的提取。 特点：所需溶剂少(约15ml/10g)， 快速(20min)，提取效率高。,ASE的装置和流程装置：由溶剂瓶、泵、气路、加热炉、萃取池和收集瓶等构成。流程：将样品放入萃取池
18、； 设定程序，自动进行。（泵液、加温加压、萃取5min、收集） 溶剂瓶：4个； 萃取池：24个； 收集瓶：26个,几种萃取技术的比较,已被美国环保局（EPA）选定为推荐的标准方法（EPA 3545, 1999）。优点：溶剂用量少、快速、提取效率高缺点：选择性不高，萃取液多采用固相萃取、凝胶渗透色谱等加以净化后再进仪器检测。,超临界流体提取法（SFE）,SFE是利用超临界流体（SF）密度大、粘度低、扩散系数大、兼有气体的渗透性和液体的分配作用的性质，将样品中的待测物质溶解并从基体中分离出来，同时完成萃取和分离操作的技术。SF是介于气液之间的一种物质，只能在物质的温度和压力超过临界点事才能存在。在
19、临界点附近，压力和温度的微小变化都可以引起流体密度的很大变化，而超临界流体的溶解度一般随密度的增加而增加。,SFE就是利用压力、温度的变化来实现提取和分离过程的。常用的超临界流体：CO2、NH3、乙烯等。 CO2的优点：密度大，溶解能力强，传质速率高，压力适中，临界温度31，便宜易得，无毒，惰性以及极易从提取产物中分离出来等优点，当前绝大部分超临界流体提取都是以它为溶剂。,SFC萃取流程 装置：CO2储存器、萃取管、萃取池、限流器、收集装置、温度控制装置。 流程：,CO2,改性剂,混合室,泵,泵,萃取管,收集装置,限量器,控温系统,萃取方式：动态、静态、循环,SFC影响因素 压力：影响溶解能力。 温度：影响萃取剂的密度和溶质的蒸汽压。 萃取时间：与被萃取物质在流体中的溶解度及其传质速率呈正向相关。 其他溶剂：加入少量极性溶剂可以改变流体对溶质的溶解能力。常用改进剂为NH3、NO2，加入量不超过10%。,SFC的优点和不足：适应性广泛、操作简单、提取效率高。集提取、浓缩、净化（分析）为一体。分离过程有可能在接近室温下完成，特别适用于热敏性天然产物。自动化操作且能与其他色谱仪器联用。不足：但是必须在高压下操作，设备及工艺技术要求高，投资比较大。,
