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1、图位克隆技术原理,李金伟2012215423,无论头上是怎样的天空，我准备承受任何风暴。,内容简要,图位克隆技术的基本原理,图位克隆(Map- based cloning) 又称定位克隆(positional cloning) , 1986 年首先由剑桥大学的Alancoulson 提出，是近几年来随着各种植物的分子标记图谱相继建立而发展起来的一种行的基因克隆的一种方法,图位克隆技术的基本原理,基本原理： 功能基 因在基因组中都有相对较稳定的基因座，再利用分子标记技术对目的基因精细定位的基础上，用与目的基因紧密连锁的分子标记筛选DNA文库（包括YAC,BAC,TAC或Cosmid等），从而构建
2、基因区域的物理图谱，再利用此物理图谱通过染色体步（chromosome walking）逼近目的基因或通过染色体登陆（chromosome landing）方法最后找到包含有该目的基因的克隆，最后经过遗传转化试验证实目的基因功能。,图位克隆的一般步骤,图位克隆的主要步骤（复旦大学2003细胞生物学考研试题）,图位克隆的一般步骤,2.1,2.2,2.4,筛选与目的基因紧密连锁的分子标记,目的基因的定位,目的基因的筛选和鉴定,2.3,构建高质量、容易操作的大片段基因组文库,图位克隆的一般步骤,2.1筛选与目的基因连锁的分子标记 筛选与目标基因连锁的分子标记（molecular markers）是实
3、现基因图位克隆的关键。实质上，分子标记是一个特异的DNA片段或能够检出的等位基因，精确的分子标记能够极大地提高图位克隆的效率。 迄今为止，已有几十种技术可用于分子标记的筛选，包括有：RFLP标记、RAPD标记、AFLP标记、SSLP标记、SSR标记、SNP标记等。其中最为常用的是简单序列长度多态性（SSLPs）和单核苷酸多态性（SNPs）,图位克隆的一般步骤,图位克隆的一般步骤,图位克隆的分子标记示意图,图位克隆的一般步骤,2.2目的基因的定位 目的基因的定位分为初定位和精细定位,图位克隆的一般步骤,2.2.1初定位 目的基因初定位是利用分子标记在一个目标性状的分离群体中把目的基因定位于染色体
4、的一定区域内。 初定位通常使用近等基因系法或群组分离分析法。近等基因系是指只有目标性状基因有差异其他性状基因相同的2个群体，可以通过连续回交的途径获得。群组分离分析法，将分离群体中的研究的目标性状根据其类型分成2组，将每组内一定数量的植株DNA等量混合，形成2个池，这2个池仅在目标性状上有差异。利用分子标记技术寻找2个池的扩增谱带的差异，这种多态性极可能与目标基因连锁。用所有的分离后代单株，验证该多态性是否真正与目标基因连锁及连锁距离的确定。如果分离群体不易获得，可采取混合样品法,图位克隆的一般步骤,2.2.2精细定位（最艰难、最耗时的限速步骤） 在初步定位的基础上，接下来就要利用高密度的分子
5、标记连锁图对目的基因区域进行区域高密度分子标记连锁分析以便精细定位目的基因。 精细定位通常采用的方法是侧翼分子标记或者混合样品作图。,图位克隆的一般步骤,图位克隆的一般步骤,一旦把目的基因定位在某染色体的特定区域后，接下来就要对其进行精细的作图。目前，作图的类型可分为2类，分别是遗传图谱和物理图谱。遗传图谱对图位克隆非常重要，尤其是精细的遗传图谱。增加遗传图谱上的分子标记数目是精细作图的基础，可以通过整合已有的遗传图谱，或者是寻找新的分子标记来实现。,图位克隆的一般步骤,2.3构建高质量、容易操作的大片段基因组文库 在基因的图位克隆技术中，高质量的基因组文库的构建也是克隆成功的关键。图位克隆的
6、基因组文库主要有Cos质粒文库和人工染色体文库。Cos质粒是一种含有噬菌体的Cos位点的质粒载体，大小在57kb左右，可高效的地克隆2535kb的DNA片段。人工染色体的插入片段最长可达2Mb左右，能够覆盖完整的真核基因，最早发展的人工染色体是YAC。所以当要克隆大片段DNA时，需要YAC作载体。以YAC为载体，可将3001000kb的DNA片段克隆。因此以YAC为载体可以构建高等植物的完整基因组文库。,图位克隆的一般步骤,2.4目的基因的筛选和鉴定2.4.1目的基因的筛选 筛选和鉴定目的基因是图位克隆技术的最后一个关键环节。当一旦找到与目的基因紧密连锁的分子标记并鉴定出分子标记所在的大片段克
7、隆后，就可以利用该克隆为探针进行染色体步移，逐渐靠近目的基因。,图位克隆的一般步骤,染色体步移是指利用已知的基因或分子标记来筛选大片段的DNA文库获得阳性克隆，如此得到的阳性克隆是“一步克隆”，再利用新获得的探针对文库进行第二次杂交，得到与探针具有重复序列的阳性克隆称为“二次克隆”，如此反复即可取到所需的克隆，获得目的基因。染色体步移的主要局限在于当必须经过一个无法克隆的片段时，步移的过程会被打断;当克隆的一端是重复序列时，步移的方向会发生偏差。 为克服这些弊端，Tanksley等（1995）又发展了染色体登陆的方法。,图位克隆的一般步骤,染色体登陆是找出与目的基因的物理距离小于基因组文库插入
8、片段的平均距离还小的分子标记，通过筛选文库直接获得含有目的基因的克隆，他们利用此方法可很快将土豆的pto基因分离出来。 在与目的基因紧密连锁的分子标记及大片段插入基因组文库都具备的情况下，就可以以该分子为探针通过菌落杂交，蓝、白斑挑选的方式筛选基因组文库而获得可能含有目的基因的阳性克隆。在用覆盖目的基因区域的大片段基因组DNA克隆筛选区域特异的cDNA后，仍需对目的基因编码的cDNA作进一步证实。,图位克隆的一般步骤,2.4.2目的基因的鉴定 我们得到的目的基因所在的小片段克隆有可能含有多个ORF（open reading frame），从这些ORF中鉴定目的基因是图位克隆技术的最后一个关键环
9、节，常用的方法是用含有目标基因的大片段克隆如BAC克隆或YAC克隆去筛选cDNA文库，并查询生物数据信息库，待找出侯选基因。,图位克隆的一般步骤,把这些侯选基因进行下列分析以确定目标基因：（1）精细定位法检查cDNA是否与目标基因共分离；（2）检查cDNA时空表达特点是否与表型一致；（3）测定cDNA序列，查询数据库，以了解该基因的功能；（4）筛选突变体文库，找出DNA序列上的变化及与功能的关系；（5）进行功能互补实验，通过转化突变体观察突变体表型是否恢复正常或发生预期的表型变化。功能互补实验是最直接、最终鉴定基因的方法。利用新兴的RNA干扰（RNAi）也可有效地确定目的基因.,图位克隆在植物
10、基因分离中的应用,这些年来，图位克隆技术在模式植物玉米等一些重要农作物水稻中得到了广泛的应用，分离出了一大批在农艺生产上有重要应用价值的基因。,图位克隆在植物基因分离中的应用,3.1图位克隆在技术在玉米基因分离中应用 3.1.1一般步骤 作图群体的构建多态性遗传标记的筛选 、 开发与利用目的基因的初定位目的基因的精细定位候选基因的获得,图位克隆在植物基因分离中的应用,1.图位克隆的遗传定位原理示意图,2.基于 SNP 位点的 CAPS 和 dCAPS 标记开发原理(Lukowitz et al., 2000),3.SNAP 标记开发原理(Drenkard et al., 2000),4.通过测
11、序峰图判定基因型示意图,图位克隆在植物基因分离中的应用,图位克隆过程示意图,注: A: 玉米 10 条染色体大小示意图; B: 初定位将目的基因定位在某条染色体短臂上; C: 在初定位区间内增加多态性标记,进一步将目的基因缩小在 M14 和 M15 两个 SSR 标记内 ; D:扩大群体并同时增加标记, 完成目的基因的精细定位; E: 以B73 基因组序列为参考预测定位区间内可能存在的候选基因;F: 对突变体和突变背景的候选基因序列进行比较, 找到突变基因,图位克隆在植物基因分离中的应用,3.1.2展望 玉米不同自交系基因组的重测序、转录组的大量测序、不同自交系间SNP位点的公布以及对基因组结
12、构特点认识的逐渐深入，将会解决目前图位克隆中遇到的技术问题，进一步提高玉米图位克隆的成功率。 玉米是重要的粮食作物，也是分子生物学研究的模式植物，且属于异花授粉植物，群体构建较易进行，表型观测显而易见。因此在不久的将来，图位克隆技术必将在玉米中得到更加广泛的应用。,图位克隆的现状和前景,2.4.3图位克隆的局限性 利用图位克隆法克隆基因不仅需要构建完整的基因组文库，建立饱和的分子标记连锁图和完善的遗传转化体系，而且还要进行大量的测序工作，所以对基因组大、标记数目不多、重复序列较多的生物采用此法不仅投资大，而且效率低。因而图位克隆法仅局限应用在人类、拟南芥、水稻、番茄等图谱饱和生物上。,图位克隆
13、的现状和前景,此外，在分析发生的变异的时候，我们最有可能遇到的复杂情况是一个给定的性状由不止一个的基因位点控制的。例如，在拟南芥Kashmir-1（有抗性的）和Columbia（敏感的）株系之间的杂交实验中，我们发现粉状霉菌抗性基因至少涉及三个遗传位点，它们是以附加的方式起作用的。对这些抗性基因中的任何一个作精细定位都要求降低作图群体的遗传复杂性，例如通过创造只有一个位点保持多态性的重组近交系。因此，当影响这些性状的自然或者诱导的突变被定位的时候，如第二位点修饰成分干扰这些分析而使图位克隆此类基因变的非常困难；,图位克隆的现状和前景,关于染色体上位点的物理和遗传距离的比值是变化的。通常这种变化
14、是比较小的，对作图的分辨率也只有较小的影响（Copenhaver等，1998），但如果要定位的基因位于重组被严格限制的着丝粒附近，精细定位的努力就有可能无效，且对常染色体序列1%重组的遗传距离相当于100400 Kb的物理距离，然而着丝粒区域1%重组的遗传距离相当于1 0002 500Kb，在现存的物理图谱中很少有着丝粒区域被覆盖等这一切都使图位克隆的染色体步移变的不可能(Georg Jander et al,2002)。,图位克隆的现状和前景,生命科学研究已进入基因组时代。 图位克隆是最为通用的基因识别途径,至少在理论上适用于一切基因。基因组研究提供的高精度遗传图谱、大尺度物理图谱、大片段基
15、因组文库和基因组全序列,为图位克隆的广泛应用铺平了道路。现在,图位克隆已经成为分离基因的常规方法尤其令人鼓舞的是,DNA芯片和微列阵的发明为图位克隆的应用展示了巨大的潜力和光明的前景。DNA芯片或微列阵与SNP和cDNA相结合在基因的定位、筛选和鉴定方面具有无比的优越性,相信能大大提高图位克隆的效率。,图位克隆发展的最新动向,90年代以来,我国先后组织实施了水稻基因组计划和人类基因组计划。我国科学家紧跟世界新技术的发展,积极开展图位克隆研究,在分离、利用水稻和人类的重要基因方面取得了突破性进展。 1995年,中国科学院遗传研究所的宋文源等与美国加州大学戴维斯分校的科学家合作,成功地采用图位克隆
16、方法获得了水稻的白叶枯病抗性基因Xa21。 目前我国从队伍建设到基因技术(包括基因克隆)的引进和发展等方面都有相当的基础。考虑到起步较晚和作图、测序的巨大费用,我国的各种动植物基因组研究也只能采取在八五期间就确定先拿基因的策略。至于拿到基因后的不同植物有效转化系统的建立则另当别论了。鉴于各种植物的抗病虫,图位克隆发展的最新动向,基因和与品质改良有关的基因对于我国的高技术产业、卫生保健、农业生产和权益保护等具有特别重要的意义,毫无疑问,图位克隆对于分离这些基因必将发挥重要的作用.,图位克隆技术原理,参考文献：1.宋成标.图位克隆基因原理与方法.海南生物技术研发与发展研讨会论文集.2006.52.
17、吕洪坤.图位克隆技术在玉米基因分离中的应用.分子植物育种.2013.3.闫其涛.植物基因分离的图位克隆技术.分子植物育种.2005.4.童继平.水稻功能基因图位克隆研究进展.中国生物工程杂志.20125.景润春.图位克隆技术在分离植物基因的应用.武汉大学发育生物学研究中心武汉大学遗传研究所.20006.赵佳.拟南芥中ABA与WUS的关系分析及三个圆叶突变体的图位克隆.细胞生物学.20147. 王泽立.植物基因的图位克隆.生物技术通报.2000,图位克隆在植物基因分离中的应用,图位克隆在植物基因分离中的应用,图位克隆在植物基因分离中的应用,图位克隆在植物基因分离中的应用,Thank You !,
