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1、基因编辑技术的发展,1,t课件,通过精确识别靶细胞DNA片段中靶点的核苷酸序列，利用核酸内切酶对DNA靶点序列进行切割，从而完成对靶细胞DNA目的基因片段的精确编辑。,基因编辑定义,2,t课件,第一代: ZFN(锌指核酸酶)，1996年； 第二代: TALEN(转录激活样效应因子核酸酶)， 2011年； 第三代: CRISPR/Cas9(成簇的规律性间隔的短回文重复序列)，2013年；第四代：NgAgo-gDNA ，韩春雨，2016；,四代基因编辑技术,3,t课件,第一代: 锌指核酸酶,Zinc-finger nucleases（ZFN）,4,t课件,ZFN组成,ZFN = DNA识别域 +
2、核酸内切酶DNA识别域： 由一系列Cys-His锌指蛋白（zinc-fingers）串联组成（34个），每个锌指蛋白识别并结合一个特异的三联体碱基。核酸内切酶Fok I： 非特异性核酸内切酶FokI，形成二聚体时切割双链DNA。,锌指蛋白,5,t课件,DNA 识别域能识别特异位点并与之结合，而由Fok构成的切割域能执行剪切功能，两者结合可使靶位点的双链DNA 断裂(DSB)。于是，细胞可以通过同源重组(HR)修复机制和非同源末端连接(NHEJ)修复机制来修复 DNA。HR 修复有可能会对靶标位点进行恢复修饰或者插入修饰，而 NHEJ 修复极易发生插入突变或缺失突变。两者都可造成移码突变，因此达
3、到基因敲除的目的。,ZFN的工作原理,6,t课件,ZFN 诱导的基因组编辑技术可应用于很多物种及基因位点，具有较好的发展潜力。但是目前有 3 个方面的缺陷制约了该技术的推广:(1)以现有的策略设计高亲和性的 ZFN， 需要投入大量的工作和时间;(2)在细胞中持续表达 ZFN 对细胞有毒性;(3)虽然三联体设计具有一定特异性，但仍然存在不同程度的脱靶效应。,ZFN的特点和不足,7,t课件,第二代: 转录激活样效应因子核酸酶,transcription activator-like (TAL) effector nucleases(TALENs),8,t课件,TALEN的组成,TALEN = DN
4、A识别域 + 核酸内切酶DNA识别域：由一系列TALE蛋白串联组成（20个左右），每个TALE蛋白识别并结合一个对应的碱基。核酸内切酶：非特异性核酸内切酶FokI，形成二聚体时切割双链DNA,9,t课件,TALEN技术原理,TALENs是一种可靶向修饰特异DNA序列的酶，它借助于TAL效应子一种由植物细菌分泌的天然蛋白来识别特异性DNA碱基对。TAL效应子可被设计识别和结合所有的目的DNA序列。对TAL效应子附加一个核酸酶就生成了TALENs。TAL效应核酸酶可与DNA结合并在特异位点对DNA链进行切割，从而导入新的遗传物质。,10,t课件,TALEN 已经成功应用于酵母、 哺乳动物和植物的位
5、点特异性基因打靶， 与锌指核酸酶系统相比有较大的应用优势， 设计更简单，特异性更高，但仍然有些问题需要解决，如脱靶效应、TALEN 与基因组进行特异结合与染色体位置及邻近序列有关等。,TALEN的特点和不足,11,t课件,第三代：成簇的规律性间隔的短回文重复序列,12,t课件,CRISPR/cas系统的发现,1987年发现苗头：大阪大学研究者对一种细菌碱性磷酸酶基因研究中发现，其基因编码区域附近存在一小段简单重复的DNA序列片段，但不太清楚其生物学意义。随后十年不断确认：约40%细菌和90%古细菌基因末端，有多组DNA序列+反向序列+约30bp空格序列（spacer DNA），组成成簇的、规律
6、间隔的短回文重复序列，被称为CRISPR。2005年提出假说： CRISPR中空格DNA能与噬菌体DNA序列互补匹配。细菌CRISPR序列可能与细菌的免疫保护机制相关，细菌转录形成RNA后与入侵的外源噬菌体DNA结合，起到类似RNA干扰的作用。,13,t课件,2007年实验验证：Danisco公司的Barrangou和 Horvath等发现，通过插入或删除嗜热链球菌（乳酸菌）中几个CRISPR序列的空格DNA片段，就可以改变细菌对噬菌体的免疫力（Science, 2007） 。德国学者机制研究：Helmholtz、Doudna和、Charpentier分别对不同的 CRISPR及相关系统进行了
7、研究，阐明了DNA空格序列在细菌免疫防御中的机制。目前已经发现了3种CRISPR/Cas系统，其中依赖Cas9蛋白的CRISPR系统更简单。,CRISPR/cas系统的发现,14,t课件,CRISPR/Cas9系统组成,CRISPR-Cas系统是细菌和古细菌中免疫系统（对付攻击者的基因武器 ）：CRISPR序列（包括空格序列）：成簇的、规律间隔的短回文重复（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat Sequences）。Cas：CRISPR相关基因（CRISPR-associated genes）,15,t课件,RISPR
8、/Cas 系统由 Cas9 核酸内切酶与sgRNA构成. 转录的 sgRNA 折叠成特定的三维结构后与 Cas9 蛋白形成复合体, 指导 Cas9 核酸内切酶识别特定靶标位点, 在 PAM 序列上游处切割 DNA 造成双链 DNA 断裂, 并启动 DNA 损伤修复机制. 从不同菌种中分离的 CRISPR/Cas 系统, 其 CrRNA(或者是人工构建的sgRNA)靶向序列的长度不同, PAM 序列也可能不同。,CRISPR-Cas9的工作原理,16,t课件,三代主流技术对比：,相关视频,17,t课件,第四代： NgAgo-gDNA技术,18,t课件,文章的发表（CNS）,2016年5月2日，河
9、北科技大学的韩春雨与合作者的文章在被Science审稿小半年后被拒，历时9个月终被Nature Biotechnology（IF=42）接收并发表。,沈啸（左），韩春雨（中）、高峰（右）,19,t课件,NgAgo-gDNA技术原理,NgAgo-gDNA技术是以DNA作为引导工具的基因编辑技术。NgAgo-gDNA技术的工作原理与CRISPR-Cas9技术有些类似，都是在引导工具的引导下，令核酸酶对特定位点的基因序列进行切割，从而进行基因编辑。不同的是NgAgo-gDNA技术中所用到的引导工具是一段引导DNA（gDNA）而不是CRISPR-Cas9技术中的RNA。由于也不需要通过蛋白（如锌指蛋白
10、）来寻找需要替换的序列，因此，NgAgo-gDNA技术与CRISPR-Cas9技术一样，较之前的基因编辑技术，在操作上要简单方便得多，利于其在应用中的推广。,20,t课件,NgAgo-gDNA的优势,1、向导设计制作简便：可以像合成PCR引物一样合成短单链DNA向导；向导可直接转染细胞和组织而无需构建向导表达载体。由于向导核酸是DNA而非RNA，因此避免了RNA易于形成复杂的二级结构而带来的失效或者脱靶效应。 2、可编辑基因组内任何位置：Cas9基因组的靶点选择受到PAM区和富含GC区的限制。而NgAgo对靶点选择没有限制，对基因组任何位置都能有效引入双链断裂。,21,t课件,3、新的基因编辑
11、工具精确性更高，脱靶率更低。李伟介绍，NgAgo要结合24个碱基，比Cas9结合的19个碱基要长5个碱基，理论上其精确性会提高1024倍。4、韩春雨团队就是利用格氏嗜盐碱杆（Natronobacterium gregoryi）的Argonaute蛋白实现了DNA引导的基因组编辑，并发现NgAgo作为一种DNA介导的核酸内切酶，适合在人体细胞（37）中进行基因组编辑。大大扩充了基因编辑的取材范围。”,NgAgo-gDNA的优势,22,t课件,同行评价,自然杂志执行主编尼克坎贝尔评论说：“虽然这项新技术还处于初期，但有一些理由让我们相信它与现在普遍使用的技术相比有多种优势，特别是在更精准的基因编辑
12、方面。” “韩春雨的工作是国际一流的技术推进，”北京大学理学部主任、生物学家饶毅教授如此评论。他担任主编的科学类新媒体知识分子刊文，介绍了这项成果的学术细节和价值。,23,t课件,相关争议,2016年7月29日，澳大利亚国立大学研究者盖坦布尔焦称，尽管他和同事在过去的一个月做了多次尝试，但最终发现：NgAgo无法进行基因编辑。2016年8月8日，自然杂志网站发表一篇报道，指出，来自澳大利亚、西班牙等国的科研人员表示实验不可重复，另有一些科学家表示曾重复出韩春雨的部分实验，但还需进一步确认2016年10月11日，河北科技大学副教授韩春雨接受科技日报记者采访，回应无法重复他的NgAgo实验。他依然认为，别人重复不了，细胞污染的可能性最大。2016年10月27日，自然生物技术新闻发言人日前表示，有一些提交的批评意义如此重大，以至于让作者或编辑推断出论文的基本结论是无效的情况下，论文会被撤稿。相关视频,24,t课件,发展“钱景”相当广阔,比尔盖茨甚至曾经预言：超过我的下一个世界首富必定出自基因领域。,基因编辑技术创造生命奇迹，美国基因编辑龙头接连上市。,25,t课件,谢谢,26,t课件,
