微生物检验与控制课件.ppt

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1、药品微生物检验与控制,培训主题：,1、新修订的“微生物限度检查法”介绍2、药品微生物实验室质量管理和质量保证3、药品微生物检验操作技术4、洁净环境微生物监测,2,3,4,培训主题：,1、2010版中国药典第一增补本介绍2、新修订的“微生物限度检查法”介绍3、药品微生物实验室质量管理和质量保证4、药品微生物检验操作技术5、洁净环境微生物监测,5,中国药典修订版整体特点：,微生物检验方法与国外药典接近符合微生物生长特性标准与国际药典USP/EP/JP相近,无菌控制也适用于非无菌产品,控制贯穿于一个药物或生物制剂从研发到市场到成品控制的整个过程,整个过程中的各种微生物控制的整合将提高最终产品微生物质

2、量的保证,微生物学是开发、生产及成品测试的一部分,非无菌产品微生物限度检查： 微生物计数法,主要特点,需氧菌概念回收率测试方法与合格限度,培养基适用性检查：,培养基： 胰酪大豆胨琼脂/胰酪大豆胨肉汤 TSA / TSB 沙氏葡萄糖琼脂/沙氏葡萄糖肉汤 SDA,需氧菌总数计数：,培养基：胰酪大豆胨琼脂 TSA 试验菌株：金黄色普通球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉菌接种量：不大于100 cfu培养条件：温度：30-35 时间：不超过3天；不超过5天,霉菌和菌总数计数：,培养基：沙氏葡萄糖琼脂 SDA 试验菌株：白色念珠菌、黑曲霉菌接种量：不大于100 cfu培养条件：温度：20

3、-25 时间：不超过5天,培养基适用性检查：,范围： - 成品培养基（新引入概念） - 有脱水培养基制成的培养基 - 按处方配制的培养基,培养基适用性检查合格标准：,1、回收率比值：0.5-2 范围内；2、菌落：形态大小与对照培养基一致；3、液体培养基：被检液体培养基与对照培养 基比较，生长良好。,回收率：,USP34-61： For solid media, growth obtained must not differ by a factor greater than 2 from the calculated value for a standardized inoculum。 对于固体

4、培养基，获得的生长结果不得超过由标准接种而来的计算值的两倍范围。,回收率：,对照组计数 测试组计数 2 X 对照组计数 2,计数方法适用性试验：,实质：微生物计数方法验证。几个数字要求： - 接种菌悬液的体积不大于供试液的1% - 菌悬液含菌量不大于100cfu - 抗菌或抑菌活性的标准：回收率低于50%,微生物测试方法,平皿法 1、倾注发； 2、涂布法薄膜过滤法MPN法,涂布法：,新引入的方法关键点：涂布供试液不少于0.1mL.,微生物限度标准解释：,101 可以接受的最大菌数为20；102 可以接受的最大菌数为200；103 可以接受的最大菌数为2000；,非无菌产品微生物限度检查： 控制

5、菌检查法,培养基适用性检查,培养基促生长能力检查 分离培养基在规定的最短时间内促生长能力考察。 培养基抑菌能力检查 分离培养基在规定的最长时间内的抑菌能力考察。,检验方法适用性试验：,实质：控制菌检验方法验证。 适用性试验： 规定最短时间培养，试验菌检出能力试验。,供试品检查：,规定最长时间下的控制菌试验。,微生物限度测试的必要性：1、非无菌药品的微生物污染可能性很低，因 此测试的价值不大。2、微生物限度测试属于“小概率事件”；以 小概率事件衡量整批产品质量不妥。3、微生物测试延长了产品放行周期，增加了 库存成本和市场缺货的机会,微生物控制菌检验结果解释：-阳性。产品报废。-阴性，（1）未检出

6、； （2）非控制菌。怎么办？,微生物实验室检验技术,作为重要组成的微生物控制：,原料和组分的微生物控制,环境的微生物控制,生产过程的微生物控制,成品的微生物控制,所有微生物控制的整合,人员的微生物控制,微生物实验室重要的控制点：-无菌技术-培养基控制-菌种控制-设备控制-实验室布局和运作-数据文件控制-员工培训,无菌技术：防止和保持无菌物品及无菌区域不被污染的操作方法和管理方法。 -无菌环境 -灭菌 -消毒 -卫生要求 -无菌操作技术,培养基微生物实验室工作质量的核心是培养基，应根据既定的目的选用正确的培养基。生产商应提供相关的COA和说明书: -配制 -储存 -菌种选用水: -纯化水，去离子

7、水，蒸馏水 -记录用量成分的测量: -校准过的天平，天平的量程应准确 -清洁的容器和工具 -记录称量,培养基不要过度加热-加热帮助溶解，通常培养基变深说明过度加热-添加剂加入后需充分混合清洁的玻璃器皿 -防止外来污染和抑菌剂 -玻璃器皿清洁,培养基灭菌条件 -供应商提供参数，或自己验证 -高压蒸汽灭菌，过滤除菌 -验证应考虑无菌和培养基生长能力 -湿热灭菌要考虑装载分布，通常121 15min,培养基灭菌条件 -在无菌和过度加热之间平衡 -消毒锅灭菌结束后，不建议在其中存储培养基 -不正确的加热、灭菌条件会影响培养基的 颜色 澄清度 pH 凝固能力 促生长能力 选择性,制备培养基的储存: -低

8、于0，凝胶结构破坏 -避光 避热 -琼脂培养基密封 融化 -重复融化应被限制（不超过一次）， 防止过度加热或潜在污染 -融化时，使用 水浴或流通蒸汽 微波炉，热板要防止过度加热 -融化的培养基储存 在4045水浴不应超过8小时 浇制平皿前擦干,培养基应标示: -制备批号 -制备日期，有效期 -培养基名称有效期确定 -根据成分，配方，容器，储存条件等确定 -生长能力试验数据支持,培养基储存:培养基应根据生产商的说明书，并在验证过的条件下储存培养基储存不得超过有效期重要区域环控用培养基必须 -双层包装 -最终灭菌，否则进行全数预培养及用前检查,培养基质量控制：所有待用的培养基应检查：-生长能力 每

9、批制备的培养基均需进行 测试菌种根据药典，供应商说明及环境中分离得到的菌株 生长能力测试不合格 -调查 -不得使用该批号-无菌-pH，0.2-容器/平皿的完整性-抑制或指示能力定期稳定性检查以确认储存效期,培养基 = “分析仪器”,培养基就是微生物检验员的“分析仪器”。培养基的质量控制相当于“培养基验证”。,培养基确认,对于商业培养基，每批进行测试 （IQ）经过验证的培养基内部配制，每批测试（OQ）培养基促生长试验 （ PQ）,微生物菌种保藏：建立标准程序处理、保存菌种。防止污染和特性变化-必须小心地处理-使用前确认菌种的身份，纯度-根据生产商说明书复苏菌种，使用接种技术- -70以下或冷冻干

10、燥保存储备菌种，可延长保存周期-开启后不要重新冷冻菌种-追溯传代次数，不超过五代,实验室设备维护-绝大部分实验室设备需要进行标准的验证（IQ、OQ、PQ）-定期校准、保养-定期进行性能检查-根据设备的特性和使用状况确定频率-定期清洁、消毒,实验室布局和运作：目的：实验室布局应该有利于实验室运作。 -防止交叉污染 -活动分区 -注意安全实验室应通过不同的进入通路和隔断来区分“洁净”区和“阳性”区，包括更衣，清洁，消毒。洁净区的生物安全柜仅用于无菌和洁净的操作。样品发现微生物生长，后续的工作应转移至“阳性”区,实验室布局和运作：-在无菌条件下小心地对物料进行取样-环控培养基应在待取样区域环境中放入

11、环控 设备并小心的操作-无菌隔离装置技术的使用可能是有效的,样品处理：-大部分样品，水或环控样品中的微生物对操作、储存 环境敏感。-减少样品，取样与测试间的间隔时间，并控制储存条 件。-远距离的转移需确认转移条件对测试及样品的影响。-可能的话，在无菌条件下，使用无菌技术取样，即使 是非无菌样品。-取样记录 样品信息、取样日期、送样日期、人员/部门，实验 室样品，接受及确认,人员培训：制药企业微生物实验室人员-应该接受过微生物学或相关健康科学的正规学习（在校学习）-相关SOP的培训-被赋予保持其技术和经验的职责程序SOP应易于理解并作为培训计划的基础SOP的编号或标题提供了一个便利的将培训文件化

12、方法每个岗位应有相应培训要求，进行上岗前资质确认,实验室资源：管理层保证实验室有足够的资源完成要求的测试熟悉预算管理制定实验室绩效考核指标,文件：实验室文件至少包括（不仅限于此）：-微生物人员培训和能力确认（上岗资质）-设备验证、校准和维护-测试中的设备性能（如温度记录）-培养基制备、无菌检查、生长能力测试、选择性能力-培养基清单与控制-根据程序进行测试的重要参数-数据和计算的确认-经QA人员或相应领导审核过的报告-超标调查结果,实验室结果：记录重要的测试步骤及参数，用以确认结果的完整性，并为能重复测试提供信息至少应包括（不仅限于此）：-日期-测试样品-微生物检验人员名字-程序编号-测试结果-

13、偏差（如有）-测试参数(设备，菌种，培养基)-管理人员审核签名,实验室维护：设备-重要设备记录在测试记录上-校准计划-适用的话，有使用记录-重要的温度记录（水浴，培养箱，灭菌锅）应该具溯源性数据纠错-错误的地方划一横线，签名和日期,洁净环境微生物测试与评估,洁净环境微生物评估“微生物评估”指监测微生物的数量及种类制药企业洁净区域都需要做这样的监测,洁净室环境的微生物评估为什么关心微生物的数量及种类监测？没有微生物控制，无菌工艺就没有作用,洁净环境的微生物评估：大部分无菌产品是无菌工艺生产的，而不是最终灭菌生产的。原材料及环境中的微生物水平，在很大程度上影响产品的微生物质量。,环境监测体系,1、

14、清洁和消毒执行清洁和消毒程序是整个工厂管理的重要组成。要用环境监测数据来评价这些程序的有效性影响消毒消毒的因素：消毒剂类型，左右时间，待消毒表面消毒剂效率测试残留去除,环境监测体系,2、取样位置的选择：哪些部位的微生物污染最可能对产品质量造成不良影响？在生产过程中，什么地点最容易长菌？取样点的选择需要统计学设计或根据网格法来确定？ 在常规监测中，有一些点需要周转取样吗？哪些地方是清洁、消毒或灭菌时最难覆盖/接触或最难凑效的部位？什么活动会导致污染的扩散？在某一部位的取样操作，足以导致测试数据的差错或污染产品？取样只应在生产结尾换班时进行吗？,环境监测体系,3、取样频率批生产动态监测日常监测轮转

15、监测选择取样频率的关键点是尽可能鉴别出系统潜在的缺陷。,尘埃粒子和微生物非生物粒子数量和活的微生物浓度之间的关系在科学上未达成绝对的一致当操作人员是粒子的来源时，以下的结论是成立的，即洁净室中的粒子越少，空气中微生物存在的可能性就越小。,洁净环境监测-大量的药品除了微生物以外还有粒子限度的 要求-部分悬浮粒子与微生物有关-洁净室监测计划包括微生物与粒子数两方面是正常的及恰当的,环境微生物监测方案：1、需氧微生物监测2、霉菌/酵母菌监测通常厌氧菌不必常规检测，但如果无菌环境中发现此类微生物，需增加取样频率。,洁净环境监测主要方面：,微生物监测,无菌药品：,没有任何活体微生物的药品。（理论定义）符

16、合现行质量标准的药品。 检验项目：无菌检验 限度规格：检验结果阴性 检验方法：现行药典的检验方法 取样方法：现行药典规定的取样方法,无菌产品 Vs 无菌检验合格,整批产品无菌 = 无菌检验合格的产品 无菌检验合格的产品 整批产品无菌,无菌检验的局限性：,无菌检验无法对整批产品进行100%检验用于无菌检验的培养基存在局限性无菌检验环境只是一个相对无菌的环境,洁净区微生物监测的动态标准（GMP2010版）,欧盟GMP 附录1. (2003) 医药工业洁净室建议最大允许的微生物含量,USP29 医药工业洁净室建议最大允许的微生物含量(动态),洁净室微生物监测的三个方面：,第一、浮游菌第二、沉降菌第三

17、、表面微生物,环境监测取样点的设置：,应该考虑但不局限于以下因素：该点最易受微生物污染，很有可能对产品质量造成不良影响该点在实际生产中微生物便于微生物繁殖统计学上的要求该点不易清洁、消毒房间的洁净度级别可能污染产品的采样点,取样频率：,单一取样方案不适合于所有环境。选择监测频率的关键是能够确定潜在的系统缺陷。每个点的检验频率可以少于系统或区域的检验频率。在多种情况下，批生产时进行监测可以满足常规区域监测的要求。,采样点示例：,风险点,操作者不能进入Grade”A”区域。,关键点,无菌生产区的环境监测：,1、考虑以下方面： - 洁净度级别 - 空调净化系统验证中获得的结果 - 风险评估2、合理确

18、定取样点的位置： - 污染风险分析 - 每个位置与工艺的关系 - 对人流和物流有良好理解 - 强调产品存在风险的区域,沉降菌监测,采样点的位置 a) 工作区采样点位置离地0.8m1.5m左右（略高于工作面） b) 可在关键设备或关键工作活动范围处增加测点。,沉降菌监测,最小培养皿数,沉降菌测试时间,沉降平皿的暴露时间少于4小时；如果同一位置使用多个沉降平皿进行监测并累计计数，单个沉降平皿的暴露时间可以少于4小时。,表面微生物监测,包括：设备表面墙面地面洁净服表面,表面微生物取样点设置,环境监测培养基的选择,微生物总数,细菌数：在细菌培养基上菌落形成单位的平均数。真菌数：在真菌培养基上菌落形成单

19、位的平均数。微生物总数 = 细菌数 + 真菌数,细菌、真菌培养基：,GB/T 16293-2010 GB/T 16294-2010,采用大豆酪蛋白琼脂培养基（TSA）配制的培养皿经采样后，在30 35 培养箱中培养，时间不少于2d；采用沙氏培养基（SDA）配制的培养皿经采样后，在20 25 培养箱中培养，时间不少于5d。,微生物计数的困惑 ！,细菌培养基上生长的真菌如何计数？真菌培养基上生长的细菌如何计数？,总好氧微生物数（TAMC）：,定义：在TSA（大豆酪蛋白琼脂）培养基上 生长的包括真菌的菌落形成单位总的 数量。培养温度/时间： 1、细菌： 3035 5天。 2、细菌： 3035 2天；

20、 霉菌或酵母菌： 2025 3天。,酵母菌和霉菌总数（TYMC）：,定义：在SDA（沙氏葡萄糖琼脂）培养基上 生长的包括细菌的菌落形成单位总的 数量。培养温度/时间： 2025 5天。,计数原则：,1、TAMC时，如果真菌被发现生长，应该被 作为TAMC计数的一部分。2、TYMC时，如果细菌被发现生长，应该被 作为TYMC计数的一部分。 3、当TYMC由于细菌的生长而超过了可接受 标准，应当使用含有抗生素的SDA培养基。,培养条件：,CHP2010,中国药典2010年版 二部 附录XIX Q “药品微生物实验室规范指导原则” 用于环境监测的培养基须特别防护，最好要双层包装和终端灭菌，如果不能采

21、用终端灭菌的培养基，那么在使用前应进行100%的预培养以防止外来的污染物带到环境中以避免出现假阳性的结果。,微生物良好实验室规范,USP ,MICROBIOLOGICAL EVALUATION OF CLEAN ROOMS AND OTHER CONTROLLED ENVIRONMENTS洁净室和其他受控环境的微生物学评估 media should be examined for sterility and for growth promotion as indicated under Sterility Tests 71 培养基也应像无菌检测中标示的那做无菌检 测和促生长检验。,假阳性（Fa

22、lse positive）,测试结果实际应该没有微生物生长，但被 判为发现生长或阳性。产生原因： 1、非无菌培养基平板引人污染； 2、非无菌操作带来污染。,假阴性（False negative）,测试结果实际应该有微生物生长，但被判 为未见生长或阴性。产生原因： 1、培养基选择不正确； 2、培养基促生长试验失败； 3、培养条件不正确。,GB/T 16293-2010 / GB/T 16293-2010,附录B:B.3 培养基平皿培养及保存 制备好的培养基平皿宜在28保存，一般以一周为宜或按厂商提供的标准执行。采用适宜的方法在平皿上做好培养基的名称、制备日期剂量的标记。,环境测试培养基：,1、T

23、SA（大豆酪蛋白琼脂） 用于细菌取样。 培养温度/时间：3035 不少于2天。2、 SDA（大豆酪蛋白琼脂） 用于霉菌和酵母菌取样。 培养温度/时间：2025 不少于5天。,环境测试培养基：,3、用户认可并验证了的培养基。 以上摘自：GB/T 16293-2010 GB/T 16294-2010,环境监测中常忽视的两个方面：,1、忽视洁净环境中的影响因素2、忽视培养基的选择,1、忽视洁净环境中的影响因素,（1）API 的残留（2）消毒剂/杀孢子剂的残留,API,抗菌素药物活性成分,消毒剂/杀孢子剂,常见的化学消毒剂：1、酚类2、醛类3、过氧化氢类4、季胺盐类化合物5、以上混合物,2、忽视培养基

24、的选择,（1）选择性低下，营养全面（2）含有中和剂（3）“无菌”平板培养基,培养基的选择,营养琼脂、虎红琼脂胰蛋白胨大豆琼脂（TSA）,中和剂的使用：,参见：“中国药典”2010年版 附录109页附录XI J 表1：“常见干扰物中和剂或灭活方法”,酶（1）：青霉素酶,青霉素酶（ -内酰胺酶） 可以有效的水解-内酰胺类抗生素。 包括： - 青霉素G - 氨基青霉素类，如氨苄西林、阿莫西林、匹氨西等 - 羧基青霉素类，如羧苄西林、替卡西林等 - 脲基青霉素类，如呋苄西林、美洛西林等 - 头孢、,酶（2）：头孢菌素酶,头孢菌素酶 可以可有效水解头孢类抗生素及以上的头孢类 抗生素。 包括：头孢羟氨苄、

25、头孢拉定、头孢克洛、头孢呋辛、 头孢克肟、头孢哌酮、头孢噻肟、头孢曲松等。,抵抗消毒剂的中和剂：,1、吐温-80 能够消除六氯酚和含汞类消毒剂的影响。2、卵磷脂 能够消除洗必泰类消毒剂的影响。3、卵磷脂、吐温-80 能够消除季胺类化合物（苯扎溴铵、苯扎 氯铵等）消毒剂的影响。,理想的环境测试培养基：,无菌平板培养基 （预灌装无菌培养基）,无菌平板培养基优点：,1、A级、B级、C级洁净区直接使用2、室温储存3、有效期长4、无菌包装、包装完整5、特制平板6、培养基灌装量大,55mm接触平板（Rodac Plate）,Replicate Organism Detection and Counting

26、 GMP2010 和 EU GMP: - 平板尺寸：15 X 55 mm - 取样单位面积：25cm2,USP1116 洁净室和其它控制环境的微生物评估,接触板得取样面积： 2430cm2,ISO 14698 洁净室及其相关控制环境,取样面积：不小于20cm2 。取样方法： 采样时培养基表面应与采样点接触不少于10s，向整个接触表面施加恒定均匀的压力（如施加的质量约为25g/cm2），不得有环形或线性运动，装置有接触并拿开后，要加盖并尽快用适当的培养条件培养。,洁净环境微生物检测：方法确认,目前各类官方的指导原则中，很少有对洁净环境微生物监测测试方法提出要求的。目前各类官方的指导原则中，各种微

27、生物只有生长在如下两种固体表面上的测试方法：琼脂培养基和滤膜，才能够得到确认。,关键区域环境监测培养基：,TSATSA+吐温80+卵磷脂TSA+酶,结论环境监控是一种重要的方式，以保证洁净室或无菌生产区域受到适当水平的控制监测室定性的活动，即使应用于无菌生产这种最关键的活动中，批产品接受与否的结论也不应该仅仅依赖于环境取样的结果,结论本质上没有人员操作的环境通常在起始阶段即仅有非常低的污染率，并在使用中维持非常低的微生物污染率然而，人类介入的洁净室情况完全不同。研究显示，即使人员非常小心并正确着装，操作员还是会不断地将微生物带入环境因此，期望始终看到环境结果为0，即使在关键区域或关键表面上，也是不合理的,结论洁净室操作人员，尤其是参与无菌生产的人员必须努力维持适当的环境质量，并不断改进人员操作和环境控制无菌生产机检测中介入人员的减少及去除，将减少微生物污染的风险，从而提高产品安全目标始终是把污染的发生率降至最低水平,结论在无菌生产中保证产品安全的唯一方式是通过彻底的培训，遵守严格的纪律，监督和限制人员对关键区域的接触，将风险降到最低我们必须通过系统性地去除污染风险来建立生产的质量,