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1、微生物实验器材与基本操作,1,t课件,内容,实验室的基本设备培养器皿准备培养基的制备灭菌与消毒微生物的无菌操作与检查,2,t课件,实验室的基本设备,玻璃试管 管壁必须较厚，没有翻口接种工具,3,t课件,培养皿的准备,（一）清洗 (清洁的玻璃器皿是得到正确实验结果的重要条件之 一）目的：除污垢（灰尘、油污、无机盐）洗涤剂：洗衣粉 洗洁精,4,t课件,玻璃仪器的清洗,新购买的玻璃器皿的清洗（表面附有游离的碱性物质）比色皿的清洗 不可用强碱，也不可用超声清洗 用洗液浸泡，再用自来水冲洗，应内外不挂水珠,5,t课件,使用过的玻璃器皿的清洗,一般玻璃器皿染菌的玻璃器皿 121高压蒸汽灭菌，2030min
2、染菌的移液管 使用后立即放入5%石炭酸溶液中浸泡数小时,6,t课件,塑料器皿的清洗,硅胶塞：新购置的硅胶塞带有带量的滑石粉，用自来 水冲洗，再用2%NaOH溶液煮1020min。再 用自来水冲洗，然后再用5%盐酸溶液浸泡 30min，最后再用自来水冲洗。,7,t课件,含有琼脂培养基的玻璃器皿,用玻璃棒将琼脂培养基刮下琼脂培养基已干燥 将器皿放入少量的水中煮沸，使琼脂熔化后趁热倒出,8,t课件,洗涤后培养皿的放置,9,t课件,（二）包扎,（1）培养皿的包扎 洗净晾干后的培养皿，用旧报纸包扎，每包610套。（2）吸管的包扎,10,t课件,（3）试管的包扎 塞上合适的试管塞（塞子的1/21/3进入试
3、管），然 后710支一捆用报纸包扎，灭菌。（4）试剂瓶的包扎 用报纸或牛皮纸包扎后，灭菌。 （5）三角瓶的包扎 塞上合适的试管的塞，或盖上8层纱布，外加一层报 纸，用棉绳包扎后灭菌。 （6）吸头和Eppendorf管 吸头根据不同的规格戴手套加入不同的盒子； Ed管放入饭盒中，灭菌，50烘干后备用。,11,t课件,培养基的制备,按物理状态分：液体培养基 固体培养基 1.5%2%凝固剂 半固体培养基 少量凝固剂（0.2%0.7%）,12,t课件,常用培养基成分,一般细菌 牛肉膏蛋白胨培养基：,13,t课件,真菌 马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）：,14,t课件,放线菌 高氏1号培养基：,15,t
4、课件,霉菌 查氏培养基：,16,t课件,酵母菌 （1）PDA （2）麦芽汁培养基 （3）豆汁葡萄糖培养基 （4）YPD培养基 1% Yeast Extract（酵母膏） 2% Peptone（蛋白胨） 2% Dextrose (glucose)（葡萄糖） 若制固体培养基，加入2%琼脂粉,17,t课件,（一）液体培养基的配制,1、称量2、溶解 加水至总容积的4/5左右，慢慢搅拌使其溶解。 如有需要，可加热。3、调PH 培养基溶解均匀并冷却至室温用PH试纸测PH， 用1mol/L NaOH或1mol/L HCl溶液调节PH。（缓 慢少量多加搅拌）再加水到所需的量。4、分装 分装于三角瓶时，分装量不
5、得超过容积的1/2。5、封口 瓶口处盖上68层纱布，瓶口布外包一层牛皮 纸或两层报纸，用棉绳捆绑。6、灭菌 做好标记，放入高压灭菌锅中120 ，20min7、冷却后接种,18,t课件,（二）平板培养基的配制,1、称量 按比例称取一定量的琼脂粉（1.5%2%）， 放入三角瓶中。2、按液体培养基的配制13步操作，调好PH，定容3、分装 分装量不得超过三角瓶的1/24、封口 68层纱布，再外包一层牛皮纸或两层报纸5、灭菌 做好标记，高压灭菌锅中120 ，20min6、冷却 放入55烘箱或水浴中，温度降至55，进 入无菌室倒平板。,19,t课件,7、倒平板 在超净台的酒精灯火焰旁的无菌区内进行操作，右
6、手那装有培养基的三角瓶，拔出试管塞；左手将培养皿的盖在酒精灯火焰旁打开一条缝，让三角瓶口深入；倒入培养基，盖好后顺着超净台边缘将平板推入，平放在超净台上。8、倒置 冷却至培养基凝固后，倒置平板，装入保鲜袋中扎好，放入4 冰箱中保存备用。,20,t课件,（三）斜面培养基的配制,1、按液体培养基配制13步操作，调好PH，定容2、称量 称取1.5%2%的琼脂粉，加入已溶解的药品中，再熔 化 琼脂（控制火力，防止培养基溢出，不断搅拌）， 最后补足所失的水分。3、分装 趁热分装于试管内，分装量不超过高度的1/51/4，不 要污染试管塞。4、灭菌 加试管塞，7支成一捆，试管塞外包一层牛皮纸，或两 层报纸，
7、贴上标签。高压蒸汽锅中121 ，20min。,21,t课件,5、摆斜面 温度降至55 左右，将灭菌后的斜面培养基，趁热放于玻璃棒或移液管上，调整斜度，培养基的斜面不超过试管长度的1/2。6、保存 冷却后，装入保鲜袋中扎好，置于4 冰箱中。,22,t课件,（四）半固体培养基的配制,1、称量 称取0.7%左右的琼脂粉2、同固体培养基相同,23,t课件,（五）无菌水的准备,1、100ml三角瓶（装有玻璃珠），装双蒸水 45ml2、试管装4.5ml双蒸水3、塞上管塞或盖上塑料盖子4、包扎、灭菌5、备用,24,t课件,注意事项,1、药匙不要混用2、PH：(1)调PH要逐步滴加，勿使过酸过碱，破坏培养 基
8、中的某些成分，防止回调或反复调整PH。 （2）灭菌后PH会发生改变，要注意检测灭菌后的 PH状况。（较特殊的用于确定最适PH，最值PH）3、琼脂：待液体培养基煮沸后，再加入琼脂。4、分装：避免培养基粘到管口或瓶口，如不小心粘上， 应立即擦干净。5、制斜面和平板的培养基：温度不宜太高，一般60左右。,25,t课件,6、试管塞：1/22/3进入试管内。7、液体培养：三角瓶内的培养基量一般为1/51/3,不应 超过容积的1/2。8、斜面培养：培养基装量为试管高度的1/51/4，灭菌 后制成的斜面长度不超过1/2。9、半固体培养：培养基为试管高度的1/3,灭菌后垂直 待凝。10、平板：100ml 56
9、个平板 一个平板大约1520ml培养基，铺满皿底高 1.52mm,26,t课件,灭菌与消毒,灭菌 采用强烈的理化因素，使微生物永远失去其生长繁殖的能力，如121 高压灭菌20min。消毒 采用一种较温和的理化因素，仅杀死物体表面或内部一部分对人体有害的病原菌。如用70%酒精进行皮肤表面的消毒。防腐 利用某种理化因素完全抑制霉腐微生物的生长繁殖，防止食品发生霉腐。,27,t课件,物理消毒灭菌,1、干热灭菌法 原理：细胞内蛋白质凝固变性 方法：火焰灼烧灭菌&热空气灭菌 特点：温度高160180，2h2、湿热灭菌法 原理: 高温使原生质中的蛋白质凝固变性，破坏酶 的活性。 方法：高压蒸汽灭菌法,28
10、,t课件,3、紫外线灭菌法 原理：（1）诱导胸腺嘧啶二聚体形成，抑制DNA 复制； （2）辐射使O2电离为O，然后形成O3， 或是水 形成H2O2； 缺点：杀菌能力较强，但穿透力弱，一张薄纸， 玻璃或水层就可滤过大部分的紫外线。 对象：空气和表面杀菌,29,t课件,4、过滤除菌 原理：通过机械作用滤去液体或其气体中的细菌。 对象：不能采用加热灭菌的物质，如维生素、血 清、抗生素、酶液等 缺点：滤量有限，只适用于实验室小量溶液 （20ml以下）的过滤除菌。5、化学药剂消毒灭菌,30,t课件,高压蒸汽灭菌法,1、在高压锅内加入一定量的水，将包扎好的物品放入物品框中。2、接通电源，进行加热。3、将排
11、气阀打开，待排出大气后关闭排气阀；或关闭排气阀，待压强升到0.5kg/cm2时，再打开排气阀，待压强回到0时关闭排气阀。4、压强达到1kg/cm2时，灭菌锅内的温度为121，维持2030min。5、灭菌时间一到，切断电源，待压强降至0打开排气阀，然后打开灭菌器盖，取出物品。,31,t课件,注意事项,1、加上锅底水，防止干烧；2、锅内物品之间留有缝隙，利于蒸汽穿透；3、物品放置不宜过多，过挤，锅内应留出三分之一空间。以免防碍蒸汽流通而影响灭菌效果。4、三角烧瓶与试管口端均不要与桶壁接触，以免冷凝水淋湿包口的纸而透入棉塞。5、尽可能排出锅内冷空气；6、灭菌结束后，要缓慢放气降压（尤其是液体培养基灭
12、菌），切勿突然打开排气阀降压，会引起瓶子爆破或培养基沸腾冲出容器，污染试管塞，瓶口布。,32,t课件,微生物的无菌操作,实验前无菌室的紫外线杀菌,33,t课件,注意事项,1、操作区消毒 ：无菌培养室每天都要用0.2%的新洁尔灭拖洗地面一次(拖布要专用)，紫外线照射消毒30-50min，超净工作台台面每次实验前要用70酒精擦洗，然后紫外线消毒30min。2、消毒时工作台面上用品不要过多或重叠放置，否则会遮挡射线降低消毒效果。3、实验用品，如移液器、废液缸、污物盒、试管架等用要用70%酒精擦拭后才能带入无菌操作台，同时紫外线消毒。,34,t课件,4、操作：开启无菌操作台风机运转10分钟后，才可开始
13、实验操作，动作要准确敏捷，但又不能太快，幅度不能太大，以防空气流动，增加污染机会。5、必要物品，如试管架，移液器或吸管头等可以暂时放置，其它实验用品用完后应及时移出,以利气体流通。6、实验操作应在操作台中央无菌区域内进行，勿在边缘非无菌区域操作。,35,t课件,7、为拿取方便，工作台面上的用品要有合理的布局，原则上应是右手使用的东西放在右侧，左手用品在左侧，酒精灯置于中央。8、工作中不能面向操作区讲话或咳嗽，以免唾沫把细菌或支原体带入工作台面发生污染。9、实验结束后，将实验物品带出工作台，如需要继续进行下一个实验，则用70% 酒精擦拭无菌操作台面，再让无菌操作台风机运转10分钟后，才可进行下一
14、个实验操作。,36,t课件,倒平板,37,t课件,涂棒涂布,1、超净台上酒精灯旁，取0.10.2ml，加到凝固好的培养基上。2、涂棒浸入酒精中，取出后在火焰上过一下，点燃酒精后，离开火焰。3、等涂棒上酒精燃烧完毕后，在火焰边上，涂棒在培养皿内侧稍做停留。4、涂棒放在平板上不接触细胞的地方进一步冷却。5、在平板上缓慢旋转涂布细胞，使其分散均匀。（不可将涂棒往下压，利用涂棒自身重力产生压力）6、涂布完毕后，适当的温度（如2537）下倒置培养。,38,t课件,接种环接种,1、接种环在酒精灯外焰上充分烧红，金属棒部分转动着通过火焰3次。2、火焰边上打开菌种试管或培养皿，培养基上或玻璃管壁上稍作冷却。3
15、、挑取菌体，迅速接到新的培养基上。4、接种环通过火焰烧红灭菌，还原。5、适当条件下培养,39,t课件,移液器接种,1、将移液器容量调到所需数值，竖直装上合适吸头。2、酒精灯旁，左手拿培养液，右手小指与手掌夹住培养液的盖子、打开培养液的盖子，洗去一定量的样品，盖回盖子。3、在酒精灯旁，将样品接种到试管或三角瓶中。4、轻轻混匀，放入合适温度的摇床或培养箱中培养，摇床记得调转速。,40,t课件,注意事项,1、接完后灼烧时，先将近环处镍丝置于火焰中，是热导向接种环。如果直接烧灼，环上残余的菌液会因突然受高温而爆裂四溅。2、沾有酒精的涂棒只需在火焰上过一下，一旦酒精点燃后，就离开火焰。3、涂布平板法所用的菌液量为50200ul，不可太多。,41,t课件,4、小心取无菌实验物品，避免造成污染。（勿碰触吸管、吸头的尖头部或容器瓶口，也不要在打开的容器上方操作实验。）5、尽量不要将瓶盖盖口朝上放置于桌面。,42,t课件,
