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1、现代电泳技术的临床应用,Sebia,厦门市第二医院 王友祥,使用范围和检测原理,电泳技术就是利用在电场的作用下, 由于待分离样品中各种分子带电性质以及分子本身大小, 形状等性质的差异, 使带电分子产生不同的迁移速度, 从而对样品进行分离, 鉴定或提纯的技术.在生化检测中, 主要用于分离各类蛋白分子.,发展历程,1809年俄国科学家列伊斯首先发现电泳现象1937年瑞典科学家Tiselius建立了界面电泳技术, 并首次证明了血清是由白蛋白及, , 球蛋白组成的因此获得1948年诺贝尔化学奖.1950年后, 区带电泳从发展到成熟. 1980年以来, 毛细管电泳逐渐受到重视,常用的电泳技术,滤纸电泳醋
2、酸纤维素薄膜电泳凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳 : 琼脂糖凝胶适用于蛋白质和核酸的电泳支持介质, 成本低, 结果易保存.聚丙烯酰胺凝胶电泳 : 最常用的定性分析蛋白质的电泳方法, 特别是用于蛋白质纯度检测和测定蛋白质分子量, 一般用于科研.毛细管电泳 :经典电泳技术和现代微柱分离相结合的产物,电泳技术的医学应用,蛋白质电泳分析是实验室必备的检测手段, 可全面精确, 描绘出患者蛋白质的全貌. 对疾病的早期诊断, 疗效观察及预后判断具有非常重要的临床价值.,蛋白的电泳检测,根据使用的染料或者是底物的不同，我们可以检测到不同类型的蛋白: 血清蛋白 脂蛋白(运送脂类) 各种酶类血红蛋白,电泳技术在临检中的应用
3、,急,慢性炎症造血系统疾病: 多发性骨髓瘤, 巨免疫球蛋白血症肾脏疾病肝脏疾病中枢神经系统疾病: 多发性硬化症,遗传性疾病: 地中海贫血代谢性疾病: 糖尿病心血管疾病: 心梗,动脉粥样硬化恶性肿瘤,正确解释电泳结果为临床对疾病的判断提供可靠参考,血清蛋白电泳,蛋白染色,血清蛋白电泳后会呈现出5 或者 6 条带.染色后,每个条带呈现出的不同程度的染色对应着各自的蛋白浓度.如何检测染色程度: 需要使用光密度仪.,正常的电泳图谱,出现单克隆免疫球蛋白的电泳图谱,蛋白电泳检测的不同步骤,制备胶片,加样,启动电源,开始电泳,染色, 脱色,结果检测,血清蛋白电泳的目的是什么?,检测异常 :含量的变化 :
4、条带中蛋白含量的增加或减少性质的变化 : 异常条带的出现,临床意义,将电泳作为常规检测之一, 基于蛋白含量的变化, 有助于我们对以下疾病的筛查 :炎症 营养不良肺气肿,临床意义,对异常条带的筛查,有助于我们检测下列疾病: 骨髓瘤 巨球蛋白血症(Waldenstrom)细菌和病毒感染在这些情况下, 必须要做其他辅助测试, 比如说免疫固定, 使用不同类型的抗血清对异常蛋白进行检测. (对于后期治疗有很重要的指导意义),电泳结果的临床应用及常见电泳结果分析,电泳检测,什么情况下必须进行电泳检测?,A/G比例变化血液沉降速度发生异常变化出现恶性疾病征兆在免疫球蛋白定量检测中发现 某一种免疫球蛋白出现大
5、量异常增加,电泳区带分析,双白蛋白,或者一条宽峰,或者在白蛋白条带出现附属条带可能是由以下原因造成 :遗传性双白蛋暂时性的双白蛋白血症可能是由于药物刺激导致的急性胰腺炎导致的双白蛋白血症 : 大量的胰酶的出现可以导致白蛋白降解,白蛋白区带,双白蛋白血症,双白蛋白血症,在下列情况下白蛋白会出现下降 :- 肾病综合症, 蛋白流失, 胃肠病: 检查尿蛋白- 淋巴细胞增生综合征- 营养不良- 肝脏功能不全- 慢性炎症- 严重烧伤- 血液稀释,在下列情况中白蛋白会出现增加:- 脱水症状- 血液浓缩- 白蛋白注射,Alpha 1 globulins(1球蛋白区带),将会在下列情况下出现下降:- 蛋白流失-
6、 肝功能不全- 先天性抗胰蛋白酶缺乏症出现两个条带:- 抗胰蛋白酶的不同基因型出现增加:- 炎症症状,A1AT不同的基因型,A1AT 等电聚焦电泳,急性炎症电泳图谱,Alpha 2 globulins(2球蛋白区带),下列情况中出现下降:- 肝功能不全- 血管内溶血,出现两个条带:- 溶血标本 (结合珠蛋白-血红蛋白复合体)- 结合珠蛋白不同基因型- 出现单克隆免疫球蛋白(带有大量负电荷) *Alpha 2条带在电泳图谱中,是一个很特殊的条带. 因为这一条带中含有五种蛋白: HDL, Haptoglobin, Alpha 2 Macroglobulin, Ceruloplasmin and G
7、c globulin. 由于结合珠蛋白有不同的基因表现型, 增加了这一条带的复杂程度. 结合珠蛋白非常靠近Alpha 1条带; 出现溶血时结合珠蛋白的迁移率会发生改变. 同时,由于HDL的含量或者是存放过久的标本, HDL的迁移速度可能会更快.,溶血的标本,出现在a2区域的单克隆免疫球蛋白,下列情况下Alpha2区域会出现增加现象: - 炎症症状- 肾病综合征- 出现游离轻链,肾病综合征,Beta globulins(球蛋白区带),在下列情况下会出现下降 :- 肝功能不全- C3 长期缺乏 或者 C3 代谢过快 (also in aging sample,C3 denaturation, sp
8、litted in up to 4 fractions: 1 between a2 and b, 1 on b1, 1 on b2 and 1 on g),在下列情况下会出现两个条带:- 长期存放的标本或者是高胆固醇的标本, LDL 有不同的迁移率; 从而导致LDL电泳是偏移 Beta位置,Beta球蛋白在下列情况下会出现增加现象:- 胆管阻塞- 肾病综合征- 肝硬化- 缺铁性贫血- 血球蛋白异常- 高脂蛋白血症- 大量溶血, 脂蛋白,酒精性肝硬化中的- 桥,出现在 b 区域的单克隆免疫球蛋白,游离轻链病,Gamma globulins (免疫球蛋白区带),在下列情况中会出现下降现象: - 部
9、分的或全部的免疫缺陷- 免疫抑制治疗- 游离轻链病或非分泌型骨髓瘤,低免疫球蛋白血症,多克隆免疫球蛋白的增加:- 炎症- 肝硬化- 亚急性和慢性感染 检测到其他条带- 单克隆免疫球蛋白- 寡克隆免疫球蛋白,高免疫球蛋白血症,血清蛋白021216狼疮病,血清蛋白030127酒精肝B-r桥,微量单克隆免疫球蛋白,大量单克隆免疫球蛋白,双克隆免疫球蛋白,与下列各类疾病相关的寡克隆免疫球蛋白(多个条带) :- 自身免疫病- 先天性免疫缺陷症- 病毒感染 (C Hepatitis, HIV disease, CMV(巨细胞病毒), EBV,)- 免疫抑制治疗,Oligoclonal pattern(寡克
10、隆免疫球蛋白),血清蛋白电泳是 M蛋白 (Monoclonal Protein) 多克隆 (polyclonal Protein) 寡克隆 (Oligoclonal Protein) 的首选检测项目,什么是M蛋白,M蛋白疾病(Monoclonal gammapathies, MG)是由于单一克隆浆细胞无限增殖产生的均一单克隆蛋白(Monoclonal-proteins)所导致的一组疾病M蛋白疾病的“M”含义是Myeloma, Macroglobulinemia, Malignant lymphoma和Monoclonal Gammapathies均以“M”开头. M蛋白在电泳上表现为高而狭窄的
11、尖峰.,表1 646例M蛋白类型分类型别 例数 %IgG型骨髓瘤 205 31.73IgA型骨髓瘤 93 14.40IgM型骨髓瘤 56 8.67IgD型骨髓瘤 12 1.86重链病 5 0.77轻链病 214 33.13半分子病 1 0.157S IgM 2 0.31BMG 49 7.59双M蛋白病 8 1.24,多发性骨髓瘤(Multiple Myeloma,MM),MM是造血系统的恶性肿瘤,占整个恶性肿瘤的1%常见于中、老年人(50-70岁居多,40岁以下少见).以往对此病认识不足，漏诊、误诊可达到70%以上.随着寿命的延长对此病认识的提高病例数显著增加.,MM临床表现特点,骨痛,骨骼肿
12、块与病理性骨折,骨质疏松和溶骨现象贫血免疫功能低下,反复感染肾脏损害高钙,高粘(血浆相对黏度6以上)高尿酸血症表现MM的临床表现多样化,常常因此就诊于骨科、肾脏内科等,延误诊治,多发性骨髓瘤的免疫学特征,血中出现M蛋白,正常Ig水平明显减低尿中出现M蛋白和轻链蛋白(BJP)骨髓中浆细胞明显增加无免疫活性Ig导致免疫功能低下,多发性骨髓瘤病人溶骨报告(骨盆),多发性骨髓瘤病人溶骨报告,多发性骨髓瘤病人溶骨报告(颅骨),临床实例,意义未明的单克隆免疫球蛋白疾病: Benign MC在法国,在对献血者进行检测时,会检测到0,15% 比例的单克隆免疫球蛋白携带者. 在老龄人群中检测到的携带者比例更高
13、(80岁以上人群). 在对60到99岁人群的检测显示, 出现Ig的比例从2,6%上升至19,2%.(平均值= 5%),MGUS,MGUS携带者特征: -未出现临床和影像学特征-未出现不良反应, 未检测到血钙升高,也未出现肾功 能衰竭-未见骨髓瘤的临床特征-单克隆免疫球蛋白 20g/l -其他免疫球蛋白都是正常的,同时在患者尿液中未检测到本周氏蛋白-单克隆免疫球蛋白的浓度随着时间的推移未发生增 加现象-其他的免疫球蛋白的浓度也未随时间推移而出现下降,在20%的情况中, MGUS 将会转化成恶性疾病 (6-10 years),Kyle report显示,通过对1384名含有MGUS的患者的 203
14、5(average : 22 years)年的跟踪监测发现, 24%的患者最终演变成恶性的淋巴细胞增生症(multiple myeloma, macroglobulinemia, amyloidosis,).从检测到单克隆免疫球蛋白,直到作出多发性骨髓瘤的诊断报告,这段时间是不定的,从2-29年(平均是10年左右).,大量报告显示,在下列情况中,发展成为恶性淋巴细胞增生疾病的可能性很小 :- 单克隆免疫球蛋白: IgG 15 g/L IgA 10 g/L IgM 5 g/L- 尿蛋白中未出现本周氏蛋白- 其他类型的免疫球蛋白未出现下降,寡克隆免疫球蛋白,由于药物原因导致的免疫缺陷:- 在器官或
15、者骨移植之后 - 自身免疫病: (类风湿关节炎, 干燥综合征(66%), 系统性红斑狼疮.) 由于细菌或病毒感染导致的免疫缺陷:- 病毒 : HIV (63%), EBV, CMV, viral hepatitis,- 细菌,寄生虫感染: (脑膜炎, 脑炎,),在一些肿瘤中: (慢性淋巴细胞性白血病CLL: 29%) 在5 % 正常群体中 (MGUS) 在多发性硬化患者中: (CSF 90%),检测结果阐述,电泳的结果是以%的形式给出的, 但是对于临床诊断, 结果必须要以浓度的形式给出g/L蛋白浓度出现异常时,必须要进行其它的补充检测,患者的随访,首次被发现的患者:如果检测到的异常M蛋白峰值不
16、多, 同时其他免疫球蛋白的含量未发生变化,也没有临床症状, 怀疑可能是 MGUS,第一年每4 至 6个月对患者经性随访,从第二年起, 每年进行一次随访.,已确诊的患者: 如果电泳结果和先前检测相同, 利用异常峰值进行量化以便于检测异常M蛋白的浓度是否发生变化. 这种情况下的随访检测,一定要选择相同的技术方法. 如果随访结果显示出现异常区带, 一定要进行免疫固定电泳确认这些异常蛋白的成分.,Ig G l单克隆免疫球蛋白(近正极端),Ig G k 单克隆免疫球蛋白, 伴随有k 型游离轻链,本周氏蛋白检测,BENCE JONES蛋白检测结果,异常血清蛋白质电泳图谱的分型及其特征,免疫固定电泳结果分析
17、指南,在血清蛋白电泳时,检测到异常条带的出现,或者是某一个条带的蛋白出现异常增加 电泳结果显示为低免疫球蛋白血症, 或者免疫球蛋白定量结果显示可能是游离轻链病 尿蛋白检测结果异常(检测到单克隆游离轻链),查看患者是否做过血清蛋白电泳,如果有必要需要进行血清的免疫固定电泳,什么情况下必须要进行免疫固定电泳检测?,正常血清标本,Ig G l单克隆免疫球蛋白(近负极端),Ig G l单克隆免疫球蛋白(近正极端),Ig G k 单克隆免疫球蛋白, 伴随有k 型游离轻链,本周氏蛋白检测,BENCE JONES蛋白检测结果,出现在 a2 区域的Ig A l,出现两个异常蛋白带 :利用Beta巯基乙醇处理后
18、, 结果为Ig A l单克隆免疫球蛋白,BME/Fluidil treatment,BME/Fluidil treatment,检测结果显示为3个IgA l:利用Beta巯基乙醇处理后, 结果为Ig A l单克隆免疫球蛋白,Ig A k 单克隆免疫球蛋白伴随有k 型游离轻链,characterized on HYDRAGEL BENCE JONES,BJ assay,Ig M k 单克隆免疫球蛋白,在每一个电泳条带上都能见到加样点痕迹:使用BME处理,在BME处理过以后, 结果显示为Ig M k 单克隆免疫球蛋白,BME/Fluidil treatment,寡克隆免疫球蛋白 Ig G (k +
19、 l),双克隆免疫球蛋白 Ig G k 和 Ig A k,免疫固定结果显示为单独的 l 成分:需要使用抗 l游离轻链和/或抗 Ig D和Ig E的抗血清确认,该结果为 l型游离轻链,BJ assay,characterized on HYDRAGEL BENCE JONES,免疫固定结果显示为2个独立的 l 成分:需要使用抗 l游离轻链和/或抗 Ig D和Ig E的抗血清确认,该结果为单克隆Ig D l, 并伴随有 l 游离轻链,BJ assay,characterized on HYDRAGEL BENCE JONES,免疫固定结果确认: Ig E l 单克隆免疫球蛋白,免疫固定结果显示为单
20、独的 l 成分:需要使用抗 l游离轻链和/或抗 Ig D和Ig E的抗血清确认,特殊病例,在免疫球蛋白区域检测到异常条带, 但是免疫固定检测结果却为阴性,在使用抗-纤维蛋白原的抗血清结果显示为阳性,尿蛋白的电泳研究,肾单位的生理结构和各类生理蛋白,1百万个肾单位每天过滤180升的血浆，同时产生大约1.5升的尿液。,尿蛋白 : 定义,在生理学角度讲，正常的人的尿蛋白量在 50 至120 mg/24 h (大约在 100 mg/L)主要的蛋白是白蛋白 (少于 30 mg/L)病理上的肾功能疾病：当尿蛋白量大于150 mg/24 h 而此时，尿蛋白的成分也是不定的。,导致尿蛋白含量增加的原因,生理上
21、的因素 : 间歇性的 (站立过久, 正餐以后, 运动过后, 压力之下)肾前性 : 高血压, 发烧, 心脏或肝脏功能衰退, 蛋白浓度升高 (尿蛋白含量过高)肾性: 肾小球或肾小管受到损伤 (或者两个同时受到损伤)肾后性 : 泌尿系统出现损伤,肾前性的尿蛋白,尿蛋白含量增加,某一种蛋白含量出现异常升高， 超出了肾小管对于这一蛋白的再吸收能力。原因自由轻链, 主要是在单克隆免疫球蛋白疾病中beta 2 微球蛋白, 淋巴组织增生综合征 溶菌酶, 在一些急性髓细胞白血病血红蛋白, 在结合珠蛋白饱和后出现的溶血现象中血清粘蛋白, 又称为Alpha酸性糖蛋白，在支气管癌患者中肌红蛋白, 在横纹肌出现溶解患者
22、中上述各类情况均可导致出现肾病 (尤其是含有自由轻链的本周氏尿蛋白),尿蛋白含量增加,肾性尿蛋白分析,a2-巨球蛋白 (MW :900 kDa),注 : (Cystatin C),血清半胱氨酸蛋白酶抑制剂C,肾小球过滤,小分子蛋白, 分子量小于 67kDa, 被过滤到尿液中.其他决定各种蛋白被过滤的因素 : 分析形状, 带电量, 血浆浓度.还有一些血液动力学因素可影响蛋白的过滤.,肾小球损伤,经常出现于成人及儿童患者中, 表现为尿蛋白含量出现增加现象 (大于1g/24-h)原因糖尿病感染性损伤 (细菌感染, 乙肝患者, 水痘, 梅毒, 单核白血球增多症 ,) 其他系统性疾病 (自动免疫系统,
23、癌症,)中毒现象 (重金属, 药物中毒,)此时, 我们可以在尿蛋白中发现白蛋白和其他大分子量蛋白 (大于 67kDa)。,临床示例,肾小管的再次吸收功能,在肾小球中被过滤掉的小分子蛋白， 分子量小于67kDa, 将会在肾小管内被重新吸收 (内吞作用).99% 的在肾小球内被过滤的蛋白, 都将会被重新吸收利用. 例如, 18g/24-h 白蛋白将会被过滤掉; 30mg/L 白蛋白在人的尿液中被发现.,肾小管损伤,肾小管损伤将会改变其对小蛋白分子的重新吸收能力 (小于67kDa的蛋白)通常是暂时性的, 并且少于0.5g/24-hours原因遗传原因 (Fanconis syndrome)免疫球蛋白
24、单克隆扩增 (骨髓瘤)药物作用 (抗癌药物)中毒现象 (重金属)白蛋白 (30%) 及其它小分子蛋白 (小于 67kDa) 都将会在尿液中被找到.,肾小管损伤,混合性损伤,临床示例,肾小球、肾小管均受损伤。,临床示例,5 PROTEINURIE,14.3 KDa,26.6 KDa,150 KDa,66 KDa,轻链病多表现为肾脏损害，极易误诊为慢性肾炎。 我们认为轻链有3种形式出现在血清或尿中；一是正常的轻链过剩 （Kappa和Lambda同时出现）， 多出现于慢性肝病，红斑狼疮等多克隆增殖中。二是伴随轻链。三是单一轻链，血和尿中只出现单一增殖的大量轻链。,关于本周氏蛋白的检测,进行血清蛋白电
25、泳时, 已经了解患者的血清蛋白电泳信息 (血液中检测到单克隆免疫球蛋白), 不建议进行尿蛋白浓缩.当怀疑患者出现淀粉样病变或者轻链沉淀病时 (血清中未检测到单克隆免疫球蛋白), 这种情况下，需要浓缩尿蛋白确认是否出现了本周氏蛋白.,浓缩还是不浓缩 ?,Bence Jones protein,浆细胞增生症,影响,血液中出现游离轻链,尿液中出现,起因,结果,肾小管损伤淀粉样病变轻链沉淀病,骨髓瘤巨球蛋白血症CLL慢性白血病MGUS.,下列参数会影响本周氏蛋白的毒性 :,等电点 (pI):- When the pI is 6, the Bence Jones will interact strong
26、ly with the Tamm-Horsfall protein.- If the pI is low, there will be little interaction with THP. 轻链形成的聚合体: - (polymers can reach a MW of 900 kD). 轻链的初级结构: - The primary structure of the free light chains is also involved in the toxicity. This is due to the variable region of the light chain.,尿液的检测原则
27、,当血液中检测到M蛋白时:- 进行24H尿蛋白检测- 电泳 + IF/BJ- 对异常峰进行鉴定- 对患者进行随访, 目的是确认药后疗效和肾脏损伤程度,原尿检测 (HR3 Program),Hydragel 15 HR(高分辨试剂检测),浓缩尿液检测 (HR2 Program),Hydragel 15 HR (高分辨试剂检测),Hydragel Bence Jones(本周氏蛋白检测),总的尿蛋白: 0,3 g/L,肾小管型损伤,检测到:- 微量白蛋白, - 3 个肾小管型小分子蛋白- 多克隆的 k and l 型轻链,没有重链与之对应,本周氏蛋白检测阴性,重点 : 对患者定期随访检测, 便于及
28、时掌握患者肾脏损伤程度,总结,电泳技术在同工酶分析方面的应用,The Assay and the Clinical Application of Isoenzymes,同工酶的定义,同工酶是以多种分子形式存在于机体的催化功能相同分子结构不同,检测同工酶的目的,检测同工酶活力比单测定酶的总活力更具有脏器特异性和高灵敏性等优点, 因而提高了临床诊断价值早期诊断某些疾病, 阳性率高, 特异性强可以估计病情严重性和判断预后,同工酶的命名,国际化学联合会(International Union of pure and Applied Chemistry IUPAC)建议:1、在命名同工酶时应采用规定的酶
29、的名称2、如同工酶电泳图上各主要区带旁还分出若干亚区带时,可以用 a, b, c, d 注于主要区带的右下方.3、经明确鉴定过的特异同工酶, 可以附加诸如分子量, 稳定性,亚单位等参数.4、同工酶不应该用组织的分布来加以注解(如脑型，心肌型等)因为这类同工酶在别的生物机体中不一定存在于同一组织中。,目前广泛应用于临床检测中的同工酶,乳酸脱氢酶同工酶(Lactate dehydrogenase, LDH)肌酸激酶同工酶(Creatine kinase, CK)碱性磷酸酶同工酶(Alkaline phosphatase, ALP)天冬氨酸氨基转移酶(Aspartate transaminase,
30、AST) - 谷氨酰转移酶(- glutamyltransferase, GGT) - 淀粉酶同工酶( -Amylase, AMY),同工酶的分析方法,由于同工酶的一级结构 (氨基酸序列)及高级结构(构象)的不同, 因此, 一种酶的各个同工酶在化学, 物理化学, 生物化学等方面的性质也就有所差异, 这些差异就提供了分析和鉴定同工酶的理论基础在研究同工酶的所有方法中，电泳法的使用最为广泛。因为此法简便、快速、分离效果良好，并且一般不会破坏酶的天然状态,乳酸脱氢酶同工酶(LDH),乳酸脱氢酶是能催化乳酸脱氢生成丙酮酸的酶每种LD同功酶都是由4个亚单位(肽链)组成的四聚物. 这些亚单位中, 有两类分
31、别专属M(肌肉)和H(心脏).H4 = LD1H3M = LD2H2M2 = LD3HM3 = LD4M4 = LD5,乳酸脱氢酶同工酶(LDH),组成与分布 LDH 15 H, M, MW 140,000.LDH 1,2: 心肌, 肾, 红细胞LDH 3: 肺, 脾, 胰, 甲状腺, 肾上腺, 淋巴结LDH 4,5: 骨骼肌, 肝LDH x: 睾丸, 精子检测方法-琼脂糖电泳法 原理: 以琼脂糖胶作为介质,LDH可分离出五种同工酶区带,根据其电泳迁移率的快慢, 将迁移最快的命名为 LDH1, 依次为 LDH2, LDH3, LDH4和LDH5,最后显色,扫描确定其百分率.参考值LDH1 28
32、.4 5.3% LDH2 41.0 5.0%LDH3 19.0 4.0% LDH4 6.6 3.5% LDH5 4.6 3.0%,临床意义,LDH1和LDH2升高： 见于急性心肌梗塞(LDH1LDH21)、病毒性心肌炎、风湿性心肌炎和克山病LDH5和LDH4升高： (1)急性肝炎：LDH5明显升高，LDH4轻度增高； (2)急性肝萎缩：LDH5和LDH4都明显升高； (3)慢性肝炎，肝硬化：LDH5轻度升高； (4)骨骼肌急性损伤、皮肌炎：LDH5和LDH4都升高； (5)前列腺癌：LDH5升高，LDH5LDH11LDH的五种同工酶都升高：见于胃癌、结肠癌和胰腺癌.,肌酸激酶同工酶（ISO-C
33、K）,肌酸激酶(CK)同工酶的组成 CK是由M和B两种亚单位组成的二聚体,在细胞质内质内共有三种同工酶：CK-MM,CK-MB和CK-BB。在细胞线粒体内还有另一种同工酶，称为CK-Mt。这几种同工酶的分子量虽然相同，但免疫特性不同，电泳迁移率也不同。,肌酸激酶(CK)同工酶的组成(广泛存在于各类组织中,与ATP形成有关)骨骼肌:主要为CK-MM,不含CK-BB,仅有少量CK-MB（3）心肌:主要为CK-MM,CK-MB占CK总量的14-42 脑组织以及其中含平滑肌器官:几乎全部是CK-BB，它同时也是人胚胎中CK的主要存在形式。,Macro CKType I,CK BB,Applicatio
34、n point,CK MB,CK MM,Macro CKType II,脑组织及其它平滑肌 : CK-BB 0% 心肌细胞 : CK-MB 03%骨骼肌细胞 : CK-MM 97100% CK-MB的阳性决定水平为 5%,免疫抑制法测定 原理：用羊抗CK-M抗体与病人血清共同温育，血清中的CK-M亚单位全部被抑制，测定剩余的非 M-CK 活性，即代表 CK-BB和 CK-MB中的B亚基，也包括CK-Mt 活性，由于正常人和心脏， 肌肉疾患病人血清中CK-BB和CK-Mt的含量极低，故一般忽略不计，此时测得的非 M-CK 活性实际上代表CK-MB中的B亚基活性，乘以2即为CK-MB活性。,CK同
35、工酶的临床意义 1急性心肌梗塞（1） CK总活性在急性心肌梗塞后的4小时便开始升高，至20-30小时达高峰，3-5天后下降至基础水平。此酶为诊断心肌梗塞的一个极灵敏指标。,4小时,20-30小时,3-5天,（2）CK-MB主要存在于心肌细胞内，急性心肌梗塞后先于CK总活力1-2小时升高，12-20小时达峰值，如无并发症3天后回复至正常水平，如果胸痛病人患者在48小时内CK-MB尚在正常水平活力不足总CK的2%，即可排除急性心肌梗塞的诊断 若已下降的CK-MB再度上升，提示可能有新的心肌梗塞发生。,1-2小时,12-20小时,3天后,（1）肌营养不良 骨骼肌中富含CK，以CK-MM为主，故各型肌
36、营养不良均可引起CK活力升高，发病年龄越早，予后也越差。 其中半数以上可检出CK-MB，（CK-MB/CK5%)而心电图都无阳性发现，说明并非心肌受累。 （2）肌肉创伤及肌肉注射 肌肉创伤可使CK活力升高，无CK-MB出现， CK-MM 是骨骼肌损伤的特异指标。肌肉注射青霉素，利血平， 肾上腺素等药物期间，约有 1/3 的病人在 12-48小时内总CK活力升高，一般可持续3-6天，检测CK同工酶，可见主要是CK-MM占优势，提示这是肌肉创伤所至。,2神经肌肉系统疾病,3. 巨CK的临床评价- 巨CK1,巨CK1 是一种同工酶(抗体)与自身抗体的复合物最多的是CK-BB与IgG或IgA的复合物.
37、也有少 数为CK-MM与IgG的复合物。CK-BB-IgG或IgA。老年人、风湿和心脏病、肌炎患者。在做冠脉造影的患者中巨CK1的发生率13.8，认为至少部分起源于血管壁。3例低血钾性肌病妇女。1例急性横纹肌溶解，肌肉内肉碱棕榈酰转移酶缺乏。认为巨CK1与自身免疫性疾病无明显联系。,3. 巨CK的临床评价- 巨CK2,巨CK2是一种低聚的线粒体 CK，又称 CK-Mt，存在于细胞线粒体膜上，当线粒体崩解时，线粒体的小碎片进入血液，使CK-Mt成低聚状态。众多文献认为巨CK2 不会在健康人血中出现，它与恶性肿瘤密切相关，可作为肿瘤的标志物。原发性肺癌巨CK2检出率为56.8%。肺癌组CEA(人癌
38、胚抗原)测定的阳性率40.0%。手术切除后巨CK2转为阴性，提示将巨CK2和CEA联合检测，用于检出肺癌有无周围淋巴结转移具有价值。巨CK2亦可为胃肠道恶性肿瘤的标志物，13例结肠癌患者，手术前有9例血清出现巨CK2；21例结肠癌或胃癌转移的患者中16例检出巨CK2。,MM,MB,BB,Macro CK1,4. CK-BB,急性颅脑损伤患者血清CKBB监测的临床意义华西医学1997年12月2期何永生，叶长宁，四川省人民医院神经外科 目的；探讨急性颅脑损伤患者血清活性及动态变化的临床意义。方法：逐日监测例急性脑伤患者血清活性，与临床指标对比评价其临床价值，并分析其变化规律与治疗转归，预后的关系，
39、结果：血清在伤后早期升高，且与伤情成正比相关，较快恢复正常是治疗有效、无并发症和预后良好的标志。,急性颅脑损伤患者血清CKBB监测的临床意义华西医学1997年12月2期何永生，叶长宁，四川省人民医院神经外科 目的：探讨急性颅脑损伤患者血清活性及动态变化的临床意义。方法：逐日监测例急性脑伤患者血清活性，与临床指标对比评价其临床价值，并分析其变化规律与治疗转归，预后的关系，结果：血清在伤后早期升高，且与伤情成正比相关，较快恢复正常是治疗有效、无并发症和预后良好的标志。,动态监测缺氧缺血性脑病患儿血清CK-BB的临床意义中国误诊学杂志2002年 第2卷第12期郑红英 目的：探讨缺氧缺血性脑病(HIE
40、)新生儿血清脑型肌酸激酶同工酶(CK-BB)和心型肌酸激酶同工酶(CK-MB)的活性变化,以了解CK-BB和CK-MB对HIE患儿的检测价值.方法：在出生后13 d检测HIE患儿CK、CK-BB、CK-MB活性,与正常新生儿作对比,分析各项指标与病情、转归、预后的关系.结果：中度、重度HIE患儿血清CK-BB、CK与正常新生儿相比有显著性升高;重度组CK-MB比正常组显著升高.CK-BB活性迅速下降者,治疗有效,预后良好;CK-BB活力持续升高,患儿预后差, CK-MB升高患儿常伴有心肌功能损害.结论：血清CK-BB是诊断HIE的可靠、特异性指标,动态监测新生儿CK-BB、CK-MB活性对病情
41、估计、判断疗效及预后评估有重要价值.,羊水混浊新生儿肌酸磷酸激酶同功酶改变及临床意义,当代医学，2007年6月傅发展，浙江省蒲江县人民医院目的 探讨羊水混浊新生儿肌酸磷酸激酶及其同功酶的改变及意义。方法 24例羊水混浊新生儿暂无心脑肺等脏器并发症作为实验组，24例正常新生儿作为对照组，出生后48小时内测定CK、CK-MB、CK-BB。 结果 两组差异有显著性（P0.01）。 结论 CK-BB主要存在于脑部神经细胞和星形胶质细胞的胞浆中，只有在神经元和胶质细胞受损时才释放到细胞外。由于宫内缺氧导致血脑屏障功能受损，因而大量CK-BB通过血脑屏障进入血液循环，使血清中水平升高。CK-BB在血中表达
42、水平越高，持续时间越长，表明脑损害病情越重，因其有较高的特异性与灵敏性，在脑缺氧损害时，CK-BB可作为早期诊断、病情估计及判断预后的评价指标。,新生儿缺氧缺血性脑病血清CK-BB水平与脑实质CT值的相关性研究,中国优生与遗传杂志，2006年第14卷05期张爱梅, 刘长云, 吕祖芳, 段全纪目的：探讨新生儿血清肌酸激酶脑型同工酶(CK-BB)的水平与脑实质CT值对缺氧缺血 性脑病(HIE)的诊断价值.方法：采用比色法对49例HIE患儿和32例对照组新生儿血清CK-BB水平进行动态测定. 同时采用日本东芝Aqilion 螺旋CT扫描机单纯头颅平扫,在CT诊断分度的同时测 定脑实质CT值.结果：生
43、后24小时内HIE组血清CK-BB水平与对照组相比明显增高(P均0.01), 且 HIE各组之间差异有显著性意义(P均0.01);生后48及72小时重度HIE组血清 CK-BB水平仍高于对照组(P 0.01),与轻、中度HIE组与对照组相比差异有非 常显著性意义(P 0.01).轻、中、重度HIE患儿脑实质CT值均明显低于对照组 (均P 0.01),且HIE各组之间差异有显著性意义(P均0.01).相关分析发现, HIE组生后24小时内患儿血清CK-BB水平与脑实质CT值呈显著负相关(r =- 0.747, P 0.01).结论：血清CK-BB水平监测可作为HIE诊断及评价脑损伤程度的早期预测
44、指标, 与脑实质CT值结合可对窒息后缺氧缺血性脑病做出早期而正确的诊断,为早期治 疗提供依据.,脑脊液蛋白研究,中枢合成免疫球蛋白是中枢神经系统疾患的一个重要信号，主要用于对中枢神经系统疾患进行诊断和鉴别诊断如：多发性硬化症、痴呆、脊髓炎、副肿瘤性脑炎、神经性梅毒等现阶段临床上诊断中枢神经系统病变主要依靠影像学结合临床分析，但是，在病变早期影像学及常规检查常无法诊断然而中枢神经系统病变患者脑脊液中免疫球蛋白IgG增加却发生较早因此实验中对脑脊液中IgG进行蛋白电泳，形成的典型寡克隆区带对上述疾病的早期诊断而言，是重要的、必不可少的依据,琼脂糖凝胶电泳和免疫固定原理相结合,利用高分辨技术在琼脂糖
45、凝胶上对脑脊液蛋白进行电泳分离(血清中的免疫球蛋白的浓度应该被稀释到和脑脊液中Ig一样的浓度: 5 至 10 mg/L).利用与标有过氧化氢酶的特异的抗血清(G, A, M, k, l)之间的免疫反应,免疫球蛋白将会被固定在Igs过氧化氢酶被激活从而进行显色 : 这种显色反应非常灵敏 (最低可以检测到125-250 g/L的微量蛋白).,临床病例,1 : 脊髓炎 (0.91)2 : 多发性硬化症 (2.69)3 : 由癌症引发的脑炎 (0.70)4 : 多发性硬化症 (0.63)5 : 多发性硬化症 (3.60)6 : 多发性硬化症 (0.74),CAPILLARYS 2,全自动高效液相色谱毛
46、细管电泳仪,毛细管电泳工作原理图,Capillarys: 优势,完全自动化, 利用高电压达到快速分离效果无需载体,蛋白在液态缓冲液中进行迁移拥有良好的分辨率和结果重复性微量加样量 (极高的灵敏度)无需染色, 使用 200 nm紫外光直接检测,LIPOPROTEIN(E)S,脂蛋白电泳检测,前言介绍,脂蛋白的作用主要是运送脂类和供代谢需要.*甘油三酯: 提供能量*胆固醇: 细胞膜和激素*磷脂 : 细胞膜和细胞器.脂蛋白的两个组成部分:脂类蛋白质 根据脂蛋白的功能和结构, 有多种不同的分类法:*根据理化性质分类:主要是, 梯度浓度(高速离心)*根据电泳结果分类:根据载脂蛋白分离结果,脂蛋白分类,*
47、乳糜微粒乳糜颗粒主要由甘油三酯和其他微量脂类组成的外源微粒.*Beta脂蛋白Beta脂蛋白主要是由胆固醇组成, 我们又称之为LDL.*前beta脂蛋白主要用来运输外源性的甘油三酯,我们又称之为VLDL.*Alpha脂蛋白主要是磷脂,我们又称之为HDL,脂蛋白组成,HDL,VLDL,LDL,脂蛋白(a) - Lp(a),这是一种特殊的脂蛋白, 1963年被挪威科学家Berg发现. 从1976年开始, 人们认识到这一载脂蛋白与动脉僵硬化有关.这一载脂蛋白存在正常人体内,只是浓度非常低.很多研究表明, 随着Lp(a)的升高, 出现动脉僵硬化的风险也在升高.因此, Lp(a)是动脉僵硬化和血栓形成的危
48、险因子.,正常参考值,Fredrickson分类法家族性高脂蛋白血症Type I:由饮食原因导致的高乳糜微粒血症或高甘油三酯血症. 少见Type IIa:高胆固醇血症, 家族性, 遗传性. 常见Type IIb:混合型高脂蛋白血症. 常见 TypeIII:中间密度脂蛋白. 少见Type IV:由高糖,酗酒或肥胖导致的内源性高甘油三酯血症. 比较常见Type V:混合型高甘油三酯血症. 少见,NORMAL PATTERN,HDL 39.0 % VLDL 8.7 % LDL 52.3 %,CHOL: 2.0 g/L TG: 1.2 g/L,NORMAL PATTERN + Lp(a),HDL 37.4 % Lp(a) 6.5 % VLDL 10.3 % LDL 45.8 %,CHOL: 2.2 g/L TG: 1.6 g/L,HYPERLIPEMIA TYPE IV,HDL 13.4 % VLDL 49.8 % LDL 37.6 %,CHOL: 2.9 g/L TG: 8.2 g/L,HYPERLIPEMIA TYPE V,Presence of a block LDL-VLDL-Chylomicrons,HDL 18.9 % Block 81.1 %,CHOL: 3.1 g/L TG: 20.5 g/L,Sebia,
