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1、第八章 微生物的遗传与变异,第一节 遗传的物质基础,一、三个证明DNA是遗传物质的经典实验1、经典转化实验肺炎链球菌:S型（菌体具荚膜，菌落表面光滑，有 致病能力） R型（菌体无荚膜，菌落表面粗糙，无 致病能力）,S型和R型细胞侵染试验,实验证明，将R菌转化为S菌的转化因子是DNA,1944年，Avery精确重复了转化实验，确定了转化因子,实验证明，进入细菌细胞内部的物质是DNA。DNA包含有产生完整噬菌体的全部信息。,2、噬菌体感染实验,实验证明，RNA可以传递遗传信息。,（三）原核生物的质粒,凡游离于原核生物基因组以外，具有独立复制能力的小型共价闭合环状的dsDNA分子，就是典型的质粒。质
2、粒所含的基因对宿主细胞一般是非必需的；在某些特殊条件下，质粒有时能赋予宿主细胞以特殊的机能，从而使宿主得到生长优势。,（一）突变类型,营养缺陷性的定义,某一野生型菌株因发生基因突变而丧失合成一种或几种生长因子、碱基或氨基酸的能力，因而无法在基本培养基上正常生长繁殖的变异类型，称为营养缺陷性,（三）突变的特点1.不对应性：突变的性状与突变原因之间无直接的对应关系.（变量试验、涂布试验、平板影印培养试验） 2.自发性：突变可以在没有人为诱变因素处理下自发地产生 .3.稀有性：突变率低且稳定。4.独立性：各种突变独立发生，不会互相影响。5.可诱发性：诱变剂可提高突变率。6.稳定性：变异性状稳定可遗传
3、。7.可逆性：原始的野生基因到变异株的突变称为正向突变 ，相反的过程则称为回复突变或回变。,2、诱变育种的原则（1）使用简便有效的诱变剂,诱变剂,物理因素,化学因素,紫外线激光离子束X射线r射线快中子,烷化剂碱基类似物吖啶化合物,（2）选用优良的出发菌株（3）处理单细胞或单孢子悬浮液（4）使用最佳诱变剂量 剂量 = 强度（浓度） 作用时间 相对剂量 = 杀菌率（5）利用协同效应（6）寻找和利用形态、生理与产量间的相关指标（7）设计高效率筛选方案（8）根据具体情况创造新型筛选方案,3、突变株的筛选：（1）产量突变株的筛选 （2）抗药性突变株的筛选 （3）营养缺陷型突变株的筛选,突变株的筛选方法,
4、诱变,检出营养缺陷型,淘汰野生型,富集培养（抗生素法）（菌丝过滤法）,夹层培养法限量补充培养法逐个检出法影印平板法,生长谱法,确定出发菌株 菌种的纯化选优 出发菌株的性能鉴定同步培养 制备单细胞（或单孢子）悬液 活菌浓度测定诱变剂的选择与确定诱变剂量的预试验 诱变处理 平板分离 计形态变异的菌落数，计算突变率挑取疑似突变菌落纯培养 突变体的初步筛选 用简单快捷的方法重复筛选 摇瓶发酵试验选出突变体（根据情况进行生产试验或重复诱变处理）,诱变育种的一般步骤和方法,基因突变及其机制,基因工程,诱变,自发突变,点突变,畸变,碱基置换,移码突变,转换,颠换,缺失,添加,缺失,添加,异位,倒立,重复,插
5、入,1、诱发突变：物理、化学核生物的因素，提高突 变率的人为的作法（1）碱基的置换,碱基对的置换可分成两个亚类：一类是DNA 链上的一个嘌呤被另一个嘌呤或是一个嘧啶被另一个嘧啶所置换，称为转换；另一类是DNA 链上的一个嘌呤被另一个嘧啶或是一个嘧啶被另一个嘌呤所置换，称为颠换。,移码突变 这是指由一种诱变剂而引起DNA 分子中的一个或少数几个碱基插入或缺失，从而使该部位后面全部遗传密码发生转录错误的一类突变。吖啶类染料及其化合物是移码突变的有效诱变剂，例如三氨基吖啶，吖啶黄，吖啶橙，5-氨基吖啶。 吖啶类化合物的诱变机制目前还不很清楚。现普遍认为，由于吖啶类化合物是一种平面型三环分子结构，与一
6、个嘌呤:嘧啶碱基对相似，因此能够嵌入两个相邻的DNA碱基对之间，造成双螺旋的部分解开，从而在DNA 复制过程中，会使链上插入或缺失一个碱基，结果引起移码突变。,紫外线对DNA的损伤及其修复,嘧啶,嘧啶二聚体,UV,紫外线主要通过在同链DNA 相邻的嘧啶间或在互补双链间形成以共价键结合的胸腺嘧啶二聚体，微生物能以多种方式去修复被紫外线损作后的 DNA，主要方式有两种：1 、光复活作用。 由于微生物中一般都存在着光复合作用，因此，用紫外线照射菌液时都须在红光下进行操作处理微生物，而后在暗室或用黑布包起来培养。,嘧啶二聚体,嘧啶,光解酶,2、切除修复（暗修复作用）,一、原核生物的基因重组（一）转化,
7、供体菌,受体菌,DNA片段,受体菌直接吸收来自供体菌的DNA 片段，通过交换组合把它整合到自己的基因组中，从而获得了供体菌的部分遗传性状的现象，称为转化。转化后的受体菌，称为转化子。供体菌的DNA 片段称为转化因子。进行转化，需要二方面必要的条件：,转化过程： 从供体菌提取出转化因子双链DNA片段； 双链DNA 片段与感受态受体菌的细胞表面特定位点结合； 在结合位点上，双链DNA 中的一条单链逐步降解，同时另一条链逐步进入受体细胞。 进入受体细胞的DNA 单链与受体菌染色体组上同源区段配对，而受体菌染色体组的相应单链片段被切除，并被进入受体细胞的DNA 单链所取代，于是形成了杂种DNA 区段；
8、 受体菌染色体进行复制，其中杂种区段被分离成两个，一个恢复，一个形成一个转化子。,转化过程的特点：a）对核酸酶敏感；b）不需要活的DNA供体细胞；c）转化是否成功及转化效率的高低主要取决于转化供体菌株和转化受体菌株之间的亲源关系； d）通常情况下质粒的自然转化效率要低得多,（二）转导,通过缺陷型噬菌体或温和型噬菌体为媒介，将供体细菌细胞中DNA 片段携带到受体细菌细胞中，从而使受体细菌获得供体细菌的某些遗传性状的现象，称为转导。,根据媒介噬菌体的不同，转导分普遍性转导和局限性转导两类。,1普遍性转导 由缺陷型噬菌体误包（而非整合）供体细菌DNA 中的任何一部分片段（包括核外遗传物质在内）后，当
9、它再次感染受体细菌时，使后者获得了这部分遗传性状的现象，称为普遍性转导。它的转导频率为 105108。 2局限性转导 由温和噬菌体侵染而形成的某一溶源细菌群被诱导裂解时，其中极少数个体的DNA 可能与噬菌体DNA 发生若干特定基因的交换，从而被整合到噬菌体的基因组上，当该噬菌体再次感染受体细菌时，就使受体细菌获得了这一特定遗传性状的现象，称为局限性转导，它的转导频率为 10-6。,（三）接合,通过供体细菌和受体细菌完整细胞间的直接接触而传递大段DNA 的过程，称为接合（有时也称杂交）。,在细菌中，接合现象研究最清楚的是大肠杆菌。发现能够进行接合现象的大肠杆菌有雄性与雌性之分，而决定它们性别的是
10、由是否存在 F 因子所决定。,F 因子又称致育因子，是一种质粒，分子量为 5107 道尔顿； 雌性细菌不含F 因子，称为F - 菌株， 雄性细菌含有游离存在的F 因子，称为F + 菌株， 当雄性细菌细胞中所含的F 因子被整合在细胞核的DNA 上，不呈游离状态存在称为Hfr 菌株（高频重组菌株）； 有时被整合在细胞核DNA 上的F 因子，从DNA上面脱落下来，呈游离存在，但在脱落时，F 因子有时能带一小段细胞核 DNA。我们将这种含有游离存在的但又带有一小段细胞核DNA 的F 因子的细菌称为 F菌株。,a）F+细菌通过性毛与F-细菌接触并发生相互作用；b）F+细菌的F因子出现缺口，双链之一被切断
11、，从断端转移F因子的一条链到F-细菌中。 c）F因子的一条链一进入F-细菌中，就在F-细菌中复制新的 F因子。,1） F+F-杂交,d）复制完成后， F-细菌变成F+ ，同时原有F+细胞也完成F因子另一条链的复制，所以转移是F+的拷贝。所以最终杂交的结果是F-细菌变成F+细菌，而原有的F+细菌则不变。,2）Hfr F-杂交,Hfr菌株的F因子插入到染色体DNA上，因此只要发生接合转移转移过程，就可以把部分甚至全部细菌染色体传递给F-细胞并发生重组，由此而得名为高频重组菌株。,Hfr菌株仍然保持着F+细胞的特征，具有F性菌毛，并象F+一样与F-细胞进行接合。所不同的是，当OriT序列被缺刻螺旋酶
12、识别而产生缺口后，F因子的先导区结合着染色体DNA向受体细胞转移。F因子除先导区以外，其余绝大部分是处于转移染色体的末端，由于转移过程常被中断，因此F因子不易转入受体细胞中。HfrF-杂交后的受体细胞(或接合子)大多数仍然是F-。,3）FF-杂交,Hfr菌株内的F因子因不正常切割而脱离染色体时，形成游离的但携带一小段染色体基因的F因子，特称为F因子。,FF-与F+F-的不同：供体的部分染色体基因随F一起转入受体细胞a）与染色体发生重组；b）继续存在于F因子上，形成一种部分二倍体；,第四节基因工程,基因工程（genetic engineering)是在分子水平上对基因进行操作的复杂技术，是将外源
13、基因通过体外重组后导入受体细胞内，使这个基因能在受体细胞内复制、转录、翻译表达的操作。,基因工程是指在基因水平上的遗传工程，它是用人为方法将所需要的某一供体生物的遗传物质-DNA大分子提取出来，在离体条件下用适当的工具酶进行切割后，把它与作为载体的DNA分子连接起来，然后与载体一起导入某一更易生长、繁殖的受体细胞中，以让外源遗传物质在其中“安家落户”，进行正常复制和表达，从而获得新物种的一种崭新的育种技术。,一、菌种的退化,1、菌种退化的表现生产性状的劣化,遗传标记的丢失, 原有的典型性状的不典型等菌落及细胞形态的改变生长速度缓慢代谢产物生产能力下降，即负突变致病菌对宿主侵染力下降抗不良环境条
14、件（抗噬菌体，抗低温）能力减弱,第五节 菌种退化、复壮与保藏,2、菌种退化的原因：基因自发突变退化是发生在群体细胞中的一个从量变到质变的逐步演变过程。 自发突变率10-810-9 加速退化的因素传代次数过多不适宜的培养条件,3. 防止退化的措施控制传代次数创造良好的培养条件利用不易衰退的细胞传代采用有效的菌种保藏方法,三、菌种的保藏,（一）目的 使微生物菌种保持原来的性状和活力不退化、不死亡、不被污染，便于研究、交换和使用 。（二）原理 挑选典型培养物（typical culture）的优良纯种，并创造最有利于休眠的环境条件，使微生物处于代谢不活泼、生长受抑制的休眠状态。,三、常用的菌种保藏方
15、法1、斜面保藏法方法：接种适宜斜面培养基 培养 4保藏 措施：低温：4 适用：各大类 保藏期：16个月用橡皮塞代替棉塞，可适当延长保藏时间2、石蜡油封藏法 方法：斜面或半固体接种 培养 加无菌液蜡高出培养 基1cm415保藏 措施：低温，隔氧 适用：不能利用石油的各大类 保藏期：12年优点：简便,3、砂土管保藏法 方法：孢子或芽孢悬液 加入无菌砂土管中 干燥 封口 保藏 措施：无营养，缺氧，干燥 适用：产孢子（芽孢）微生物 保藏期：110年4、冷冻干燥保藏 方法：菌种培养 用保护剂悬浮 加入安醅管中低温冻结（-25-40）抽真空（至0.01mmHg） 真空封口 检查真空度 保藏 措施：低温、干燥，缺氧，有保护剂 适用：各大类 保藏期：515年或更长,5、甘油悬液低温冷冻保藏法 方法：菌种培养 1530%甘油缓冲液悬浮 加入保藏管中 置 -70冰箱保藏措施：低温（-70）、保护剂（1550%甘油）适用：细菌、酵母菌保藏期：约10年 6、液氮保藏法方法：菌种培养 保护剂悬浮 加入保藏管中 置液氮瓶中 措施：超低温（-196）、保护剂 适用：各大类保藏期：15年,
