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1、第 七 章 微生物的遗传变异和育种,遗传：,亲代与子代相似,变异：,亲代与子代、子代间不同个体不完全相同,遗传（inheritance）和变异（variation）是生命的最本质特性之一,遗传型：,表型：,生物的全部遗传因子所携带的遗传信息,具有一定遗传型的个体，在特定环境条件下通过生长发育所表现出来的外表特征和内在特征的总和。,表型是由遗传型所决定，但也和环境有关。,表型饰变：,表型的差异只与环境有关特点：暂时性、不可遗传性、表现为全部个体的行为,遗传型变异（基因变异、基因突变）：,遗传物质改变，导致表型改变特点：遗传性、群体中极少数个体的行为（自发突变频率通常为10-6-10-9）,粘质沙
2、雷氏菌25C的斜面培养基；37C的斜面培养基；25C的液体培养基；37C的液体培养基.,第一节 遗传变异的物质基础,一、三个证明DNA是遗传物质的经典实验（一） 经典转化实验肺炎链球菌： S型（菌体具荚膜，菌落表面光滑，有 致病能力） R型（菌体无荚膜，菌落表面粗糙，无 致病能力）,小鼠注入活的S型菌株，小鼠死亡，说明S型菌株有致病性。,1928年，F.Griffth作了3组实验:,1、动物试验,小鼠注入活的R型菌株，小鼠存活，说明R型菌株不具有致病性。,小鼠注入热致死的S型菌株，小鼠存活，说明热致死的S型菌株不具有致病性。,说明R型菌株和S型菌株之间有转化现象。,小鼠注入活的R型菌株和热致死
3、的S型菌株，小鼠死亡。,实验证明，R菌和S菌之间有转化现象,2、细菌培养实验,3、S型菌的无细胞抽提液试验,以上实验说明：加热杀死的S型细菌细胞内可能存在一种转化物质，它能通过某种方式进入R型细胞使其转变为S型细胞。,热死S菌不生长活 R菌长出R菌热死S菌+活R菌长出大量R菌和10-6S菌,活R菌+S菌无细胞抽提液长出大量R菌和少量S菌,平皿培养,肺炎链球菌,1944年，Avery精确重复了转化实验，确定了转化因子,实验证明，将R菌转化为S菌的转化因子是DNA,加S菌DNA加S菌DNA及DNA酶以外的酶加S菌的DNA和DNA酶加S菌的RNA加S菌的蛋白质加S菌的荚膜多糖,活R菌,长出S菌,只有
4、R菌,只有S型细菌的DNA才能将R型转化为S型,（二）噬菌体感染实验（A. D. Hershey和M. Chase）,以32P标记核酸做噬菌体感染实验,（1）含32P-DNA的一组：放射性85%在沉淀中,上清液中含15%放射性,沉淀中含85%放射性,沉淀中含25%放射性,以35S标记蛋白质外壳做噬菌体感染实验,（2）含35S-蛋白质的一组：放射性75%在上清液中,上清液中含75%放射性,证明遗传物质是DNA而不是蛋白质,（三）植物病毒重建实验,实验证明，在RNA病毒中遗传物质是RNA,通过三个具有历史意义的经典试验证明：只有核酸才是负载遗传信息的真正物质。,二、遗传物质在微生物细胞内存在的部位
5、和方式（一）遗传物质在7个水平上的形式1、细胞水平2、细胞核水平3、染色体水平4、核酸水平5、基因水平6、密码子水平7、核苷酸水平,（二）原核生物的质粒,1、定义质粒（plasmid）：凡游离于原核生物核基因组以外，具有独立复制的能力的小型共价闭合环状的dsDNA分子。质粒所含的基因对宿主细胞一般是非必需的；在某些特殊条件下，质粒有时能赋予宿主细胞以特殊的机能，从而使宿主得到生长优势。,2、结构特点通常以共价闭合环状简称CCC)的超螺旋双链DNA分子存在于细胞中；质粒分子的大小范围从1kb左右到1000kb； （细菌质粒多在10kb以内）,1 SC构型:共价闭合环形DNA（cccDNA)2 O
6、C构型:开环DNA（ocDNA)3 L构型:线形分子（LDNA）,质粒DNA分子具有三种不同的构型：,在琼脂糖凝胶电泳中，不同构型的同一种质粒DNA，电泳迁移速度不同。超螺旋线形开环,3、质粒的类型,严谨型质粒(stringent plasmid)：复制行为与核染色体的复制同步，低拷贝数松弛型质粒(relaxed plasmid)：复制行为与核染色体的复制不同步，高拷贝数,窄宿主范围质粒(narrow host range plasmid)（只能在一种特定的宿主细胞中复制）,广宿主范围质粒(broad host range plasmid)（可以在许多种细菌中复制）,4、质粒在基因工程中的应用
7、质粒的优点：（1）相对分子量小，易分离和操作（2）环状，稳定（3）独立复制（4）拷贝数多（5）存在标记位点，易筛选,E. coli的pBR322质粒,5、质粒的检测,提取所有胞内DNA后电镜观察；,超速离心或琼脂糖凝胶电泳后观察；,对于实验室常用菌，可用质粒所带的某些特点， 如抗药性初步判断。,6、质粒的主要种类,质粒所编码的功能和赋予宿主的表型效应,致育因子（Fertility factor，F因子）抗性因子（Resistance factor，R因子）Col质粒（colicin plasmid）Ti质粒（tumor inducing plasmid）Ri质粒（rot inducing pl
8、asmid） 降解性质粒（degradative plasmid)Mega质粒（mega plasmid）,第二节 基因突变和诱变育种,一、基因突变 指细胞内（或病毒粒内）遗传物质的分子结构或数量突然发生的可遗传的变化，可自发或诱导产生。,基因突变,狭义：点突变广义：基因突变和染色体畸变,野生型（原始性状）,基因突变,突变型（新性状）,（一）突变类型,1、根据突变的原因分为,自发突变,诱发突变,2、根据突变株的 表型分为,营养缺陷型,抗性突变型,条件致死突变型,选择性突变株,非选择性突变株,形态突变型,抗原突变型,产量突变型,（二）突变率某一细胞在每一世代中发生某一性状突变的几率。 （三）基因
9、突变的特点 1、自发性 2、不对应性 3、稀有性 4、独立性 5、可诱变性 6、稳定性 7、可逆性,（四）基因突变及其机制,基因突变,自发突变,诱发突变,点突变,转换：AG T C,颠换：A T A C G C C T,碱基置换,移码突变,缺失：ABC ABABCA.,添加: ABC ABCABCA.,染色体畸变,缺失:abc ghijkl,添加,重复:abc abc def插入:abc pqr def,易位（转座）abc pqr ghi.,倒位:abc fed ghi.,1、诱发突变：是通过人为的方法,利用物理、化学和生物的因素显著提高突变频率的作法.（1）碱基的置换,包括转换和颠换,碱基的
10、置换引起的突变,同义突变 ：密码子虽然改变，然而所编码的氨基酸还是原来的氨基酸，那么这一密码子称为同义密码子，这样的突变为同义突变或沉默突变。它对该蛋白质的功能没有影响.,无义突变：由于某一碱基的替换，使原来编码某一氨基酸的密码子突变成为终止密码子UAA、UGA、UAG中的一种，致使肽键的合成提前终止，肽键缩短，成为没有活性的多肽片段。,错义突变：在基因中由于碱基对的替换，使mRNA分子中编码某一氨基酸的密码子变成编码另一氨基酸的密码子。,酪氨酸,酪氨酸,天冬氨酸,（2）移码突变：指诱变剂会使DNA序列中的一个或少数几个核苷酸发生增添（插入），从而使该处后面的全部遗传密码的阅读框架发生改变，并
11、进一步引起转录和翻译错误的一类突变。,（3）染色体畸变：某些强烈理化因子（电离辐射和烷化剂、亚硝酸）等引起的DNA分子的大损伤。包括:缺失、重复、插入、易位、倒位,2、自发突变：是指生物体在无人为干预下自然发生的低频率突变.原因： （1）背景辐射和环境因素（2）有害产物积累（3）碱基错配（4）由转座子引起的插入或缺失,（五）紫外线对DNA的损伤及其修复,嘧啶,嘧啶二聚体,UV,1、光复活作用,嘧啶二聚体,嘧啶,光解酶,黑暗,光照,2、切除修复,1、由核酸内切酶切开二聚体的5末端，形成3-OH和5-P的单链缺口2、核酸外切酶从5-P到3-OH方向切除二聚体，并扩大缺口。3、DNA聚合酶以另一条互
12、补链为模板，从原有链上暴露的3-OH端起合成缺失片段。4、连接酶将新合成的3-OH与原有的5-P相连接。,3、重组修复,这是一种越过损伤而进行的修复，通过复制后，经染色体减缓，使子链上的空隙并不为不再对着嘧啶二聚体，而是面对正常的单链，在这种情况下，DNA聚合酶和连接酶便能起作用，把空隙部分进行修复。,4、SOS修复,是一种旁路系统，它允许新生的DNA链越过嘧啶二聚体而生长。,二、突变与育种（一）自发突变与育种： 从生产中选育 定向培育优良菌株（二）诱变育种1、诱变育种的基本环节,2、诱变育种的原则（1）使用简便有效的诱变剂,诱变剂,物理因素,化学因素,紫外线激光离子束X射线r射线快中子,烷化
13、剂（NTG）碱基类似物吖啶化合物,（2）选用优良的出发菌株（3）处理单细胞或单孢子悬浮液（4）使用最佳诱变剂量（5）充分利用复合处理协同效应（6）利用和创造形态、生理与产量间的相关指标（7）设计高效率筛选方案（8）创造新型、高效筛选方法,3、诱变育种的基本过程：,选择合适的出发菌株制备待处理的菌悬液诱变处理筛选保藏和扩大试验,出发菌株的选择：,出发菌株用来育种处理的起始菌株, 出发菌株应具备： 对诱变剂的敏感性高； 具有特定生产性状的能力或潜力；, 出发菌株的来源； 自然界直接分离到的野生型菌株： 历经生产考验的菌株： 已经历多次育种处理的菌株：,2）制备细胞悬液,要求： 菌体处于对数生长期，
14、并使细胞处于同步生长； 细胞分散且为单细胞,方法： 玻璃珠打散10-15min; 加.3%吐温80（表面活性剂） 用无菌脱脂棉过滤。,制备： 物理诱变剂生理盐水（0.85%NaCl) 化学诱变剂缓冲液,浓度： 细菌、放线菌 108个/ml 霉菌、酵母菌 106个/ml,诱变处理：诱变剂的作用： 提高突变的频率 扩大产量变异的幅度 使产量变异朝着正突变或负突变移动选择诱变剂的种类：在选用理化因子作诱变剂时，在同样效果下，应选用最方便的因素；而在同样方便的情况下，则应选择最高效的因素。在物理诱变剂中，尤以紫外线为最方便，而在化学诱变剂中，一般可选用诱变效果最为显著的“超诱变剂”，如NTG。,菌种筛
15、选,实际工作中，为了提高筛选效率，往往将筛选工作分为初筛和复筛两步进行。初筛的目的：删去明确不符合要求的大部分菌株，把生产性状类似的菌株尽量保留下来，使优良性状的菌株不至于漏网；因此，初筛工作以量为主，测定的精确性还在其次；初筛手段应尽可能快速、简单。复筛的目的：确认符合要求的菌株；复筛以质为主，应精确测定每个菌株的生产指标。,筛选是最为艰难的也是最为重要的步骤.,定义：两个独立基因组内的遗传基因，通过一定的途经转移在一起，形成新的稳定基因组的过程称为基因重组或遗传重组。作用：重组可使生物体在未发生突变的情况下，也能产生新遗传型的个体。,第三节 基因重组和杂交育种,一、原核生物的基因重组（一）
16、转化 受体菌直接摄取供体菌的DNA片段，而获得后者部分遗传性状的的现象，称为转化。,供体菌,受体菌,DNA片段,1928年，Griffith发现肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）的转化现象,目前已知有二十多个种的细菌具有自然转化的能力,1、建立了感受态的受体细胞感受态细胞：具有摄取外源DNA能力的细胞 自然感受态的出现是细胞一定生长阶段的生理特性，受细菌 自身的基因控制； 人工感受态则是通过人为诱导的方法，使细胞具有摄取DNA的 能力，或人为地将DNA导入细胞内2、外源游离DNA分子（转化因子）,进行自然转化，需要二方面必要的条件：,转化过程（革兰氏阳性菌的转化模型
17、）,指用提纯的病毒核酸（ DNA或RNA）去感染其宿主细胞或其原生质，可增殖出一群病毒的后代，这种现象称为转染（transfection）。,转染(transfection)：,（二）细菌的转导（transduction）,以缺陷噬菌体为媒介，将供体细胞的DNA片段携带到受体细胞中，通过交换与整合，从而使后者获得前者部分遗传性状的现象，称为转导。,细菌转导的类型：,普遍转导,局限转导,完全普遍转导流产普遍转导,低频转导高频转导,溶源转变,（三）接合(conjugation),通过细胞与细胞的直接接触而产生的遗传信息的转移和重组过程,1946年，Joshua Lederberg Edward L
18、.Taturm细菌的多重营养缺陷型杂交实验,中间平板上长出的原养型菌落是两菌株之间发生了遗传交换和重组所致。,（四）原生质体融合,通过人为的方法，使遗传性状不同的两个细胞的原生质体进行融合，即以获得兼有双亲遗传性状的稳定重组子,（一）有性杂交一般指不同遗传型的两性细胞间发生的接合和随之进行的染色体重组，进而产生新遗传型后代的一种育种技术。,细胞（ ）细胞（）,有性接合 染色体重组 新遗传型,能产生有性孢子的酵母菌、霉菌和蕈菌都可以进行有性杂交,二、真核微生物的基因重组,主要有：有性杂交、准性杂交、原生质体融合和遗传转化,（二）准性杂交同种生物的两个不同的体细胞发生融合，以有丝分裂的方式而导致低
19、频率的基因重组并产生重组子的杂交方式。,细胞（ ）细胞（）,准性接合 基因重组 新遗传型,菌丝联结 质配 核配 有丝分裂交换 单倍体杂合子,半知菌的准性生殖,第四节 基因工程,特点：可设计性、稳定性、远缘性、风险性,一、基因工程的概念和特点,定义：是指人们利用分子生物学的理论和技术，自觉设计、操纵、改造和重建细胞的遗传核心-基因，从而使生物体的遗传性状发生定向变异，以最大限度地满足人类活动的需要。,获得目的基因选择基因载体体外重组外源基因导入（细菌、植物、动物、基因枪）筛选和鉴定 工程菌或工程细胞的大规模培养,二、基因工程的基本操作,第五节 菌种的衰退、复壮和保藏,性状稳定的菌种是微生物学工作
20、最重要的基本要求，否则生产或科研都无法正常进行。影响微生物菌种稳定性的因素：a）变异；b）污染； c）死亡。,一、菌种的衰退与复壮,菌种衰退的原因：大量群体中的自发突变,纯菌种,自发突变,不纯菌种,突变个体,传代增殖,原始个体,衰退菌种,衰退：菌种出现或表现出负变性状,菌种衰退的具体表现：1、原有的形态、性状变得不典型了2、生长速度变慢，产生孢子变少3、代谢产物生产能力下降4、致病菌对宿主的侵袭力的下降5、对外界不良条件包括低温、高温等抵抗力下降,1）从衰退的菌种群体中把少数个体再找出来，重新获得具有原有典型性状的菌种。 a）纯种分离； b）通过寄主体进行复壮； c）淘汰已衰退的个体,2）有意
21、识地利用微生物会发生自发突变的特性，在日常的菌种维护工作中不断筛选“正变”个体。,菌种的复壮：,二、防止衰退的措施1）减少传代次数；2）创造良好的培养条件；3）利用不易衰退的细胞后代4）采用有效的菌种保藏方法；,基本方法,培养基传代培养（斜面、平板）,寄主传代培养,低温（液氮、低温冰箱）,干燥（沙土管、真空干燥）,生活态休眠态,三、菌种保藏,目的：在一定时间内使菌种不死、不变、不乱，以供研究、生产、交换之用,基本原则：1、挑选典型菌种的优良纯种2、尽量使用分生孢子、芽孢等休眠体3、创造有利于休眠的保藏环境（如干燥、低温） 4、尽可能多的采用不同的手段保藏一些比较重要的微生物菌株,遗传变异和育种
22、,物质基础：DNA或RNA,存在的部位和方式,质粒,定义,构型,优点,种类,基因突变：定义和特点以及分类,遗传,变异和育种,DNA损伤的修复机制,诱变育种的原则,诱变育种的基本过程,知识结构,基因重组和杂交育种,原核生物的基因重组,真核微生物的基因重组,基因工程,概念,基本操作,菌种的衰退、复壮和保藏,1、已 知 DNA 的 碱 基 序 列 为 CATCATCAT， 什 么 类 型 的 突 变 可 使 其 突 变 为：CTCATCAT ( ) A.缺 失 B. 插 入 C.颠 换 D.转 换2、已 知 DNA 的 碱 基 序 列 为 CATCATCAT， 什 么 类 型 的 突 变 可 产 生
23、 如 下 碱 基 序 列 的 改 变：CACCATCAT ？( )A. 缺 失 B. 插 入 C. 颠 换 D. 转 换3、不 需 要 细 胞 与 细 胞 之 间 接 触 的 基 因 重 组 类 型 有( )A. 接 合 和 转 化 B. 转 导 和 转 化C. 接 合 和 转 导 D. 接 合4、转 化 现 象 不 包 括 ( )A. DNA 的 吸 收 B. 感 受 态 细 胞 限 制 修 饰 系 统 D. 细 胞 与 细 胞 的 接 触 5、以 下 碱 基 序 列 中 哪 个 最 易 受 紫 外 线 破 坏？A. AGGCAA B. CTTTGAC. GUAAAU D. CGGAGA,6
24、、一 个 大 肠 杆 菌 (E.coli) 的 突 变 株， 不 同 于 野 生 型 菌 株， 它 不 能 合 成 精 氨 酸， 这 一 突 变 株 称 为：A. 营 养 缺 陷 型 B. 温 度 依 赖 型C. 原 养 型 D.抗 性 突 变 型7、在 普 遍 性 转 导 中， 同 源 DNA 分 子 的 交 换 要 求：转 座 子 B. 插 入 序 列C. DNA 链 的 断 裂 和 重 新 连 接反 转 录8、抗药性质粒（R因子）在医学上很重要是因为它们：（ ）A.可引起某些细菌性疾病 B.携带对某些抗生素的特定抗性基因 C.将非致病细菌转变为致病菌 D.可以将真核细胞转变为癌细胞9、证
25、明核酸是遗传物质的三个经典实验是_、_和_；而证明基因突变自发性和不对应性的三个经典实验又是_、_和_。10、质粒根据分子结构可有_、_和_三种构型,1、细胞水平真核微生物：细胞核原核微生物：核区细胞核或核区的数目在不同的微生物中是不同的,2、细胞核水平真核生物 细胞核 核染色体原核生物 核区 DNA链,核基因组,在核基因组之外，还存在各种形式的核外遗传物质,3、染色体水平染色体是由组蛋白与DNA构成的线状结构染色体的数目在不同的生物中是不同的染色体的倍数在同一生物的不同生活时期是不同的,4、核酸水平核酸种类：DNA，RNA核酸结构：双链、单链； 环状，线状，超螺旋状DNA长度：因种而异,5、
26、基因水平,基因是生物体内一切具有自主复制能力的最小遗传功能单位,6、密码子水平,7、核苷酸水平核苷酸是最小突变单位和交换单位,（1）致育因子(Fertility factor，F因子),又称F质粒，其大小约100kb，决定性别并有转移能力,携带F质粒的菌株称为F+菌株（相当于雄性）无F质粒的菌株称为F-菌株（相当于雌性）。,存在状态,游离状态(F+),与染色体相结合的 (Hfr),（2）抗性因子（Resistance factor，R因子）,包括抗药性和抗重金属二大类，简称R质粒。抗性质粒在细菌间的传递是细菌产生抗药性的重要原因之一。,R质粒,抗性转移因子（RTF）：转移和复制基因抗性决定因子
27、：抗性基因,R100质粒(89kb)可使宿主对下列药物及重金属具有抗性：汞（mercuric ion ，mer）磺胺(Sulfonamide, Sul)、链霉素(Streptomycin, Str)、夫西地酸（fusidic acid，fus）、氯霉素(Chlorampenicol, Cml)、四环素（tetracycline，tet ）并且负责这些抗性的基因是成簇地存在于抗性质粒上。,大肠菌素是一种细菌蛋白，只杀死近缘且不含Col质粒的菌株，而宿主不受其产生的细菌素的影响。,（3） Col质粒（大肠杆菌素质粒）,（4）诱癌质粒（Ti质粒）,是引起双子叶植冠瘿瘤的致病因子。是一种200kb的环
28、状质粒。包括：毒性区、接合转移区、复制起始区和T-DNA区4部分,（5） Ri质粒（rot inducing plasmid,是在发根土壤杆菌细胞中存在的一种染色体外自主复制的环形双链DNA分子。可侵染双子叶植物的根部，幷诱生大量毛状的不定根。,在实践中成为外源基因的良好载体,（6）降解性质粒（degradative plasmid),将复杂的有机化合物降解成能被其作为碳源和能源利用的简单形式，环境保护方面具有重要的意义。,只存在于假单胞菌属,具有降解一些有毒化合物，如芳香簇化合物(苯)、农药、辛烷和樟脑等的能力。,（7） mega质粒（mega plasmid）巨大质粒,根瘤菌属中存在的与共
29、生固氮有关的大型质粒，分子量为2310 8.,基因突变自发性和不对应性的实验证明,三个经典实验变量实验涂布实验影印实验,证明突变是自发产生的，并且突变的性状与引起突变的原因间无直接对应关系。,变量实验（fluctuation analysis）Salvador Luria and Max Delbruck（1943）,Salvador Luria,Max Delbruck,The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1969,变量实验（fluctuation analysis）,Newcombe的涂布实验（1949）,影印实验（replica plati
30、ng ）Joshua Lederberg and Esther Lederberg（1952）,Joshua Lederberg,J. Lederberg is awarded the Noble Prize in Medicine and Physiology in 1958,1、普遍转导,噬菌体可以转导供体菌染色体的任何部分到受体细胞中的转导过程,普遍性转导的三种后果：,外源DNA被降解，转导失败。,完全普遍转导,流产转导,普遍转导,2、局限转导,指通过部分缺陷的温和噬菌体把供体菌的少数特定基因携带到受体菌中,并获得表达的转导现象。,局限转导与普遍转导的主要区别：,a）局限转导中被转导的基因共价地与噬菌体DNA连接，与噬菌体DNA一起进行复制、包装以及被导入受体细胞中。而普遍性转导包装的可能全部是宿主菌的基因。,b）局限性转导颗粒携带特定的染色体片段并将固定的个别基因导入受体，故称为局限性转导。而普遍性转导携带的宿主基因具有随机性。,是一个与转导相似又不同的现象,温和噬菌体感染细胞后使之发生溶源化，因噬菌体的基因整合到宿主染色体上，而使后者获得了新性状的现象,3、溶源转变,复制子限制性内切酶位点 选择性遗传标记可大量增殖,载体的特性,常用载体,原核受体细胞： 松弛型细菌质粒、噬菌体真核细胞受体： SV40病毒（动物）、Ti质粒（植物）,
