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1、第三节免疫检测技术的基本原理,抗原、抗体反应的原理，利用已知的抗原检测未知的抗体或利用已知的抗体检测未知的抗原 .将免疫反应与现代测试技术结合超微量的检测,免疫学检测技术的优点,高度的灵敏性高度的特异性,免疫分析技术的应用,常用的诊断技术 血凝试验 酶联免疫吸附试验 胶体金免疫技术 放射免疫分析技术,凝集试验,概念：颗粒性抗原(细菌、红细胞等)与相应抗体结合，在一定条件下出现肉眼可见的凝集物，称为凝集反应。1.直接凝集反应抗原与抗体直接混合作用，出现凝集为阳性结果。玻片直接凝集法：定性试验试管直接凝集法：半定量试验,试管法半定量试验,2.间接凝集法,先将可溶性抗原或抗体吸附在颗粒载体上(如RB
2、C, 乳胶颗粒)，再与相应抗体或抗原反应，出现凝集为阳性结果。临床常用的有间接血凝试验、乳胶凝集试验等。,待检样品,抗原吸附血球或乳胶颗粒,反应凝集物,3.间接凝集抑制试验,先将待检抗原与已知的抗体反应，再加入用已知抗原吸附的载体颗粒，不出现凝集为阳性结果。,例：乳胶凝集抑制试验检测HCG (妊娠诊断),步骤1：将已知抗体与待检标本混匀,步骤2：加入抗原吸附的乳胶颗粒混匀,抗原吸附乳胶颗粒,结果判断：,不凝集为阳性结果,已知抗体,待检标本,凝集反应,2.沉淀反应,概念：可溶性抗原与相应抗体结合后出现沉淀物称沉淀反应。,类型：单向免疫扩散,免疫比浊法,双向免疫扩散,对流免疫电泳,单向琼脂扩散试验
3、,双向琼脂扩散试验,对流免疫电泳,测吸光度计算抗原或抗体的含量,抗体,抗原,免疫复合物的浓度与透射光的衰减呈正相关,免疫比浊法原理,3.中和反应 如抗“O”试验,4.免疫标记技术,概念：用荧光素、酶、同位素等标记抗体或抗原用以测定相应抗原或抗体的技术称为免疫标记技术。常用方法有免疫荧光技术、酶免疫技术、放射免疫检测技术等。 特点：敏感、特异、快速，能定性、定量、定位。,免疫标记技术,酶免疫标记技术荧光免疫分析技术放射免疫分析技术免疫金标记技术,酶联免疫吸附试验,1971年瑞典学者Engvail和Perlmann,荷兰学者Van Weerman和Schuurs分别报道将免疫技术发展为检测体液中微
4、量物质的固相免疫测定方法，即酶联免疫吸附测定法 (enzyme-linked immunosorbent assay , ELISA),酶及其底物 酶结合物是酶与抗体或抗原, 半抗原在交联剂作用下联结的产物。是ELISA成败的关键试剂，它不仅具有抗体抗原特异的免疫反应，还具有酶促反应，显示出生物放大作用，但不同的酶选用不同的底物 ，将得到不同的颜色反应.,2、标记方法 戊二醛交联法 过碘酸盐氧化法,戊二醛交联法 (一步法）,抗体-NH2 + COH-（CH2）3-COH + NH2-酶,抗体-NH2 =CH-（CH2）3-CH = NH2-酶,抗体-NH2 =CH-（CH2）3-CH = NH
5、2-抗体,酶-NH2 =CH-（CH2）3-CH = NH2-酶,戊二醛交联法（二步法）,COH-（CH2）3-COH + NH2-酶,抗体-NH2 + CHO-（CH2）3-CH = NH2-酶,抗体-NH2 =CH-（CH2）3-CH = NH2-酶,过碘酸盐氧化法,NaIO4,O,O,OH,+ NH2抗体,O,O,O,N,N,抗体,抗体,H2O,N,抗体,NaBH4,Schiff碱,酶-五炭糖环,标记免疫物的分离与鉴定,1、分离 目的：去除游离酶 方法：盐析、柱层析2、鉴定 抗体活性 酶活性 标记物纯度,ELISA的种类和变化,（一）双抗体夹心法（二）间接法（三）竞争法 （四）双位点一步
6、法（五）捕获法测IgM抗体（六）应用亲和素和生物素的ELISA,（一）双抗体夹心法,此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原,获得待分析物的未标定抗体,将特异性抗体与固相载体连接形成固相抗体,洗涤除去未结合的抗体及杂质,加入封闭蛋白溶液以封闭载体表面残留的蛋白结合位点,洗涤并除去未结合的封闭蛋白,加受检标本（抗原）形成固相抗体抗原复合物,洗涤除去其他未结合的物质,加酶标抗体生成抗体待测抗原酶标记抗体的复合物,彻底洗涤未结合的 酶标抗体,加底物进行酶催化反应,根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量测定,间接法是检测抗体最常用的方法，其原理为利用酶标记的抗抗体以检测已与固相结合的受检抗体，故称为间接
7、法。,（二）间接法,酶联免疫吸附试验(ELISA-间接法),包被固相载体: 用已知抗原包被固相载体,加待检标本: 使相应抗体与固相抗原结合洗涤，除去无关的物质,加酶标抗抗体:与固相载体上抗原抗体复合物结合；洗涤，除去未结合的酶标抗抗体,加底物显色,根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量测定,（三）竞争法,此法可用于抗原和半抗原的定量测定，也可用于测定抗体 。,用已知特异性抗体包被固相载体,测定管加待测抗原和一定量的酶标抗原使二者与固相抗体竞争结合,对照管只加一定量酶标抗原与固相抗体直接结合,分别洗涤除去未结合的成分,加底物显色,分别测定两管的吸光度值，根据对照管与测定管吸光度值之比， 计算标
8、本中待测抗原含量,对照管由于只加酶标抗原，与固相抗体充分结合，故分解底物显色深；测定管的显色程度则随待测抗原和酶标抗原与固相抗体竞争结合的结果而异。如待测抗原量多，竞争性地抑制酶标抗原与固相抗体结合，使固相上结合的酶标抗原量减少。因此，加入底物后显色反应较弱。,饲料中盐酸克伦特罗的测定 饲料中毒素的测定（主要包括黄曲霉毒素， 简曲霉毒素 ） 饲料中有害微生物的快速筛检 （如沙门氏菌 ）,甲胺磷残留分析 甲基对硫磷残留分析 呋喃丹残留分析,ELISA在饲料安全检测中的应用,ELISA用于农药残留的检测,河豚毒素,植物毒素如罌粟硷、吗啡、藻类毒素,苯并芘,主要有除草剂与杀虫剂两大类 例如杀暝松（
9、FN ）、 甲氟磷酸异已酶（ SOMAN ）、 草不绿（ Alachor ）、 西维因（ Carbaryl ）、 多菌灵及克菌丹（ Captan ）等。,农药的检测：,食源性病原菌检测试剂盒,大肠杆菌检测 沙门氏菌检测 单增李斯特菌 金黄色葡萄球菌,转基因成份的检测：如转基因玉米中中的cry9e蛋白转基因大豆中的CP4 EPSPS蛋白质肉制品的掺假检测： 以辣根过氧化物酶标记不同动物肌肉和血清球蛋A抗血清检查牛肉、马肉、猪肉、羊肉和驼肉检测14种畜禽熟肉制品，包括牛肉、羊肉、鹿肉和马肉等，在掺假率为1%时即可检出,食品其他检测：,荧光抗体技术的原理与方法,用荧光素标记抗原或抗体，再与标本中抗体
10、或抗原反应，然后在荧光显微镜下观察，形成的IC可散发出荧光，对标本中的抗原或抗体进行测定和定位。常用的荧光素异硫氰酸荧光素(FITC)、藻红蛋白(PE)等。常用的方法直接荧光法间接荧光法,免疫荧光技术,免疫荧光技术直接法,免疫荧光技术间接法,免疫荧光技术,荧光显微镜,荧光显微镜使用原理,激发滤片（BG）,吸收滤片（OG）,标本,FITC吸收光峰值：490-495nm FITC发射光峰值：520-530nmBG：325-500 OG：410-650,免疫金标记技术,免疫金标记技术(Immunogold labelling techique) 主要利用了金颗粒具有高电子密度的特性，在金标蛋白结合处
11、，在显微镜下可见黑褐色颗粒，当这些标记物在相应的配体处大量聚集时，肉眼可见红色或粉红色斑点，因而用于定性或半定量的快速免疫检测。这一反应也可以通过银颗粒的沉积被放大，称之为免疫金银染色（immunogold silver staining，IGSS）。,一、胶体金制备,胶体金（colloidal gold）的制备一般采用还原法，常用的还原剂有柠檬酸钠、鞣酸、抗坏血酸、白磷、硼氢化钠等。向一定浓度的金溶液内加入一定量的还原剂使金离子还原成金原子，形成金颗粒悬液，也称金溶胶（gold solution）。,胶体金的制备及特性,*还原100 ml0.01%HAuCl4 所需量,胶 体 金（Collo
12、idal Gold）1560 nm,优 质,劣 质,胶体金结合物（Conjugate）,一、免疫渗滤测定(IFA),斑点渗漏法,其原理与层析法相类同，中心圆点为一株单抗，边上小点为抗鼠二抗。先将待测样品滴在其中，若有抗原即被结合在中心圆点，洗去未结合抗原，再滴加金标另一株单抗，若有抗原则形成金-Ab-Ag薄膜的红色斑点，而边上是金-Ab-Ab2薄膜的质控点，是为金标二步法。,IFA双抗体夹心法测抗原,IFA结果判断,二、免疫层析测定（ ICA ）,层析法,将金标的一株单抗吸附于下端的玻璃纤维纸上，浸入尿液，此金标单抗即被溶解，并随尿液上行，若尿中有相应抗原，既形成Ag-Ab-金复合物，当上行至
13、中段醋酸纤维薄膜，即与下端的另一株单抗结合并被固定下来，显示阳性结果。其上方还有一条抗鼠二抗，待红色金标单抗上行此处即被固定下来，作为金标单抗质控的提示。此种方法称金标一步法。,兔抗鼠IgG,鼠抗HCG单抗,金标鼠抗HCG单抗,尿液浸湿标志线,手持端,斑点金免疫层析试验（一）,斑点金免疫层析试验（二）,尿样,阳性,弱阳性,阴性,无效,质控线,测试线,ICA双抗体夹心法测抗原,ICA- 竞争法测抗原,免疫层析试验竞争法测小分子抗原原理图,ICA 竟争法结果观察,阴性,阳性,无效,ICA间接法测抗体,ICA 结果观察,阳性,阴性,无效,IFA与ICA的比较,IFA 穿流（FLOW THROUGH）
14、ICA 横流（LATERAL FLOW）,1、 罗立新, 缪珑, 潘力, 等. 快速检测产单核李斯特菌免疫胶体金层析法的研究J. 中国卫生检验杂志, 2006, 16(2): 154-156.2、 赖卫华, 熊勇华, 陈高明, 等. 应用胶体金试纸条快速检测赭曲霉毒素A的研究J. 食品科学, 2005, 26(5): 204-207.,3、 谌志强, 段惠莉, 王新为, 等. 大肠埃希菌O157:H7的胶体金免疫渗滤法检测J. 中国公共卫生, 2005, 21(4): 705-706.4、 谢昭聪, 宋志强, 吕敬章, 等. 应用胶体金免疫层析法检测水产品中霍乱弧菌的研究J. 中国国境卫生检疫
15、杂志, 2005, 28(3): 163-165.,5、 王中民, 李君文, 王新为, 等. 免疫金渗滤试验检测食品中沙门氏菌的研究J. 微生物学免疫学进展, 2001, 29(4): 45-47. 6、刘永德, 汪毅, 陈禹雷, 免疫金探针快速检测禽流感病毒研究J. 上海交通大学学报: 农业科学版, 2005, 23(3): 321-324.,斑点金免疫渗滤试验,A,D,C,B,阴性（未怀孕）,阳性（怀孕）,加尿样,除去滤器,加胶体金标记抗体,加洗涤液,结果判定,免疫印迹法图解,SDS裂解病毒,聚丙酰胺凝胶电泳,-,+,95 68 45 12KD,电转印至NC膜上,置待测血清中，漂洗；加酶标
16、抗抗体，漂洗；,加底物 显色,120 41 24KD,第四节 放射性核素标记技术,一、常用标记方法二、标记免疫物的分离与纯化,R：放射性核素示踪高灵敏不直接探测待测物，而探测待测物上的标记信号 (标记物的放大效应)I：免疫学反应高特异废除以往沿用的无机或有机试剂，代之以抗体为结合剂,常用标记方法,1、常用放射性核素2、125I 的标记方法 直接法（氯胺T法） 间接法（连接法）,直接法（氯胺T法）,Na125I 4。C,125I,氯胺T,间接法（连接法）,+ Na125I,氯胺T,125I,NSHPP,间接法（连接法）,CH2,OH,H-C-C-N-蛋白质,H O H,+ NH2-蛋白质,125
17、I,125I,标记免疫物的分离与鉴定,1、分离 目的：去除游离放射性核素 方法：柱层析2、鉴定 游离放射性核素含量 免疫活性 比放射性（mCi/mg）,结合相,游离相,放射免疫分析法的原理与方法,液闪仪,计数器,化学发光标记免疫技术,直接化学发光酶促化学发光特点电化学发光特点,标记免疫分析三方式与四环节,三个方式 A、直接法 B、间接法 C、夹心法四环节为： 1、抗体生产 2、 标记试剂制备 3、 分析方式设计 4、分析信号检测,免疫测定分类,均相免疫测定 HOMOGENOUS IA 在测定中结合的反应物(B)与游离的反应物(F) 不需要分离 异相免疫测定 HETEROGENOUS IA 在测定中需要分离(B)和(F),小结,常用免疫测定方法标记免疫法测定的方法及原理标记免疫测定法的特点ELISA的方法及原理,作业,1、何谓沉淀反应？何谓凝集反应？其抗原有特点？2、抗原抗体反应有何特性？3、抗原抗体反应的影响因素有哪些？4、常用的免疫标记技术有哪些？5、设计一ELISA试验来检测牛奶中黄曲霉毒素M1。,
