《病毒学- 病毒的检验.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《病毒学- 病毒的检验.ppt（105页珍藏版）》请在三一办公上搜索。
1、第四节 病毒的检验,good,常用的病毒检验方法包括：,一、病毒的分离鉴定二、病毒感染性的检测三、病毒颗粒检测四、病毒的血清学检查五、病毒的分子(蛋白和核酸)检测,一、病毒的分离鉴定,病毒的分离与鉴定可为病毒感染提供最为直接的病原学证据，同时可为进一步的病毒学研究提供材料。病毒的分离和鉴定（含义）：指从病人、带毒者、外界环境中采集标本经过适当的处理,采用一系列物理、化学、生物学等手段,将病毒从标本中分离出来,并通过有关特异性方法鉴定属于何种病毒,这一方法称为病毒的分离与鉴定。,病毒的分离与鉴定包括：1、病毒材料的采集与准备 2、病毒的分离与培养3、病毒的形态学观察4、病毒的理化特性测定5、病毒
2、的血清学鉴定及病毒的分子生物学鉴定等基本过程。,（一）标本的采取与送检,病料采集适当与否,直接影响病毒的检测结果。一般可采集发病或死亡动物的组织病料、分泌物或粪便等,主要因动物及病毒的种类而异,例如检测犬细小病毒或轮状病毒,一般应采腹泻幼犬或犊牛的粪便;怀疑为口蹄疫的猪或牛,则应采其水疱液及水疱皮送检。,应注意下列原则：,1.对本身带有杂菌(如咽喉拭子、粪便)或易受污染的标本，要进行病毒分离培养时，应使用抗生素。2.因病毒在室温中易失去活性，标本应低温保存并尽快送检。3.血清学诊断标本的采取应在发病初期和病后23w内各取1份血清，以便对比双份血清抗体效价的动态变化。,标本处理：,采集样本在接种
3、细胞、鸡胚或动物之前,都需要做适当的处理,以保证病毒分离的成功几率。采集的器官或组织样本：如肺脏、脑、肝、脾、淋巴结等,可取一小块进行充分研磨,加入含青、链霉素的Hanks液,离心取上清液作为接种物;鼻液、脓汁、乳汁等分泌物或渗出液、粪便,应加入高浓度的抗生素,充分混匀后,置4冰箱内处理24h或过夜,离心后取上清做接种用;咽喉拭子在取样后应迅速将其浸泡入含有2%小牛血清和一定浓度的青、链霉素的Hanks液中,充分刷洗棉拭子,反复冻融35次,离心后取上清液作为接种材料。,（二）病毒的分离与培养,细胞培养、鸡胚和实验动物可用于病毒的分离与培养,其中细胞培养是用于病毒分离与培养最常用的方法。用于病毒
4、分离与培养的细胞有原代细胞、二倍体细胞株和传代细胞系,一般说来,本动物的原代细胞最为敏感,但不如传代细胞方便易得.例如猪传染性胃肠炎病毒初次分离最好用猪甲状腺原代或二倍体细胞,但该细胞生长缓慢,通常用PD5(猪甲状腺细胞系)取代。培养方法常用的有静置培养和旋转培养,有的病毒如轮状病毒,初次分离时旋转培养的成功率较静置培养高。,1、病毒的分离,不同的病毒分离时采用不同的分离方法,这主要取决于目的病毒的生物学特性。主要有细胞培养法、鸡胚接种法、动物接种法等,而对细胞、鸡胚不敏感,又没有合适动物模型的病毒,可采用基因克隆的方法。,（1）动物接种法,是最原始的病毒培养方法，根据病毒种类不同，选择敏感动
5、物及适宜接种部位，如嗜神经性病毒（狂犬病毒）可接种于小鼠脑内，痘病毒可接种于家兔角膜或皮内。动物的接种途径要根据病毒种类、实验动物种类、接种材料等选择合适的接种途径。动物接种途径的选择正确与否对提高病毒分离成功率也起到重要作用。,常见病毒常用实验动物及接种途径,P37,在动物实验的期间或结束时采集动物血液检测病毒或特异性抗体。实验动物采血分为致死性采血和非致死性采血两种。致死性采血是指尽量采集动物血,直至动物死亡。非致死性采血是指采集一定量的动物血而不致动物死亡。对采血动物,应在禁食24h后采血。采血应无菌操作。不同动物采用不同的采血方法。常用的有心脏采血法、眼眶采血法、颈静脉采血法、颈动脉采
6、血法、耳静脉采血法等。根据实验动物和实验条件灵活选用。,实验动物采血,鸡胚对多种病毒敏感。不同病毒在鸡胚的不同部位的生长特性差异很大,因此选择适当的接种途径是病毒分离成功的关键。一般采用孵化914天的鸡胚，根据病毒种类不同，将病毒标本 接种于鸡胚的不同部位，最常用的鸡胚接种部位有：尿囊腔、绒毛尿囊膜、卵黄囊和羊膜腔等。,（2）鸡胚培养法,是将离体活组织块或分散的组织细胞加以培养的技术总称，为病毒分离鉴定中的最常用的基本方法。,（3）细胞培养(cell culture)法或组织培养法(tissue culture),一般选择生长旺盛的敏感细胞用于病毒分离。少数病毒例外,例如犬、猪等的细小病毒,病
7、毒的复制有赖于分裂旺盛的细胞,因此需将病毒接种与细胞培养同步进行。细胞培养技术在病毒发现、病毒研究、疫苗研制、抗病毒药物筛选等病毒学发展的历程中发挥着重要作用。,常见人类病毒的敏感细胞,P36,P36,（4）分子生物学技术,对体外培养的细胞、鸡胚、动物不敏感的病毒,可采用现代分子生物学技术,如基因克隆技术,对病毒的全基因进行克隆,构建表达载体,并能表达出病毒样颗粒。,（三）病毒的鉴定,步骤：1、初步鉴定2、接种动物的观察3、最终鉴定,1、初步鉴定,(1)根据临床表现、流行病学特征与标本来源。初步判定属于哪一类病毒脑炎患者脑脊液 乙型脑炎病毒秋季腹泻病人粪便轮状病毒发烧小孩（下肢麻痹）粪便脊髓灰
8、质炎病毒,(2)病毒的生物学特性,病毒或接种分离标本后，细胞出现的病理性变化。不同的病毒具有不同的敏感细胞，而又能引起不同的细胞病变效应。例如：上呼吸道标本接种到细胞培养上,出现细胞融合,产生多核巨细胞现象，就要考虑副黏病毒、疱疹病毒、肾综合征出血热病毒、冠状病毒、流感病毒等；接种到WI-38或人胚肺细胞培养上出现散在的、局部堆积的巨大细胞，则要考虑巨细胞病毒的可能性；肠道病毒能使细胞圆缩、变小、分散，往往全部细胞受到破坏；腺病毒能使细胞肿大，颗粒增多，细胞聚集成葡萄状。,细胞病变效应,哪三种现象？,血吸附和血凝作用,有些病毒感染细胞后,细胞膜上可镶嵌着病毒基因编码产生的糖蛋白,其中有些能吸附
9、特定种类的红细胞,或将细胞培养单层刮下后,经过适当处理,可以凝集特定种类的红细胞,此类糖蛋白在细胞表面形成刺突,称为血凝素。如流感病毒、副黏病毒、风疹病毒等感染细胞后可产生血吸附现象,或通过血凝实验来证实病毒的存在。,新城疫病毒能吸附和凝集豚鼠红细胞风疹病毒能吸附和凝集鸽子、绵羊等红细胞病毒的血凝作用往往需要一定的pH和温度,利用血吸附和血凝集现象可以为初步判定属于何种病毒提供重要思路。,例子,干扰现象,一种病毒感染细胞后,可以干扰另一种病毒在该细胞内的增殖,这种现象称为干扰现象。利用干扰现象可以检查出一些不引起细胞病变、血凝、血吸附的病毒。如：鼻病毒就可以利用干扰现象进行初步鉴定。实验组：感
10、染人胚肾细胞管或培养板细胞用人或豚鼠红细胞做血吸附实验,如果阴性,用Hanks液洗涤3次,然后接种仙台病毒,33 培养48h,做血吸附实验。对照组：正常细胞只接种仙台病毒。实验现象：如果对照组血吸附阳性,而实验组阴性,说明先前接种的标本中存在能干扰仙台病毒增殖的病毒,此结果即为干扰试验阳性。,（3）病毒的理化特性测定,包括病毒核酸类型鉴定、耐酸性试验、脂溶剂敏感性试验、耐热性试验、胰蛋白酶敏感性试验等通常以细胞培养或鸡胚培养为观察体系,应设立已知病毒为对照。,病毒的理化特性是病毒鉴定的重要依据,代谢抑制法鉴定病毒核酸类型,病毒核酸类型鉴定是病毒理化特性测定的最主要指标。添加氟脱氧尿核苷(FUD
11、R)或类似物于病毒培养物中,病毒复制被抑制者,即为DNA病毒,否则为RNA病毒,也可用DNA酶或RNA酶分别作用,以判定核酸的性质。绿豆芽酶可降解单股核酸,用它可进一步鉴定核酸是单股或双股。,可直接用纯化的病毒核酸通过电镜观察，对其进行鉴定。但技术要求较高。近年来,PCR核酸测序技术的应用使得病毒核酸型鉴定的可行性大为增加。（观看PCR视频）,脂溶性试验,用乙醚或氯仿处理待检病毒液,而后与未处理者比较其TCID50的变化,以判断是否敏感。乙醚、氯仿、脱氧胆酸钠等脂溶剂能破坏病毒的脂质包膜。有包膜的病毒对脂溶剂敏感,受脂溶剂的处理能使病毒失去感染性;无包膜的病毒往往对脂溶剂有抵抗力。因此,用乙醚
12、等可以鉴定所分离的病毒是否有包膜。,病毒粒的结构模式图,壳粒,衣壳,核心（核样物）,核衣壳,包膜,包膜病毒,包膜子粒,处理方法:,将病毒悬液20003000r/min离心20min,取上清液,分成两组：一组为试验组：按与乙醚4:1的比例振荡混合均匀,管口密封好,4过夜后,20003000r/min离心20min。此时液体分为两层,上层为乙醚,下层为病毒液。吸取下层部分,避免混有乙醚。另一组为对照组：不加乙醚,处理方法同试验组。将两组的病毒液同时测定病毒滴度,如果试验组病毒滴度明显降低,与对照组有明显差异,说明病毒对乙醚敏感,属于有膜病毒。如果两组的病毒滴度没有显著差异,说明病毒对乙醚有抵抗力,
13、属于无膜病毒。,耐酸性试验,耐酸性试验和脂溶剂敏感性试验是最常做的两项理化指标。耐酸性试验设置缓冲液pH为3和7的病毒做比较。通过肠道传播的病毒对酸有抵抗力,借此可鉴别某些病毒。如肠道病毒与鼻病毒同为RNA病毒,肠道病毒对酸有抵抗力,而鼻病毒则没有。,处理方法:,试验组：病毒悬液用0.1mol/L的HCl调pH至3.0,37放置2h后,用5.6%的NaHCO3调pH至7.2对照组：除了不加酸外,其他步骤和试验组相同。将两组同时测定病毒滴度,如果试验组病毒滴度明显降低,与对照组有显著差异,说明病毒对酸敏感,不属于肠道病毒。如果两组的病毒滴度没有显著差异,说明病毒对酸有抵抗力,属肠道病毒。,2、接
14、种动物的观察,根据动物的感染范围,可初步推断属于何种病毒。接种动物的观察是非常重要的,通过观察试验动物的反应有时也可初步鉴定何种病毒。每天都需要观察,有时1d需要观察数次。,观察指标:,动物发病的潜伏期,病毒感染都有一定的潜伏期。因此,潜伏期在病毒的初步鉴定方面也是非常重要的。如乙脑小鼠脑内接种潜伏期一般为4d,狂犬病脑内接种潜伏期一般为68d。接种动物的饮食情况是否有变化,活动与饮食能力是否发生改变,粪便是否有变化。每天在同一时间测量动物的体重和体温,比较接种前后变化情况。观察局部或全身性反应,如出现毛松、软弱无力、震颤、不安、抽搐,甚至死亡等全身症状,可考虑神经系统感染的可能性。对照组不接
15、种病毒,用生理盐水代替,其他步骤和观察指标与试验组完全相同。,3、最终鉴定,病毒的最终鉴定需要免疫学方法、分子生物学方法、电子显微镜与免疫电子显微技术等特异性方法加以鉴定。（1）病毒的血清学鉴定（2）病毒的分子生物学鉴定（3）电子显微镜技术,（1）病毒的血清学鉴定,病毒分离后,可用已知的抗病毒血清或单克隆抗体,对分离毒株进行血清学鉴定,以确定病毒的种类、血清型及其亚型。常用的血清学试验有血清中和试验、血清抑制试验、免疫荧光试验等。此外,可采用一些血清学技术如免疫沉淀技术和免疫转印技术分析病毒的结构蛋白成分。,中和试验,基本原理：特异性的抗病毒免疫血清（即中和抗体）和病毒体表面的抗原结合后,使病
16、毒不能吸附于敏感细胞,或两者结合后抑制了病毒的穿入和/或脱壳过程。因此,病毒就失去了感染的能力。中和试验是以测定病毒的感染力为基础的,试验必须在培养的细胞内,或动物、鸡胚等活体内进行,而且都必须是对病毒敏感的。以病毒受免疫血清中和后的残存感染力为依据,判定中和抗体的滴度。中和试验需要设对照试验。,结果判定的科学依据：,用细胞培养进行试验时,可依据细胞病变情况、蚀斑数量、颜色反应等。用鸡胚进行试验时,可依据鸡胚的死亡数、绒毛尿囊膜斑点数量和特征、血凝素产生情况等;用动物进行试验时,可依据动物死亡数、发病数、出现症状数等。,操作步骤：,中和试验常用的有两种方法：一种是固定病毒数量,一般用100TC
17、ID50的病毒与等量一系列倍比稀释的血清进行中和试验。然后接种于动物、鸡胚或细胞中，用Reed-Muench法计算50%感染的血清中和终点。另一种是固定血清用量与等量一系列对数稀释的病毒进行中和试验。,病毒毒价单位：,半数致死量(LD50)作为毒价测定单位，即经规定的途径，以不同的剂量接种试验动物，在一定时间内能致半数试验动物死亡的剂量。用鸡胚测定时，毒价单位为鸡胚半数致死量(ELD50)或鸡胚半数感染量(EID50)。用细胞培养测定时，用组织细胞半数感染量(TCID50)。在测定疫苗的免疫性能时，则用半数免疫量(IMD50)或半数保护量(PD50)。,病毒毒价的测定（微量法）,(1)病毒的制
18、备将病毒接种于单层细胞，37吸附1h后加入维持液，置温箱培养；逐日观察，待细胞病变（CPE）达75%以上，收获病毒悬液冻融或超声波处理，以3 000r/min离心10min，取上清液，定量分装成1ml小瓶置-70保存备用，选用的病毒必须是对细胞有较稳定的致病力。,(2)病毒毒价测定取置-70冰箱保存的病毒一瓶，将病毒在96孔培养板上作10倍递进稀释即10-1，10-2，10-3，每孔病毒悬液量为50l，每个稀释度作8孔，每孔加入100l细胞悬液，每块板的最后一行设8孔细胞对照，制备细胞悬液的浓度以使细胞在24h内长满单层为度。把培养板置5%CO2温箱37培养，从48h-14d逐日观察细胞病变，
19、记录结果。,中和试验可应用于：,1.病毒株的种型鉴定：中和试验具有较高的特异性，利用同一病毒的不同型的毒株或不同型标准血清，即可测知相应血清或病毒的型，所以中和试验不但可以定属而且可以定型。2.测定血清抗体效价：中和抗体出现于病毒感染的较早期，在体内的维持时间较长。动物体内中和抗体水平的高低，可显示动物抵抗病毒的能力。3.分析病毒的抗原性。,血凝抑制试验,基本原理:某些病毒具有血凝素,能选择性地作用于个别种类的哺乳动物的红细胞表面的受体,病毒附着于细胞而发生凝集反应,称为红细胞凝集现象(简称血凝)。如果将病毒特异性抗体加入病毒或血凝素悬液中,作用一定时间后,由于抗原(血凝素)与抗体发生特异性结
20、合,这种结合妨碍了病毒血凝素对红细胞的附着,因而血凝现象被抑制,这种试验称为血凝抑制试验。,用简式表示:,病毒+红细胞 凝集病毒+抗体+红细胞 凝集被抑制,免疫荧光试验,基本原理：有些荧光素能和抗体分子结合,并且保持抗体活力,和相应的抗原特异性结合,并形成免疫复合物。此种复合物因有荧光素作标记,借助荧光显微镜,能观察到它的存在及位置,从而可以确定相应的病毒抗原。,免疫荧光试验分直接法和间接法两种:,直接法:直接法是将荧光素标记在病毒特异性抗体分子上,标记的抗体直接与固定在载玻片细胞内的病毒抗原结合,然后于荧光显微镜下观察结果。直接法的优点是简便、特异;缺点是敏感性较低,只能检测一种病毒抗原。,
21、间接法:将荧光素标记在抗人或抗动物抗体即抗抗体分子上,用来检测抗体与病毒抗原形成的复合物,因此间接法有两对抗原抗体系统。间接法的优点是敏感性高，标记一种抗体可用于多种抗原的检测;缺点是有时出现非特异性荧光,所以对操作要求更高。,操作步骤：,首先制备含有病毒抗原的细胞片：在细胞培养瓶中加入载玻片,让细胞在载玻片上生长,并感染病毒。根据病毒复制特性,一定时间后用冷丙酮固定,用抗体和/或荧光标记抗体染色。于荧光显微镜下观察、记录结果。,（2）病毒的分子生物学鉴定,分子生物学技术已广泛应用于病毒的鉴定：包括病毒基因的PCR扩增及其序列分析,核酸杂交技术,病毒全基因组序列测定分析等,从而可获得分离毒株的
22、基因组信息,依据基因组序列绘制遗传进化树分析比较分离毒株的遗传变异情况,确定分离毒株的基因类型。,（3）电子显微镜技术,细胞培养、鸡胚培养和动物培养的病毒可以借助电子显微镜技术,包括超薄切片和负染技术,观察标本中的病毒形态结构,尤其是形态结构比较特殊的病毒,如腺病毒、痘病毒、冠状病毒、轮状病毒、流感病毒、弹状病毒等具有更特殊的鉴别价值。,某些病毒感染早期的标本和某些难以培养的病毒可以用电子显微镜技术观察标本中的病毒颗粒。如可以从甲型肝炎病人的粪便中检出甲型肝炎病毒颗粒,从婴幼儿腹泻的粪便中检出轮状病毒和诺沃克病毒颗粒等。有时在临床上对水痘带状疱疹病毒和天花病毒引起的疱疹很难区别,借助电子显微镜
23、技术可在数小时内做出明确的鉴别诊断。,二、病毒感染单位的测定,病毒的滴度（titer）：样本中病毒的浓度病毒滴度可以通过用系列稀释的病毒接种细胞培养、鸡胚或实验动物,检测病毒增殖的情况而确定。常用于病毒感染单位测定的技术有空斑试验、终点稀释法、荧光-斑点试验、转化试验等,最常用的是前两种。,1.空斑试验,是一种检查和准确测定病毒滴度的方法。将稀释的病毒悬液加入单层细胞培养瓶中。病毒吸附后，再覆盖一层融化的半固体营养琼脂，使病毒在单层细胞培养中有限扩散。结果是每一个有感染性的病毒在单层细胞中可产生一个局限性的感染灶。用活性染料(如中性红)染色，则活细胞着色，受病毒感染而破坏的细胞不着色，形成肉眼
24、可见的空斑/蚀斑(plaque)。每个蚀斑是由一个感染性病毒颗粒形成的，称作空斑形成单位(plaque forming unit,PFU)。病毒悬液中的感染性病毒量的滴度可用PFUml表示。,根据样本的稀释度和空斑数,计算每毫升空斑形成单位(PFU),即可确定病毒的滴度。为了尽量减小计算病毒滴度的误差,进行空斑试验时应对病毒液做系列稀释,依据细胞培养板(瓶、皿)的面积,仅计算含20100个空斑的培养板,因超过100个空斑的培养板会导致计数不准确。空斑试验是纯化和滴定病毒的一个重要手段,只是并非所有病毒或毒株都能形成空斑。,2.终点稀释法,终点稀释法endpoint dilution assay
25、)用于测定几乎所有种类的病毒滴度,包括某些不能形成空斑的病毒,并可用以确定病毒对动物的毒力或毒价。将病毒做系列稀释,选择46个稀释度,接种一定数量的细胞、鸡胚或动物,每个稀释度做36个重复。使用细胞培养,可通过CPE来判定组织培养半数感染量(TCID50)。在鸡胚或动物,是以死亡或发病来测定。动物实验：以感染发病作为指标时,可计算半数感染量(ID50);以体温反应作为指标时,可计算半数反应量(RD50)。用鸡胚测定时,可计算鸡胚半数致死量(ELD50)或鸡胚半数感染量(EID50),3.荧光-斑点试验,是空斑试验的一种改良方法,用于测定细胞培养时不会引致CPE的病毒滴度,如猪瘟病毒。该方法的起
26、始步骤与空斑试验一致.在病毒充分吸附和基因表达之后,用甲醇或丙酮固定细胞,用针对病毒蛋白的抗体进行处理,然后加入荧光素标记的二抗。将细胞置荧光显微镜下观察,病毒感染细胞形成荧光斑点,病毒的滴度以每毫升荧光斑点形成单位。,4.转化试验,用于测定某些不形成空斑的反转录病毒的滴度。Rous肉瘤病毒转化鸡胚细胞就是一个例子.受到转化的细胞可形成小的斑点,容易与其余的单层细胞相互区别。感染性以每毫升斑点形成单位（focus-forming unit，FFU）表示。,三、病毒颗粒的检测,方法：电镜技术、血凝试验、病毒酶活性测定、绿色荧光蛋白标记最直观的方法是用电子显微镜（electron microsco
27、py，EM）观察病毒颗粒病毒浓度要求：107如：某些病毒料中含毒量较高,如轮状病毒引致的腹泻的粪便,EM观察较易发现病毒,但像口蹄疫病毒或猪瘟病毒,病料中一般含毒量较低,EM不作为常规检验手段。,1、电镜技术,免疫电镜(IEM),免疫电镜(IEM)技术是应用病毒的特异抗体的电镜技术,可检出某些凭形态特征较难区分的病毒。由于抗体与病毒颗粒相结合,凝聚了样本中的病毒。可提高检出率。高滴度的抗血清或单克隆抗体是决定IEM成败的关键材料。,2、血凝试验,许多动物病毒,如正黏病毒科、副黏病毒科、腺病毒科的成员,能够凝集某些动物(如鸡、小鼠、豚鼠)或人的红细胞。这些病毒含有可与红细胞结合的蛋白质,如禽流感
28、病毒的囊膜上有一种称为血凝素的糖蛋自,可与红细胞表面的N-乙酰神经氨酸糖蛋自结合,引起红细胞凝集。利用这种特性,可做血凝试验来检测这些病毒的存在。,一般将病毒液在血凝反应板上做倍比稀释,加入红细胞,未凝集的红细胞呈圆点或纽扣状沉于孔底,而凝集的红细胞弥漫性格状覆盖整个孔。该方法快速,但如犬细小病毒检验样本中的病毒粒子含量若少于lO9/g,敏感性则差。,+：血球完全凝集，成厚膜状铺于管底。+：血球呈薄层贴附于管底，边缘不整齐。+：中央呈小圆盘状，边缘凝集呈颗粒状。+：中央呈弥散圆盘状，边缘有少量凝集颗粒。：无凝集，血球自然沉于管底呈一小圆盘状。,3、病毒酶活性测定,一些动物病毒含有核酸聚合酶，可
29、将病毒与放射性标记的前体混合,测定其放射性活性,该方法常用于反转录病毒的反转录活性的检测,因它们不能转化细饱,也不能形成空斑。因酶活性与病毒粒子数量成比例关系,因此该方法可以快速跟踪感染过程中病毒的增殖侑况。,4、绿色荧光蛋白标记,用于检测病毒的转录或翻译过程,在活细胞中可直接观察到，不需要固定细胞,也不需要底物或酶。可将绿色荧光蛋白的基因序列插入病毒基因组,不影响病毒蛋白的功能,用重组病毒感染细胞后,即可产生绿色荧光蛋白。可用于研究病毒的亚细胞定位,分析病毒在活细胞中的吸附、侵入、脱壳、复制、装配和释出过程.,四、病毒的血清学诊断,原理是用已知病毒抗原来检测病人或动物血清中有无相应抗体，故须
30、待病人或动物感染后体内产生抗体时才能检出。另外，在采取临床标本及病人、动物血清应注意病程，必须采取患者急性期血清与恢复期血清(双份血清)进行血清学试验。若第2次血清抗体滴度比第1次高出4倍以上时，才有诊断意义。,血清学技术,1、免疫荧光技术2、酶联免疫吸附试验（ELISA）3、免疫沉淀技术4、免疫转印技术5、中和试验6、血凝试验和血凝抑制试验7、补体结合试验,（一）病毒抗原的直接检出,除对细胞培养中的病毒可进行鉴定外,对一些血清型类别不多或在常规细胞培养系统中还不能成功培养的病毒,应用免疫荧光技术或酶联免疫吸附实验直接检测病毒抗原是快速而简单的方法。,1.免疫荧光法(immunofluores
31、cent assay，IF),根据抗原抗体特异性结合的反应特点,将荧光色素与待检病毒的特异性抗体以化学的方法结合起来。将荧光标记了的抗体在特定的条件下浸染标本,使抗体与标本中的抗原(病毒)发生结合反应,细胞内的病毒或抗原可被荧光素标记的特异性抗体结合,在荧光显微镜下可见斑点状黄绿色荧光,根据所用抗体的特异性判断为何种病毒感染。,免疫荧光(IF)法用于鉴定病毒具有快速、特异的优点。此方法主要包括直接免疫荧光法、间接免疫荧光法以及在间接法的基础上发展而成的补体结合法。,2.酶联免疫吸附试验(Enzyme-Linked Immunosorbent Assays,ELISA),ELISA使用病毒特异性
32、抗体检测标本中的病毒抗原。ELISA法用于鉴定病毒具有简便、快速、特异的优点。,3.免疫沉淀(immunoprecipitation),基于病毒特异性抗体与感染细胞或组织的可溶性提取物中的病毒蛋白的相互作用。病毒蛋白事先经放射性同位素标记的氨基酸进行代谢标记,将病毒与抗体作用,分离抗体-病毒蛋白复合物,然后将病毒蛋白从复合物中解离,再经聚丙烯酰胺凝胶电泳,最后经放射自显影,可观察到病毒蛋白带条。,该技术可用于分析病毒蛋白的许多特性,如存在于病毒粒子和感染细胞内的病毒蛋白种类,蛋白的分子质量,蛋白的合成动态,亚细胞定位,病毒蛋白与其他病毒或细胞蛋白的结合情况。,4.免疫转印(immunoblot
33、ting),是基于抗体与固定在滤膜上的病毒蛋白质的相互作用。病毒蛋白经聚丙烯配胺凝胶电泳,然后转印到对蛋白质有很强亲和性的滤膜(如硝酸纤维素滤膜)上，经免疫染色(如免疫酶染色)检测结合在膜上的蛋白质。由于结合到膜上的蛋白质是变性的,因此识别非线性抗原表位的抗体不适合用于检测。该方法可用于病毒蛋白的分析,其主要优点在于不需要进行病毒蛋白的标记,因此适用于组织、器官或培养细胞中病毒蛋白的检测。,（二）病毒抗体的直接检出,应用病毒特异性抗原检测病毒感染患者血清中的抗体也是诊断病毒感染的的重要手段，可有IgG和IgM两种。IgM抗体出现于病毒感染早期,可用于快速诊断病毒感染。,IgG抗体出现较迟,在血
34、清中存在的时间也较长,因此IgG类抗体用于临床诊断必须具有早期和恢复期双份血清,或有随访的血清,两次标本中抗体的效价需有4倍或以上的升高才有诊断价值。,ELISA或免疫印迹法可检测血清中针对某种病毒抗原亚单位的抗体,例如,该法已用于HIV患者抗体的确认实验。其他常用的方法还包括:1.中和试验2.补体结合试验3.血凝抑制试验,1.中和试验(neutralizing test,NT test),是病毒在活体内或细胞培养中被特异性抗体中和而失去感染性的一种试验。针对病毒的一些蛋白质抗原或抗原表位的抗体与病毒结合后可以中和病毒的感染性。中和抗体(netralizing antibodies,NTAb)
35、是作用于病毒表面抗原(衣壳或包膜)的抗体，同种不同型病毒间一般无交叉，特异性高，而且抗体在体内维持时间长。因此流行病学检查常用此法。,病毒中和试验可以在细胞培养、鸡胚或动物上进行,一般将抗体稀释,与一定量的病毒混合,然后检测其在细胞培养、鸡胚或动物上的残余感染性。终点是以抑制细胞病变(细胞培养或病毒复制鸡胚或动物的抗体最高稀释度来表示。中和试验具有很强的特异性,是检测病毒和新分离病毒毒株的鉴定最经典的方法,也可用于检测病毒感染动物血清中的抗体。,可用来检查患者血清中抗体的消长情况,也可用来鉴定未知病毒或研究病毒的抗原结构。中和试验的结果呈现“阳性”不一定表示正在感染中，也可能因以前有过隐性感染
36、所致。因此，中和试验适用于人群免疫情况的调查，在临床诊断上较少使用。,2.补体结合试验(complement fixation test,CF test),用于检测人或动物血清中的病毒抗体。用已知病毒内部可溶性抗原来检测病人或动物血清中相应抗体。一般是血清中IgM类抗体。原理：病毒抗原与抗体的相互反应可以引起补体结合,最终不会导致细胞膜溶解。在补体结合试验中,利用红细胞作为靶细胞，溶血系统作为指示系统,因红细胞膜的溶解易于观察到。游离的补体可以溶解红细胞膜。如果存在抗原抗体结合反应,将与补体发生结合,失去溶解红细胞作用。,利用加入“结合了溶血素(即红细胞抗体)”的绵羊红细胞可以检测到是否存在病
37、毒抗原。如果补体被病毒抗原抗体复合物结合,则红细胞仍然是完整的;相反,如果补体未被结合,红细胞将在游离的补体的作用下被溶解。因补体结合试验中常使用粗制的病毒抗原,因此该方法的特异性不是很高.,“补体结合抗原”即CF抗原是病毒的内部抗原，同种异型间常有交叉反应，故特异性较中和试验低。但“补体结合抗体”即 CF抗体产生较早，消失较快，常用于病毒早期感染的诊断，故CF阳性可作为近期感染的指标。,3.血凝抑制试验(hemagglutinatia inhibition test,HI test),许多病毒表面具有血凝素(HA)，能凝集鸡、豚鼠、人等的红细胞，称血凝现象。这种现象能被相应抗体（即抗血凝素抗
38、体）所抑制，检测血凝抑制抗体的试验，称HI试验。即具有HA病毒的抗体，可阻断病毒与红细胞结合。原理是血凝素(HA)对应的抗体，即抗血凝素抗体与病毒结合后，抑制了病毒表面的HA与红细胞的结合。,病毒+鸡RBC=凝集（血凝试验）病毒+特异性抗体+鸡RBC=不凝集（血凝抑制试验）本试验简易、经济，特异性高，常用于粘病毒、流感病毒及乙型脑炎病毒感染的辅助诊断及流行病学调查，也可鉴定病毒的型与亚型。,五、病毒核酸的检测,指利用一些分子生物学技术,如基因组电泳分析、核酸杂交、聚合酶链式反应、酶切图谱分析、寡核苷酸指纹图、DNA芯片技术等,通过检测病毒的核酸而确证样本中病毒的存在。目前PCR等技术已广泛用于
39、病毒的检测和病毒病的诊断。,由于大多数病毒的基因均已克隆并已知道其核酸序列,因此可以利用病毒的基因作为探针(probes)进行杂交以检测标本中有无相应的病毒核酸,或针对病毒的序列设计相应的引物,作多聚酶链反应(Polymerase Chain Reaction Assay,PCR)。近年随着技术的进步,已研制出多种高通量的检测病毒核酸的技术。,1、核酸杂交技术,核酸杂交是病毒诊断领域中发展较快的一项新技术,主要分为Southern杂交和Northern杂交两大类。其基本原理是双链DNA(或RNA)在加热或碱处理下,变性解开成单链,然后用一条已知的特异性的核苷酸序列的单链DNA,以同位素或非放射
40、性核素标记后制成探针去与固态支持物上的变性单链DNA进行杂交,再用放射自显影技术或用生物素-亲和素系统进行检查,以确定待测核酸中有无与探针DNA同源的DNA存在。,由于病毒基因很多已成功地被克隆及进行了核苷酸序列测定,因此可以利用特定的病毒基因作为探针,用核酸杂交的方法检测标本中有无相应的病毒核酸。核酸杂交技术(nucleio acid hybridization technique)方法包括有斑点核酸杂交、细胞内原位杂交、DNA印迹杂交和RNA印迹杂交等。,2、PCR技术,近年来发展了一系列以PCR为基础的体外核酸扩增技术,用于检测不易感或不能培养的病毒。此方法特异性强、敏感性高、简便快速,
41、已成功用于HCV、H、CMV、HPV等多种病毒性感染的临床检测中。由于PCR方法十分敏感,可检出fg水平的病毒核酸,故操作时应注意PCR产物的气溶胶污染以防出现假阳性:此外,病毒核酸检测阳性并不等于标本中存在有感染性的活病毒。,随着PCR技术的广泛应用,派生出了一系列的新技术和方法,根据不同的检测目的可以选用相适应的技术方法。利用实时定量PCR法(real time quantitatice PCR)检测病毒载量;利用原位(in situ)PCR法定位检测细胞或组织中的病毒感染;利用巢式(nested)PCR可以提高PCR的敏感性和特异性等等。,3、高通量的病毒核酸检测技术,突发传染病病原体的
42、快速鉴定DNA芯片技术目前基因芯片主要有两种：一种是DNA合成芯片,在芯片的特定部位原位合成寡核苷酸;另一种是DNA微集芯片,将克隆基因或PCR扩增的基因片段有序地显微打印到芯片上。,DNA芯片技术的优点,一次性可以完成大量样品DNA序列的检测和分析,最新研发的高密度病原体基因芯片能检测1700多种人类病毒。DNA芯片技术解决了传统核酸杂交技术的许多不足,在病毒诊断和流行病学调查方面有着广阔的应用前景。,六、病毒感染的快速诊断,快速诊断主要是指从含有病毒标本及感染机体的血清中检测病毒颗粒、蛋白抗原、IgM抗体和核酸等，往往在数小时内即可得出结果。,(一)形态学检查,1.普通光学显微镜检查2.电
43、镜和免疫电镜检查,1、普通光学显微镜检查法,某些受病毒感染的细胞内,可形成与正常细胞结构和着色不同的斑块,称为包涵体。有些病毒在宿主细胞内增殖后，在细胞的一定部位(胞核、胞浆或两者兼有)出现一个或数个、圆形或椭圆形、嗜酸性或嗜碱性的结构，即包涵体。包涵体对病毒感染的诊断有一定价值。,光学显微镜是病毒诊断的辅助方法之一,借助染色技术可以直接观察病毒产生的核内或胞浆内包涵体和病毒感染细胞的具体形态。应用光学显微镜检查包涵体,根据不同病毒包涵体的形态、染色、存在部位的差异,可辅助诊断某些病毒性疾病。,例如,从病犬大脑海马会发现胞浆中嗜酸性包涵体(内基小体),即可确诊为狂犬病;在麻疹病毒感染细胞的核内
44、及胞浆内可找到一个或多个鲜红色的圆形、椭圆形或不规则形态的包涵体,被称为麻疹病毒包涵体。,2、电镜(electron microscopy,EM)检查法,电子显微镜技术可直接观察病毒的大小、形态、结构以及病毒在细胞内增殖的动态过程。制作电镜标本的方法主要有超薄切片(厚度为100nm左右)、磷钨酸负染法。超薄切片法也称正染法,将细胞固定、脱水、包埋、切片、染色,然后观察病毒颗粒,可显示病毒形态及形态发生过程。,负染色法敏感性低,通过富集病毒的办法使样品含有高浓度病毒颗粒(106107/ml),经磷钨酸负染后直接用于电镜检查,可显示病毒的结构。这种方法可有助于诊断难以在细胞培养中增殖的病毒,例如从
45、病人粪便标本中观察是否有轮状病毒的感染。,3、免疫电镜技术术(immune electron microscopy,IEM),是将抗原抗体反应的特异性与电子显微镜的高分辨力相结合,在亚细胞和超微结构水平上对抗原物质进行定位分析的一种高度精确、灵敏的方法。特异性抗体用电子致密物质,如铁蛋白、胶体金等标记后,使之与抗原结合,在电镜下观察到标记物所在位置,即为抗原抗体反应的部位。,在难以分辨病毒颗粒与其外周伴随的结构的情况下,若将病毒样品制成悬液,加入特异性抗体,可使样品中的病毒颗粒凝集成团,再用电镜观察可提高病毒的检出率。利用这种方法从痘病毒、疱疹病毒感染的疱疹液中,以及疑为轮状病毒感染的粪便或H
46、BV感染者血清中均可快速检出典型的病毒颗粒,能帮助早期诊断。,(二)病毒蛋白抗原检查,用荧光素、放射性同位素、过氧化物酶等标记抗体，采用免疫学和分子生物学技术，检测标本中的病毒蛋白抗原，具有敏感、特异、快速等优点。1.免疫荧光技术(immuno-fluorescence,IF)2.固相放射免疫测定(solid-phase radioimmunoassay,SPRIA)3.酶免疫技术(enzyme immunoassay,EIA)此法可检测多种病毒及其抗体，主要是酶免疫组化法和酶联免疫吸附试验法(ELISA)。,(三)特异性IgM抗体的检测,检测病毒特异性IgM抗体可诊断急性感染，特别是对证实孕
47、妇感染风疹病毒尤为重要，但应注意类风湿因子(IgM)的干扰。另外，检测早期抗原的抗体是快速诊断的另一途径。如检测针对EBV的早期抗原(EA)、核心抗原(EANA)和衣壳抗原(VCA)等的抗体，可以区别急性或慢性EBV感染。此外，分子生物学检测技术、气相色谱技术等，均可用来分析和鉴定病毒感染。,(四)检测病毒核酸,1.核酸杂交技术 用于病毒检测的有斑点杂交、细胞内原位杂交、DNA印迹杂交、RNA印迹杂交等。2.核酸扩增法 目前多数病毒基因已通过分子克隆技术被明确了核苷酸序列，使得DNA扩增技术逐步发展为常规诊断技术之一。3.基因芯片技术,基因芯片,又称DNA芯片、生物芯片（biochip）。其原理是：将已知的生物分子探针或基因探针，大规模或有序排布于小块硅片等载体上，与待测样品中的生物分子或基因序列相互作用和并行反应，在激光的激发下，产生的荧光谱信号被接受器收集，计算机自动分析处理数据并报告结果。其优点是：可以一次性完成大量样品DNA序列的检测和分析，解决了传统核酸杂交技术的许多不足。芯片技术在病毒等微生物学诊断和流行病学调查方面有着广阔的应用前景。,THE END,
