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1、1,第九章 微生物遗传与变异,通过本章的学习，要求掌握：1、细菌基因重组的原理和方法。2、真菌基因重组的原理和方法。3、微生物诱变育种的原理和方法。4、基因工程的基本原理。5、基因表达的调控。重点：细菌的基因重组难点：低频转导，高频转导，准性生殖,2,证明核酸（DNA或RNA）是遗传的物质基础简单的细菌（或病毒）解决复杂而重大的问题微生物与高等生物具有共同的遗传本质,第一节：微生物的遗传物质,一、证明核酸是遗传物质的3个经典实验,结论：,3,Prusiner (1982)提出羊搔痒病因子是一种蛋白质侵染颗粒（proteinaceous infectious particle），并将之称做Pri
2、on或Virino。 -朊病毒,1997年，Stanley B. Prusiner荣获诺贝尔奖,4,朊病毒的发现和思考:,朊病毒一种具有传染性的蛋白质致病因子,蛋白质是遗传物质吗?蛋白质折叠与功能的关系，是否存在折叠密码？,已知的传染性疾病的传播因子必须含有核酸,5,二、遗传物质在微生物细胞内 存在的部位和形式,(一）遗传物质在微生物细胞中的存在方式,真核生物 DNA分子与组蛋白结合构成染色体，每条染色体有单一线性双链DNA分子。一个真核生物细胞内有多条染色体（脉孢菌7条，人23条）。高等生物中有2至多套染色体（动物2倍，水稻4倍），真菌有双倍体，但多数微生物是单倍体。真核细胞核物质外有核膜包
3、围，形成完整细胞核。,6,原核生物DNA不与组蛋白结合，染色体仅由一条DNA组成，DNA为共价闭合环状双链，一个细胞内只有一条染色体（单倍体haploid）。无核膜膜包围，只在细胞中央形成核区。质粒plasmid和转座因子原核生物中，除染色体以外，能够自主复制的共价闭合环状DNA分子。它们携带少量遗传基因，决定细胞的某些性状，并非细菌生活必需。,7,1、细胞水平2、细胞核水平3、染色体水平4、核酸水平5、基因水平6、密码子水平7、核苷酸水平,（二）遗传物质在7个水平上的形式,8,1、细胞水平真核微生物：细胞核原核微生物：核区细胞核或核区的数目在不同的微生物中是不同的,9,2、细胞核水平真核生物
4、 细胞核 核染色体原核生物 核区 DNA链,核基因组,在核基因组之外，还存在各种形式的核外遗传物质,10,3、染色体水平染色体的数目在不同的生物中是不同的,真核生物染色体是由组蛋白与DNA构成的线状结构真核生物通常为多倍体原核生物的染色体只有闭合环状的DNA链原核生物为单倍体,11,4、核酸水平核酸种类：DNA，RNA核酸结构：双链、单链； 环状，线状，超螺旋状DNA长度：因种而异,微生物基因组测序工作是在人类基因组计划的促进下开始的，最开始是模式生物，后来不断发展，已成为研究微生物学的最有力手段。,12,5、基因水平,一切具有自主复制能力的遗传功能单位都称为基因。它的物质基础是一个具有特定核
5、苷酸顺序的DNA片段。,1909年 丹麦生物学家WJohansen,13,结构基因：是为细胞结构、组成(如细胞生化反应所需的酶)及完成细胞功能所需的蛋白质等进行编码的基因。调节基因：用于编码调节蛋白的基因。操纵基因：是位于启动基因和结构基因之间的一段碱基顺序，能与调节蛋白相结合，以此来决定结构基因的转录是否能进行。 重复基因：DNA片段重复跳跃基因：可在DNA上转移位置的基因（IS因子、Tn因子）,14,6、密码子水平,15,核苷酸是最小突变单位和交换单位,7、核苷酸水平,16,（三）转座因子,转座因子：细胞中能改变自身位置（例如从染色体或质粒转移到另一个位点，或者在两个复制子之间转移）的一段
6、DNA序列。,插入序列（insertion sequence,IS),转座子（transposon ,Tn),某些病毒（Mu噬菌体）,原核生物的转座因子：,17,型Compound transposons：两端为IS，抗性基因居中。如Tn5、Tn9、Tn10、Tn4001、Tn4003。型Complex transposons：两端为IR(30-50bp)，中间为转座基因和抗性基因。如Tn1、Tn3、Tn21、Tn1721、Tn551。,基因转座 gene transposition,转座子的特征是在两端有IR序列,分两类：,18,转座的遗传学效应：,1）插入突变,2）产生染色体畸变,3）基因
7、的移动和重排,19,(四) 质粒,1、致育因子(Fertility factor，F因子),3、产细菌素的质粒（Bacteriocin production plasmid）,2、抗性因子（Resistance factor，R因子）,4、毒性质粒（virulence plasmid）,5、代谢质粒（Metabolic plasmid）,6、隐秘质粒（cryptic plasmid）,20,第二节：微生物的基因组结构,明确基因组的概念三种代表性微生物基因组结构的特点，特别强调古生菌基因组的独特性及双重特征,21,微生物基因组结构的特点:,1、原核生物（细菌）的基因组,1）染色体为双链环状的DN
8、A分子（单体）；2）基因组上遗传信息具有连续性； 基因数基本接近由它的基因组大小所估计的基因数 一般不含内含子，遗传信息是连续的而不是中断的 3）功能相关的结构基因组成操纵子结构； 4）结构基因的单拷贝及rRNA基因的多拷贝； 5）基因组的重复序列少而短.,基因组genome：一种生物的全套基因。,22,23,2、真核微生物（啤酒酵母）的基因组,1）典型的真核染色体结构； 啤酒酵母基因组大小为13.5106bp， 分布在16条染色体中。 2）没有明显的操纵子结构；3）有间隔区（即非编码区）或内含子序列； 4）重复序列多.,第一个完成基因组测序的真核生物基因组,24,25,3、古生菌（詹氏甲烷球
9、菌）的基因组,第一个完成基因组测序的古生菌,1) 只有40的基因与其他两界的生物有同源性2) 古生菌的基因组在结构上类似于细菌 1.66x106bp的环状染色体DNA 1682个ORF(Open Reading Frame)3) 负责信息传递功能的基因（复制 、转录和翻译）则类似于真核生物,26,克隆clone 不经过有性细胞的结合，由体细胞发育成新个体，即无性繁殖。基因重组gene recombination两个不同来源的遗传物质进行交换，经过基因的重新组合，形成新的基因型的过程。原核微生物没有有性生殖，其基因重组通过转化、接合、转导方式进行。,第三节 原核微生物的基因重组,27,一、细菌的
10、接合作用(conjugation),1.实验证据,通过细胞与细胞的直接接触而产生的遗传信息的转移和重组过程,28,接合(conjugation)通过供体菌与受体菌间细胞接触而传递大段DNA,1946年，Joshua Lederberg 和Edward L.TatumE.coli k12的多重营养缺陷型杂交实验,中间平板上长出的原养型菌落是两菌株之间发生了遗传交换和重组所致。,29,证实接合过程需要细胞间的直接接触的“U”型管实验（ Bernard Davis，1950 ）,30,接合机制(大肠杆菌的接合机制),接合作用是由一种被称为F因子的质粒介导。F因子的分子量通常为5107，上面有编码细菌
11、产生性菌毛及控制接合过程进行的20多个基因。,31,中间平板上长出的原养型菌落是两菌株之间发生了遗传交换和重组所致！,为何采用多重营养缺陷型菌株？,尽可能地排除回复突变对实验结果的干扰！,32,1）可经接合作用而获得2） 可通过一些理化因素( 如吖啶橙、Ni2+、Co2+、利福平、丝裂霉素C、硫酸十二酯钠、亚硝基胍、溴化乙锭、环己亚胺和加热等)的处理，而从细胞中消失。3）在大肠杆菌中，F因子的DNA含量约占总染色体含量的2%,F因子特点：,33,F因子,大肠杆菌是有性别分化的。决定它们性别的因子称为F因子(致育因子或称性质粒)，呈超螺旋状态，既可以在细胞内独立存在, 具有自主的与染色体进行同步
12、复制和转移到其他细胞中的能力,也可插入(即整合)到染色体上,34,F因子的四种形式：,a）F-菌株(“雌性”菌株)，不含F因子，没有性菌毛，但可以通过接合作用接收F因子而变成F+菌株；b）F+菌株(“雄性”菌株)， F因子独立存在，细胞表面有性菌毛。,35,c）Hfr菌株，F因子插入到染色体DNA上,因此只要发生接合转移过程，就可以把部分甚至全部细菌染色体传递给F-细胞并发生重组，由此而得名为高频重组菌株d）F菌株，Hfr菌株内的F因子因不正常切割而脱离染色体时，形成游离的但携带一小段染色体基因的F因子，特称为F因 子。 细胞表面同样有性菌毛。,36,F+菌株含F质粒，细胞表面产生性毛(sex
13、 pili)，与F-细胞相连，在接合后转移DNA。 F-菌株无F质粒，不产生 性毛，可接受外 来F质粒。,37,Hfr菌株高频重组菌株（high frequency recombination）。与F-接合后，重组频率比F+高几百倍。当Hfr菌株与F-菌株接合时，Hfr染色体在F因子处发生断裂，由环状变成线状。整段线状染色体转移至F-细胞的全过程约需100 min。由于转移过程常中断，越在前端的基因进入F-的机会就越多，在F-中出现重组子的时间就越早，频率也高。,38,F菌株携带有F因子的菌株，其性状介于F+与Hfr之间，这就是初生F菌株。初生F菌株与F-菌株接合，使后者转变成F菌株，这就是次
14、生F菌株。以这种接合来传递供体菌基因的方式，称为F因子转导(F-duction)、性导(sexduction) 。在次生的F群体中，大约有10%的F因子重新整合到染色体组上，而恢复成Hfr菌。,1） F+F-杂交,1）F+细菌通过性毛与F-细菌接触并发生相互作用；2）F因子的转移:双链之一被切断，一条链进入F-细菌3）进入F-细菌中的一条链复制出互补链,F-成为F+4）原有F+细胞也完成F因子另一条链的复制,F+ F+,2）Hfr F-杂交,Hfr菌株仍保持着F+细胞的特征。当OriT序列被缺刻螺旋酶识别而产生缺口后，F因子的先导区和染色体DNA向受体细胞转移。F因子除先导区外，绝大部分处于转
15、移染色体的末端，因转移过程常被中断，故F因子不易转入受体细胞中。HfrF-杂交后的接合子多数仍然是F-。染色体上越靠近F因子的先导区的基因，进入的机会就越多，在F-中出现重组子的的时间就越早，频率也高。,Hfr F-,3）FF-杂交,FF-与F+F-的不同：供体的部分染色体基因随F一起转入受体细胞a）与染色体发生重组；b）继续存在于F因子上，形成一种部分二倍体；,细胞基因的这种转移过程又常称为性导（sexduction）,F F,42,1、普遍性转导（generalized transduction）,(1) 意外的发现,1951年，Joshua Lederberg和Norton Zinder
16、为了证实大肠杆菌以外的其它菌种是否也存在接合作用，用二株具不同的多重营养缺陷型的鼠伤寒沙门氏菌进行类似的实验,用“U”型管进行同样的实验时，在给体和受体细胞不接触的情况下，同样出现原养型细菌！,二、细菌的转导(transduction),43,1952 年Zinder 和 Lederberg 在验证Salmonella typhimurium是否也存在接合现象时发现了转导现象。S. typhimurium：LT22A (trp-)； LT2(his-)LT22溶原性噬菌体P22 感染LT2（非溶原性）可能释放带trp+的P22LT22A (trp-)呈原养型。,44,沙门氏菌LT22A是携带P
17、22噬菌体的溶源性细菌 另一株是非溶源性细菌,一个表面看起来的常规研究却导致一个惊奇和十分重要发现的重要例证！,基因的传递很可能是由可透过“U”型管滤板的P22噬菌体介导的,（普遍性转导这一重要的基因转移途径的发现）,Why and How ?,（2）转导（transduction）,转导：由病毒介导的细菌细胞间进行遗传交换的一种方式。 一个细胞的DNA或RNA通过病毒载体的感染转移到另一个细胞中。,转导噬菌体：能将细菌宿主的部分染色体和质粒DNA带到另一个细菌的噬菌体。获得了由噬菌体携带来的供体菌DNA片段的受体细胞称为转导子。在转导中被转移的染色体片段称为转导因子。,46,细菌转导的类型：
18、,普遍转导,低频转导高频转导,局限转导,完全转导流产转导,普遍转导（generalized transduction）,噬菌体可误包供体菌中的任何基因(包括质粒)转导至受体细菌中，并使受体菌实现各种性状的转导,48,普遍性转导的三种后果：,外源DNA被降解，转导失败。,完全转导,流产转导,完全转导complete transduction ： 进入受体的外源DNA通过与细胞染色体的重组交换而形成稳定的转导子 (transductant),转导DNA不能进行整合、重组和复制，但其携带的基因可经过转录而得到表达。因此群体中仅一个细胞含有DNA，而其它细胞只能得到其基因产物。,流产转导：,51,局限
19、性转导是噬菌体对寄主特定基因进行的有效转移溶原菌经诱导后，少数前噬菌体从宿主染色体脱落时产生错误切割，把宿主的某些基因整合到噬菌体的基因组上，当这样的噬菌体侵染另一宿主菌时，噬菌体 DNA 与受体菌的 DNA 同源区段配对，通过双交换而整合到受体菌的染色体组上，使受体菌获得了供体的这部分遗传特性，从而形成转导子。,局限转导（又叫特异转导）：,specialized transduction,52,如：前噬菌体位点两端是细菌染色体的gal和bio，经诱导后噬菌体与寄主DNA分离。但在极低的频率下会出现错切，从而使邻接的的细菌DNA被一起切除转导至受体菌。,局限性转导包括低频转导和高频转导两种类型
20、,53,低频转导：,低频转导裂解物,正常噬菌体,极少量的部分缺陷噬菌体（局限转导噬菌体）,转导颗粒,局限转导子（极少量）,低感染频率,形成转导子的频率只有10-4-10-6,54,高频转导：,形成转导子的频率很高, 理论上可达 50%。,高频转导是双重溶源的结果： E.coli k12 E.coli K12(/dgal )F dgal UV 转导噬菌体（gal） 转导子菌落 辅助噬菌体（） 噬菌斑,局限转导与普遍转导的主要区别：,a）局限转导中被转导的基因共价地与噬菌体DNA连接，与噬菌体DNA一起进行复制、包装以及被导入受体细胞中。而普遍性转导包装的可能全部是宿主菌的基因。,b）局限性转导颗
21、粒携带特定的染色体片段并将固定的个别基因导入受体，故称为局限性转导。而普遍性转导携带的宿主基因具有随机性。,转化：指同源或异源的游离DNA分子（质粒和染色体DNA）被自然或人工感受态细胞提取，并得到表达的水平方向的基因转移过程。这些被转化的游离的DNA片段称为转化因子 。转化后的受体菌，称为转化子。,1928年，Griffith发现肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）的转化现象,目前已知有二十多个种的细菌具有自然转化的能力,三、细菌的遗传转化（genetic transformation）,感受态细胞：受体菌最容易接受外源DNA片段并实现转化的生理状态称为感受态。,进
22、行转化，需要二方面必要的条件：,1、建立了感受态的受体细胞,2、外源游离DNA分子（转化因子）,自然感受态的出现是细胞一定生长阶段的生理特性，受细菌自身的基因控制；人工感受态则是通过人为诱导的方法，使细胞具有摄取DNA的能力，或人为地将DNA导入细胞内,转化因子通常是双链DNA。,转化过程:,感受态的出现 转化因子的吸附与掺入 转化因子的整合,噬菌体DNA被感受态细胞摄取并产生有活性的病毒颗粒,转染(transfection)：,转染的特点：提纯的噬菌体DNA以转化的（而非感染）途径进入细胞并表达后产生完整的病毒颗粒。,人工转化：,用CaCl2处理细胞，电穿孔等是常用的人工转化手段。,在自然转
23、化的基础上发展和建立的一项细菌基因重组手段，是基因工程的奠基石和基础技术。,用多种不同的技术处理受体细胞，使其人为地处于一种可以摄取外源DNA的“人工感受态”。,61,五. 原生质体融合,原生质体融合：将遗传性状不同的两种菌（包括种间、种内、及属间）原生质体融合成为一个新的重组子的技术。,原生质体融合步骤：,1、原生质体制备2、原生质体融合和再生3、融合子的选择,62,微生物细胞融合的研究始于1976年。主要过程：先准备两个有选择性遗传标记的突变株，在高渗溶液中，用适当的脱壁酶去除细胞壁，再将形成的原生质体离心聚集，并加入促融合剂PEG(聚乙二醇)促进融合，然后在高渗溶液中稀释，涂在能使其再生
24、细胞壁或进行分裂的培养基上，待形成菌落后，通过影印接种法，将其接种到各种选择性培养基上，最后鉴定它们是否是重组子。,63,杂交是在细胞水平上发生的一种遗传重组方式。有性杂交：指性细胞间的接合和随之发生的染色体重组，并产生新遗传型后代的一种方式。,（一）有性生殖,第四节 真核微生物的基因重组,能产生有性孢子的酵母菌、霉菌和蕈菌都可以进行有性杂交,64,（二）准性生殖,准性生殖是指真菌中不通过有性生殖的基因重组过程。它是类似于有性生殖，但比之更为原始的一种生殖方式，它可使同一生物的两个不同来源的体细胞经融合后，不通过减数分裂而导致低频率的基因重组。在半知菌类中最为常见。,65,2、异核体形成,1、
25、菌丝联合,3、核配,4、体细胞交换和单倍体化,杂合二倍体只有相对的稳定性，在其繁殖过程中虽不进行减数分裂，但在有丝分裂中可以发生染色体交换和染色体单倍化，从而形成各种分离子。,准性生殖的过程：,66,67,68,“生物化学统一性”法则：,人和细菌在DNA的结构及特性方面是一致的，能使微生物发生突变的诱变剂必然也会作用于人的DNA，使其发生突变，最后造成癌变或其他不良的后果,所有生物的DNA在结构及特性上具有一致性,让细菌代人受过！,Ames试验：,利用细菌模型了解潜在化学致癌物的诱变作用,69,美国加利福尼亚大学的Bruce Ames教授于1966年发明，因此称为Ames试验具体操作：检测鼠伤
26、寒沙门氏菌(Salmonella typhmurium)组氨酸营养缺陷型菌株(his-)的回复突变率回复突变：突变体失去的野生型性状，可以通过第二次突变得到恢复，这种第二次突变称为回复突变,70,证明Ames试验重要性的应用实例：,国外曾开发了一种降低妇女妊娠反应的药物“反应停”，由于其药效显著，在60-70年代十分流行但随后人们就发现畸形儿的出生率明显增高，而且生产畸形儿的妇女大多曾服用“反应停”，后来采用Ames试验发现这种物质的确具有很强的致突变作用，因此这种药物被禁止使用但如果能在这种药物上市之前就进行Ames试验检测，那么这种大量出生畸形儿的悲剧完全可以避免,71,Ames试验,72
27、,第五节、微生物诱变育种,诱变育种：指利用各种诱变剂处理微生物细胞，提高基因的随机突变频率，通过一定的筛选方法获得所需要的高产优质菌株。,73,诱变剂,物理因素：紫外线、激光、离子束、X射线、r射线等,化学因素：烷化剂、碱基类似物、吖啶化合物,（2）选用优良的出发菌株（3）处理单细胞或单孢子悬浮液,（1）使用简便有效的诱变剂,74,（4）使用最佳的处理剂量,剂量 = 强度（浓度） 作用时间 相对剂量 = 杀菌率,处理剂量：是指处理因素对微生物的生物学效应,75,致死剂量：将微生物全部杀死的剂量亚致死剂量：将M大部分杀死，只留下很少的活菌体，如杀死99%以上，存活不到1%，或者杀死90%以上，存
28、活在10%以下。弱致死剂量：杀死一大半，存活一小半，如杀死50-70%，存活30%-50%诱变处理一般选用亚致死剂量。,76,（5）设计高效率筛选方案,突变株的筛选：产量突变株的筛选 抗药性突变株的筛选 营养缺陷型突变株的筛选,77,诱变,检出营养缺陷型,淘汰野生型,鉴定营养缺陷型,富集培养（抗生素法）（菌丝过滤法）,影印平板法,生长谱法,78,第六节 微生物基因表达的调控,一、操纵子（operon)的转录调控,操纵子：一个或多个结构基因联接在一起，形成一个在结构和功能上协同作用的整体，受同一个调节基因、操纵基因(operator)和启动区（promoter)的调控。,79,80,1、负转录调
29、控（negative transcription control),调节基因的产物是阻遏蛋白（repressor），阻遏蛋白可以与操纵区结合，起着阻止结构基因转录的作用。,2、正转录调控（positive transcription control),调节基因的产物是激活蛋白（activator ），激活蛋白与相应的激活结合位点结合，激活结构基因的转录。,81,1）负控诱导系统,a、没有诱导物存在时，阻遏蛋白与操纵区结合，阻止转录b、有诱导物存在时，阻遏蛋白与诱导物结合而不再和操纵区结合，转录正常进行。,典型：大肠杆菌的乳糖操纵子,82,2）负控阻遏系统,a、没有辅阻遏物存在时，阻遏蛋白不与操
30、纵区结合，转录进行b、有辅阻遏物存在时，与辅阻遏物结合的阻遏蛋白可以与操纵区结合，转录被阻止。,典型：大肠杆菌的色氨酸操纵子,83,3）正控诱导系统,激活蛋白与诱导物结合后被活化，与激活结合位点结合，从而促进RNA聚合酶与启动子结合。,(b),典型：麦芽糖正控诱导系统,84,二、信号传导和双组分调节系统,原核生物的信号传导机制: 双组分系统（two-component systems)。,传感蛋白（sensor protein）or 传感激酶(sensor kinase),应答调节蛋白（response regulator protein),细胞通过传感器检测到信号，然后将信号以变化的形式传到
31、调节部位，这一过程称为信号传导（signal transduction）。,85,1、传感激酶位于细胞膜中，接收信号后，本身磷酸化。2、 传感激酶将磷酰基传递给反应调控蛋白，从而使之活化。3、 被活化的反应调控蛋白调节相应的基因的表达。4、 磷酯酶将磷酰基从反应调控蛋白上移去，使之失活。,1,2,3,4,86,87,第七节 微生物与基因工程,了解微生物学在基因工程技术的建立与发展中的重要意义，了解并掌握基因工程的基本过程和基本技术。,88,一、基因工程,基因工程：在基因水平上，改造遗传物质，即将分离到的或合成的基因经过改造，插入载体中，导入宿主细胞内，使其扩增和表达，从而获得大量基因产物，或者
32、令生物表现出新的性状。,克隆载体（cloning vector）负责将外源DNA片段运送到细胞中进行复制与扩增。,限制性核酸内切酶（restriction endonuclease ）是指能识别双链DNA分子的特定序列，并在识别位点或其附近切割DNA的一类核酸内切酶。,89,微生物学与基因工程的关系,微生物学不仅为基因工程提供了理论基础，同时也提供了操作技术。,基因工程概述,基因工程gene engineering人工将供体生物的遗传物质-DNA 在离体条件下用适当的工具酶进行切割，把它与载体(vector)的 DNA 分子连接，然后与载体一起导入某一受体细胞中，让外源遗传物质进行正常的复制和
33、表达，从而获得新物种的一种崭新的育种技术。,90,基因分离：体外重组：外源DNA与载体连接载体传递：导入受体，使外源DNA在受体中表达复制、表达筛选、繁殖：对重组后的大量重组子性状进行筛选，从中选出所需性状重组子，并使之稳定繁殖。,过程,91,获得目的基因选择基因载体体外重组外源基因导入（细菌、植物、动物、基因枪）筛选和鉴定应用,二、基因工程的基本操作,92,93,微生物在基因工程中的作用： 1.微生物作为克隆载体:质粒、病毒、噬菌体 2.微生物生产基因工程工具酶； 1)、限制性核酸内切酶 2)、DNA连接酶 3.微生物作为克隆载体的宿主 ； 1)、原核生物宿主 大肠杆菌，枯草芽胞杆菌 2)、
34、真核生物宿主 酿酒酵母 4.微生物作为基因产物的重要表达载体。 5.理论基础（主要来自对微生物的研究）； 6. 微生物的多样性提供了丰富而独特的基因资源。,94,2. 微生物与基因工程工具酶,基因工程所用到的绝大多数工具酶都是从不同微生物中分离和纯化而获得的,限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）,DNA聚合酶,碱性磷酸脂酶,核酸外切酶,单链核酸内切酶,其它工具酶：,95,限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）,基本特点：,识别序列； 切割形成粘性末端； 切割形成平末端；同尾酶；,96,质粒载体,噬菌体载体,柯斯质粒载体,M13噬菌体
35、载体,真核细胞的克隆载体,人工染色体,噬菌粒载体,3. 微生物与克隆载体,97,常用的基因工程宿主,1）大肠杆菌,3）酿酒酵母,2）枯草芽胞杆菌,特点：生长迅速、极易培养、能在廉价培养基中生长，遗传学及分子生物学背景十分清楚,4）动物细胞,4. 微生物作为克隆载体的宿主,98,DNA的体外扩增 穆利斯发明了聚合酶链式反应（polymerase chain reaction, PCR），这是一种在体外模拟细胞内进行的快速扩增特定DNA序列的新技术。PCR扩增的条件： DNA模板引物 脱氧核苷三（dNTP）磷酸DNA聚合酶扩增缓冲液 镁离子,基因工程的常用技术和方法,PCR 3个基本反应步骤：1、
36、变性（denaturation）2、退火（annealing）3、延伸（extension）,99,DNA的体外扩增,引物（primer）：与目的DNA片段末端互补的寡核苷酸片段。TaqDNA聚合酶：从水生栖热菌（Thermus aquaticus)中分离得 到的耐热的DNA聚合酶。,基本反应：,1）变性 加热，模板DNA经热变性，双链被解开，成为两条单链2）退火 温度降低，寡核苷酸引物与模板DNA配对3）延伸 在适宜条件下，引物3端向前延伸，合成与模板互补的DNA链,100,101,性状稳定的菌种是微生物学工作最重要的基本要求，否则生产或科研都无法正常进行影响微生物菌种稳定性的因素： a）变
37、异 b）污染 c）死亡,第八节 菌种的衰退、复壮与保藏,102,一、菌种的衰退与复壮,纯菌种,自发突变,不纯菌种,突变个体,传代增殖,原始个体,衰退菌种,衰退：菌种出现或表现出负变性状,103,1）从衰退的菌种群体中把少数个体再找出来，重新获得具有原有典型性状的菌种,2）有意识地利用微生物会发生自发突变的特性，在日常的菌种维护工作中不断筛选“正变”个体,菌种的复壮,104,二、防止衰退的措施1）减少传代次数2）创造良好的培养条件3）利用孢子或者芽胞传代4）经常进行纯种分离，并对相应的性状指标进行检查5）采用有效的菌种保藏方法,105,三、菌种保藏,目的：在一定时间内使菌种不死、不变、不乱，以供
38、研究、生产、交换之用,（1）斜面传代保藏：有些菌要定期传代，否则，容易死亡（2）干燥法 A沙土管法 保鲜细菌芽胞可用此法 B麸夫管法 保藏霉菌、放线菌孢子可用此方法 C干燥法,106,（3）冷冻法 A 冷冻干燥法 适于多种微生物，特别是细菌适用于此法保藏 B 液N保鲜法（-196） 适于不生孢子的丝状真菌保藏。 C -70低温保藏，需超低温冰箱。 （4）悬液法将微生物细胞悬浮在水、甘油、蔗糖液、葡萄糖液、盐水、磷酸缓冲液中，某些细菌、酵母用此法可保藏几年至近十年。,107,思考题,1、 如果二个不同营养缺陷标记（a - b - c + d + 和 a + b + c - d - ）的菌株经混合后能产生在基本培养基平板上生长的原养型重组菌株，请设计一个实验来决定该遗传转移过程是转化、转导还是接合?,
