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1、1,第六章 生物催化剂的修饰与改造,2,酶的结构和功能,酶蛋白的结构特征酶蛋白和其他蛋白质一样，由20种基本氨基酸按一定的顺序排列，此即为酶蛋白的一级结构。具有一定结构的多肽链以一定规则的氢键形成-螺旋，-折叠， -转角和自由盘绕等为二级结构。这些二级结构单元进一步盘曲折叠，形成环状分子，即三级结构。若酶蛋白具有四级结构，则必须具有两条或多条肽链。球状分子表面以疏水作用力、范德华力、氢键等非共价键互相连接起来，形成完整的酶分子。这些组成四级结构最小单位的肽键称为亚基。,3,大多数酶是结合蛋白质。除了多肽链组分外，还含有非蛋白组分，他们通常是各种低分子的热稳定性物质或离子（辅因子）。酶蛋白+辅因
2、子=全酶,4,酶蛋白分子水平的改造,基于序列的合理化设计（sequential rational design）,如化学修饰、定点突变（site-directed mutagenesis）非合理设计（irrational design），利用基因的可操作性，模拟自然界的演化进程。如定向进化（directed evolution ）杂合进化（hybrid evolution）,5,酶分子的研究：认识和改造,认识酶，并利用各种生物化学、晶体学、光谱学等方法对天然酶或突变体进行研究，获得酶分子特征、空间结构、结构和功能之间的关系，以及氨基酸残基功能的信息。以此为根据，对酶分子进行改造-合理设计不需要
3、准确的酶分子结构信息，而通过随即突变、基因重组、定向筛选等对酶进行改造-非合理设计,6,生物催化剂的化学修饰,酶分子修饰：酶蛋白分子的结构发生改变-改变酶的某些特性和功能。广义的说：蛋白质的修饰，通过化学基团的引入或除去改变蛋白质的共价结构。酶分子的完整空间结构：赋予酶的生物催化功能和特性，另一方面，导致酶的稳定性差、活性不高。,7,酶分子的修饰目的,人为的改变天然酶的某些性质：稳定性、创造天然酶所不具备的某些优良特性，扩大酶的应用范围。酶修饰后：1）提高生物活性、2）增强在不良环境中的稳定性，3）新的催化能力。如：脂肪酶和蛋白酶被MPEG修饰后，可溶于有机溶剂，催化酯合成、酯交换、肽合成。如
4、：a-胰凝乳蛋白酶表面的氨基修饰成亲水性更强的-NHCH2COOH后，抗不可逆热失活的稳定性在60C可提高1000倍。如：对脂肪酶的CRL的非特异性化学修饰，大幅度提高立体选择性。,8,1、研究酶的空间结构2、确定氨基酸残基的功能3、测定酶分子中某种氨基酸的数量 化学修饰在酶结构与功能研究中的应用除了以上三方面外，在测定酶的氨基酸序列和研究变构酶时也能有不凡的表现。,化学修饰在酶的结构和功能研究中的应用,9,酶蛋白修饰的方法,物理修饰和化学修饰：主链修饰侧链基团修饰组成单位置换修饰金属离子置换修饰大分子结合修饰亲和修饰,10,11,生物大分子酶，组成单位主要是氨基酸和核苷酸。AA通过肽键连接成
5、肽链，在通过盘绕折叠形成完成的空间结构。蛋白类酶的主链-肽链，是酶分子结构的基础。主链一旦改变，酶的结构和特性将随之发生改变。主链的切断和连接-主链修饰：切断-酶原的活化，连接-1个酶分子上具有两种或多种催化活性的多酶融合体。侧链的修饰：羧基的化学修饰、氨基、精氨酸胍基、巯基、组氨酸咪唑基、色氨酸吲哚基、酪氨酸残基和脂肪羟基、甲硫氨酸甲硫基的化学修饰,12,酶蛋白的固定化方法修饰,固定化可通过空间障碍、分配或扩散限制等效应影响酶的稳定性。空间障碍使得其他大分子难于与酶作用，载体上的酶能抵抗蛋白水解酶的降解，固定化后也能抑制某些化学失活。固定化后，微环境和游离酶有所改变，影响最始pH、底物专一性
6、和动力学常数。如阳离子resin载体，最适pH升高；阴离子resin载体的固定化，最适pH偏低。凝胶包埋：外部与内部传质都存在扩散效应，可以明显使酶更加稳定。如： a-胰凝乳蛋白酶包埋在PAA和PAGE凝胶中，60C时，提高1000倍。,13,酶蛋白的反胶束修饰,提供包埋酶的口袋，使酶微胶囊化，保护酶，使其在不利环境下有效发挥作用。提高酶活，改变专一性。如：游离脂肪酶在油脂甲醇解反应体系，反胶束体系，活力、稳定性提高5倍。,14,大分子修饰剂的化学修饰,非共价修饰使用一些能与酶非共价地相互作用而又能有效地保护酶的一些添加物，如聚乙二醇、右旋糖苷等，它们既能通过氢键固定在酶分子表面，也能通过氢键
7、有效地与外部水相连，从而保护酶的活力。一些添加物，如多元醇、多糖、多聚氨基酸、多胺等能通过调节酶的微环境来保护酶的活力。另一类添加物就是蛋白质。蛋白质分子之间相互作用时，其表面区域内排除了水分子，因而增加了相互作用力，其稳定性也就增加了。,15,用可溶性大分子，如聚乙二醇、右旋糖苷、肝素等，通过共价键连接于酶分子的表面，形成一层覆盖层。例如：用聚乙二醇修饰超氧物歧化酶 ，不仅可以降低或消除酶的抗原性，而且提高了抗蛋白酶的能力，延长了酶在体内的半衰期从而提高了酶药效。每分子核糖核酸酶与6.5分子的右旋糖酐结合，可以使酶活力提高到原有酶活力的2.25倍；每分子胰凝乳蛋白酶与11分子右旋糖酐结合，酶
8、活力达到原有酶活力的5.1倍,共价修饰,16,大分子修饰(共价)的过程,修饰剂的选择：大分子结合修饰采用的修饰剂是水溶性大分子。例如，聚乙二醇（PEG）、右旋糖酐、蔗糖聚合物（Ficoll）、葡聚糖、环状糊精、肝素、羧甲基纤维素、聚氨基酸等。要根据酶分子的结构和修饰剂的特性选择适宜的水溶性大分子。修饰剂的活化：修饰剂含有的基团往往不能直接与酶分子的基团进行反应而结合在一起。在使用之前一般需要经过活化，然后才可以与酶分子的某侧链基团进行反应。 修饰：将带有活化基团的大分子修饰剂与经过分离纯化的酶液，以一定的比例混合，在一定的温度、pH值等条件下反应一段时间，使修饰剂的活化基团与酶分子的某侧链基团
9、以共价键结合，对酶分子进行修饰。 分离：需要通过凝胶层析等方法进行分离，将具有不同修饰度的酶分子分开，从中获得具有较好修饰效果的修饰酶。,17,PEG、单甲氧基聚乙二醇（MPEG）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、聚丙烯酸（PAA）、葡聚糖、CD、羧甲基纤维素等可溶性分子。分子量500-20000的PEG类修饰剂应用最广，PEG分子末端有 2个-OH，两亲分子，无毒，没有免疫原性。如：辣根过氧化物酶用MPEG共价修饰后，极端pH下抗变性能力提高，耐热性提高。如：MPEG修饰的过氧化氢酶在有机溶剂中，溶解性和酶活提高，耐热性提高，在三氯乙烷中酶活提高200倍，水溶液中酶活力提高15-20倍。不足：影响
10、酶活性中心，必须事先了解酶活性部位的结构、或采取措施保护酶活性部位。,18,小分子修饰剂的化学修饰,小分子化合物对活性部位或活性部位之外的侧链基团化学修饰。包括：酶分子的表面化学修饰、内部修饰、非催化活性基团修饰、催化活性基团的修饰、酶蛋白的主链修饰、辅因子相关的修饰。共价修饰蛋白质达到稳定化的原因：1)获得不同于天然蛋白质构象的更稳定的构象；2）修饰“关键功能基团”而达到稳定化；3）引入了新功能基团可以形成附加的氢键和盐健；4）非极性试剂修饰加强蛋白质中的疏水相互作用；5）蛋白质表面基团的亲水化。,19,侧链基团修饰,酶蛋白的侧链基团是指组成蛋白质的氨基酸残基上的功能团。主要包括氨基、羧基、
11、巯基、胍基、酚基等。,这些基团的修饰可以形成各种副键，对酶蛋白空间结构的形成和稳定有重要作用。侧链基团一旦改变将引起酶蛋白空间构象的改变，从而改变酶的特性和功能。经常被修饰的残基是：亲核的Ser、Cys、Met、Thr、Lys、His亲电的Tyr、Trp,20,氨基修饰,修饰剂主要有：亚硝酸、2,4-二硝基氟苯(DNFB)、丹磺酰氯(DNS)、2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)、醋酸酐、琥珀酸酐、二硫化碳、乙亚胺甲酯、O甲基异脲顺丁烯二酸酐等。,1 乙酸酐，2 TNBS, 3 DNFB，4 碘代乙酸，5 还原烷基化，6 DNS,21,羧基修饰,羧基修饰剂：碳二亚胺重氮基乙酸盐、乙醇盐酸试剂、
12、异恶唑盐。,羧基修饰剂与侧链的羧基进行酯化、酰基化等反应，使蛋白质的空间构象发生改变碳二亚胺是酶分子羧基修饰最普遍采用的修饰剂。用此修饰法可以定量测定酶分子中羧基的数目,1碳化二亚胺，2硼氟化三甲锌盐，3甲醇-HCl,22,巯基修饰,常用的巯基修饰剂：酰化剂烷基化剂、马来酰亚胺、二硫苏糖醇、巯基乙醇、硫代硫酸盐、硼氢化钠。,1 DTNB, 2 4,4-二硫二吡啶(4-PDS), 3 对氯汞苯甲酸(PMB),23,胍基修饰,采用二羰基化合物与胍基反应生成稳定的杂环，它们可以在中性或者弱碱性的条件下，与精氨酸残基上的胍基反应，生成稳定的杂环类化合物。,胍基修饰剂的二羰基化合物：丁二酮、1,2-环己
13、二酮、丙二醛、苯乙二醛等。,1丁二酮/硼酸盐, 2 1,2-环己二酮, 3苯乙二醛,24,酚基修饰,蛋白质分子的酪氨酸残基上含有酚基。酚基的修饰包括酚羟基的修饰和苯环上的取代修饰。,碘化法、硝化法、琥珀酰化法四硝基甲烷（TNM）可以高度专一地对酚羟基进行修饰。,25,咪唑基修饰,常用修饰剂有：碘乙酸，焦碳酸二乙酯等。,组氨酸残基发生改变,1焦碳酸二乙酯，2碘代乙酸，3碘化反应,26,吲哚基修饰,修饰剂:N-溴代琥珀酰亚胺（NBS）、2-羟基-5-硝基苄溴（HNBB）4-硝基苯硫氯。,色氨酸含有吲哚基,27,分子内交联修饰,含有双功能基团的化合物（双功能试剂），如戊二醛、己二胺、葡聚糖二乙醛等，
14、可以在酶蛋白分子中相距较近的两个侧链基团之间形成共价交联，从而提高酶的稳定性根据其功能基团的特点分为：同型双功能基团化合物和异型双功能基团化合物。同型双功能基团化合物两端具有相同的功能基团，例如，己二胺H2N-(CH2)6NH2两端都含有氨基，可以与酶分子中的羧基形成酰胺键,；戊二醛OHC-(CH2)3-CHO的两端都含有醛基等，可与酶分子的氨基形成酰胺键或者与羟基反应形成酯键。异型双功能基团化合物的两端所含的功能基团不相同，可以与酶分子上不同的侧链基团反应。如，一端与酶分子的氨基作用，另一端与酶分子的巯基或羧基作用等。,28,酶蛋白主链修饰(肽链有限水解修饰),利用酶分子主链的切断和连接，在
15、肽链的限定位点进行水解，使酶的空间结构发生某些精细的改变，从而改变酶的特性和功能的方法，称为肽链有限水修饰。有些生物体可以生物合成不显示酶催化活性的酶原, 利用具有高度专一性的蛋白酶对其进行肽链有限水解修饰,显示出酶的催化活性或提高酶活力。,29,胃蛋白酶原的激活,30,酶分子的物理修饰,通过物理修饰，可以了解不同物理条件下，特别是在极端条件下（高温、高压、高盐、极端pH值等）由于酶分子空间构象的改变而引起酶的特性和功能的变化情况。特点：不改变酶的组成单位及其基团，酶分子中的共价键不发生改变，只是在物理因素的作用下，副键发生某些变化和重排，使酶分子的空间构象改变。如：高压方法处理纤维素酶，最适
16、温度降低，在30-40C的条件下，高压修饰的纤维素酶比天然酶活力提高10%。如：盐酸胍使胰蛋白酶的原有空间构象破环，通过透析除去变性剂后，在不同温度下，使酶重新构建新的空间构象：20C时重新构建的酶稳定性基本不变，在50C时构建的酶稳定性提高5倍。,31,酶修饰后的性质变化,热稳定性：一般来说，热稳定性有较大的提高。 抗原性：比较公认的是PEG和人血清白蛋白在消除酶的抗原性上效果比较明显。各类失活因子的抵抗力：修饰酶对蛋白酶、抑制剂均有一定的抵抗能力，从而提高其稳定性。半衰期：一般在体内的半衰期得到有效延长。由于酶分子经修饰后，增强对热、蛋白酶、抑制剂等的稳定性，从而延长了在体内的半衰期。最适
17、pH：大部分酶经化学修饰后，酶的最适pH发生了变化，这种变化在应用研究上有时具有重要意义。修饰酶最适pH更接近于生理环境，在临床应用上有较大意义。 Km的变化：大多数酶经修饰后，Vm没有明显变化，但有些酶经修饰后，Km值变大。,32,酶的金属离子置换修饰,把酶分子中的金属离子换成另一种金属离子，使酶的特性和功能发生改变的修饰方法称为金属离子置换修饰。若从酶分子中除去其所含的金属离子，酶往往会丧失其催化活性。如果重新加入原有的金属离子，酶的催化活性可以恢复或者部分恢复。若用另一种金属离子进行置换，则可使酶呈现出不同的特性。有的可以使酶的活性降低甚至丧失，有的却可以使酶的活力提高或者增加酶的稳定性
18、。,33,-淀粉酶中的钙离子（Ca2+），谷氨酸脱氢酶中的锌离子(Zn2+)，过氧化氢酶分子中的铁离子(Fe2+)，酰基氨基酸酶分子中的锌离子（Zn2+）,超氧化物歧化酶分子中的铜、锌离子(Cu2+,Zn2+)酶活提高：-淀粉酶中的钙离子（Ca2+）：发酵生产、保存和应用中，添加一定量Ca，有利提高和稳定其活力；Zn型蛋白酶（ZnCa置换）-Ca型蛋白酶，活力提高30%。稳定的改变：Fe型SOD置换成Mn-SOD，其对过氧化氢的稳定性显著提高，对叠氮钠（NaN3）的敏感性显著降低。动力学特性改变：酰基化氨基酸水解酶活性中心的Zn被Co置换后，N-氯-乙酰丙氨酸水解最适pH8.5降到7，Km增大
19、，,34,金属离子置换修饰的过程,a. 酶的分离纯化：首先将欲进行修饰的酶经过分离纯化，除去杂质，获得具有一定纯度的酶液。 b. 除去原有的金属离子：在经过纯化的酶液中加入一定量的金属螯合剂，如乙二胺四乙酸（EDTA）等，使酶分子中的金属离子与EDTA等形成螯合物。通过透析、超滤、分子筛层析等方法，将EDTA-金属螯合物从酶液中除去。此时，酶往往成为无活性状态。 c. 加入置换离子：于去离子的酶液中加入一定量的另一种金属离子，酶蛋白与新加入的金属离子结合，除去多余的置换离子，就可以得到经过金属离子置换后的酶。 金属离子置换修饰只适用于那些在分子结构中本来含有金属离子的酶。 用于金属离子置换修饰
20、的金属离子，一般都是二价金属离子。,35,酶分子修饰的基本要求和条件,对酶分子进行修饰必须在修饰原理、修饰剂和反应条件的选择以及酶学性质等方面都要有足够的了解。（1）酶的稳定性热稳定性、酸碱稳定性、作用温度、pH、抑制剂等。 （2）酶活性中心的状况 活性中心基团、辅因子等。其他如分子大小、性状、亚基数等。,36,酶分子修饰的条件,修饰反应尽可能在酶稳定条件下进行，并尽量不破坏酶活性功能的必需基团，使修饰率高，同时酶的活力回收高。（1）pH与离子强度 pH决定了酶蛋白分子中反应基团的解离状态。由于它们的解离状态不同，反应性能也不同。（2）修饰反应的温度与时间 严格控制温度和时间可以减少以至消除一
21、些非专一性的修饰反应。（3）反应体系中酶与修饰剂的比例,37,酶的组成单位置换修饰,酶分子的基本组成单位：氨基酸、核苷酸，他们是酶的化学结构和空间结构的基础，微小的改变引起酶的特性和功能。酶分子肽链上的某一个氨基酸换成另一个氨基酸氨基酸置换修饰。酶RNA的基本组成核苷酸，核苷酸链上上某一个核苷酸换成另一个核苷酸核苷酸置换修饰。,38,氨基酸或核苷酸的化学置换修饰,例如，Bender等成功地利用化学修饰法将枯草杆菌蛋白酶活性中心的丝氨酸转换为半胱氨酸，修饰后，该酶失去对蛋白质和多肽的水解能力，却出现了催化硝基苯酯等底物水解的活性。但是化学修饰法难度大，成本高，专一性差，而且要对酶分子逐个进行修饰
22、，操作复杂，难以工业化生产。,39,核苷酸定位突变技术置换修饰,例：L-19IVS 活性中心上碱基的改变引起其底物专一性的变化,40,定位突变技术用于酶分子修饰的主要过程,定点突变（site directed mutagenesis）是20世纪80年代发展起来的一种基因操作技术。是指在DNA序列中的某一特定位点上进行碱基的改变从而获得突变基因的操作技术。是蛋白质工程（Protein Engineering）和酶分子组成单位置换修饰中常用的技术。在DNA水平改变已有蛋白质的编码序列的基本方法，在已知的DNA序列中取代、插入或删除特定的核苷酸，从而改变酶结构中的个别AA残基。-理性分子设计新的酶分
23、子结构的设计突变基因碱基序列的确定突变基因的获得新酶的获得,41,新的酶分子结构的设计根据已知酶RNA或酶蛋白的化学机构和空间结构及特性，特别是根据酶在催化活性、稳定性、专一性等存在的问题，设计出想获得的新酶RNA的核苷酸排列次序或酶蛋白的氨基酸排列次序，确定想置换的核苷酸或氨基酸及其位置。,42,突变基因碱基序列的确定根据想获得酶蛋白的氨基酸排列次序，对照遗传密码，确定其对应的mRNA上的核苷酸序列，再依据碱基互补原则，确定此mRNA所对应的突变基因上的碱基序列，并确定需要置换的剪辑及其位置。,43,突变基因的获得根据突变基因的剪辑序列及其需要置换的碱基位置，首先用DNA合成仪合成有1-2个
24、碱基被置换了的寡核苷酸，再以此为引物通过PCR扩增获得大量的突变基因（寡核苷酸诱导的定位突变）新酶的获得上述定点突变获得的突变基因体外重组，插入到适宜的基因载体中，然后进行转化、转导、介导、基因枪、显微注射等技术，转入到适宜的宿主细胞，再在适宜的条件下进行表达，获得经过修饰的新酶。,44,45,定点突变的局限,基于酶蛋白的空间结构蛋白质结构与功能间关系的复杂性蛋白质序列如何决定高级结构、高级结构如何影响酶特性，如：蛋白质序列如何影响蛋白质的异源表达、高级结构的催化活力如何受非天然环境的影响等。成功率低,46,1、某些修饰剂对某一氨基酸侧链的化学修饰专一性是相对的，很少有对某一氨基酸侧链绝对专一
25、的化学修饰剂；2、化学修饰后的酶构象或多或少都有一些改变，这种构象的变化将妨碍对修饰结果的解释；3、酶的化学修饰只能在具有极性的氨基酸残基侧链上进行，目前还不能用化学修饰的方法研究其他氨基酸残基在酶结构与功能关系中的作用；4、酶化学修饰的结果对于研究酶结构与功能的关系能提供一些信息，但尚缺乏准确性和系统性。,蛋白质化学修饰的局限性,47,生物催化剂的定向进化dierected evolution,非理性设计irrational design,不需要事先了解酶的空间结构和催化机制，人为地创造特殊的计划条件，模拟自然进化机制（随即突变、基因重组、自然选择），在体外改造酶基因，并定向选择（筛选）出所
26、需要的性能优良的酶。酶分子定向进化是从一个或多个已经存在的亲本酶出发，经过基因的突变和重组，构造一个人工突变酶库，通过筛选最终获得预先期望的具有某些特性的进化酶。,48,定向进化原理：对单一酶分子基因进行定向进化为例，在待进化酶基因的PCR扩增反应中，利用Taq DNA多聚酶不具有3-5校对功能，并控制突变库的大小使其与特定的筛选容量相适合。选择适当条件以较低的比率向目的基因中随机引入突变，进行正定向突变间的随机组合以构建突变库，凭借定向的选择（或筛选）方法，选出所需要性质的优化酶，从而排除其他突变体。,49,定向进化的基本规则是“获取你所筛选的突变体”。定向进化的目的：在短时间内，通过反复的
27、突变/复制/筛选/选择过程，获取你想筛选的得以提高的突变酶，即定向进化=随机突变+选择。创始人：Stemer和Arnold，认为定向进化：是物种进行选择的一个高技术版本，是在分子水平上的繁育，研究的对象不是整个有机体，而是特定的基因或蛋白质。,50,定向进化的一般过程：,不仅能够改造单个蛋白质分子，而且可以改造整个生物合成和生物降解途径。（1）基因的选择：选择编码所需蛋白质的DNA序列。（2）突变或重组：通过易错PCR引入随即突变或DNA Shuffling等方法增加基因序列的多样性。（3）突变基因文库的构建：将获得的突变重组基因插入到表达载体中的构建突变库。（4）突变体酶的表达：将载体转入受
28、体细胞表达变异酶。（5）目的酶的鉴定：利用筛选和选择方法确定有益的特性克隆。（6）分离改良基因并重复上述过程，直至获得所需性质的蛋白质。,51,酶分子的体外定向进化原理,52,定向进化策略,Error prone PCR 易错PCRDNA shuffling DNA改组exon shuffling 外显子改组Hybrid enzyme 杂合酶Random-proming in vitro recombination PCR 体外随机引发重组Stagger extension process step 交错延伸Random-site-directed mutagenesis in vitro 随
29、机定向突变,53,易错PCR技术为代表的无性进化,无性突变是向单一酶分子基因内随机引入突变，制造突变酶库以便筛选。主要的手段包括易错PCR，盒式诱变，随机/定位诱变等。易错PCR是在采用Taq酶进行PCR扩增目的基因时，通过调整反应条件，例如：提高Mg2+离子浓度，加入Mn2+离子，改变体系中四种dNTP的浓度等，然后选择或筛选需要的突变体。其中关键之处在于突变率需要仔细调控。,54,通常，经过一次突变的基因很难获得满意的结果，由此发展出连续易错PCR策略，即将一次PCR扩增得到的有用突变基因作为下一次PCR扩增的模板，连续反应的进行随机诱变，使每一次获得的小突变基因作为下一次PCR扩增的模板
30、，连续反复地进行随机诱变，使每一次获得的小突变累积而产生有益突变。,55,DNA改组技术为代表的有性进化,DNA改组又称有性PCR，基本操作过程是从亚突变基因库中分离出来的DNA片断用脱氧核糖酶I（DNase I）或超声波随机切割，得到的随机片断经过加引物的多次PCR循环，在PCR循环过程中，随机片段之间互为模板和引物扩增，直到获得全长的基因，这导致来自不同基因的片段之间的重组。该策略将亲本基因群中的优势突变尽可能地组合在一起，最终使酶分子某一特性进一步进化，或是两个或更多的已优化的性质的结合。故优于连续易错PCR等无性进化策略。,56,DNA改组原理图,57,体外随机重组法（random p
31、riming in vitro recombination RPR)-有性进化RPR的基本原理是以单链DNA为模板，配合一套随机序列引物，先产生大量互补于模板不同位点的短DNA片段，由于碱基的错配和错误引发，这些短DNA片段中也会有少量的点突变。在随后的PCR反应中，它们互为引物进行合成，伴随组合，再组装成完整的基因长度。反复进行上述过程，直到获得满意的进化酶性质。,58,交错延伸法（staggered extension pocess, StEP)在PCR反应中，把常规的退火和延伸合并为一步，并大大缩短其反应时间，从而只能合成出非常短的新生链，经变性的新生链再作为引物与体系内同时存在的不同模
32、板退火，而继续延伸。此过程反复进行，直到产生完整长度的基因片段，结果会产生间隔的含不同模板序列的新生DNA分子。这样的新生DNA分子中，含有大量的突变组合，将有利于新的酶性质的产生。,59,60,基因家族之间的同源重组,以单一的酶分子基因进行定向进化时，基因的多样性起源于PCR等反应中的随机突变，但由于突变大多是有害的或者是中性的，采用这种过程集中有利突变的速度比较慢。如果从自然界中存在的基因家族出发，利用它们之间的同源顺序进行DNA改组实现同源重组，由于每一个天然酶的基因都是经过千百万年的进化，且基因间存在较显著的差异，所以获得的突变重组基因库中既体现了基因的多样化，又最大限度的排除了那些不
33、需要的突变。这种策略拓宽了酶分子突变库中的序列空间，而且由于限制了有害突变的掺入，并没有增加突变库的大小和筛选难度，从而保证了对很大的序列空间中有希望的区域进行快速定位。,61,外显子改组,真核基因中，编码序列被内含子间隔分开，转录后内含子被剪切，仅剩下编码序列（外显子）。在许多基因中，一个外显子编码对应一个折叠结构区域。因此有些科学家认为内含子间的重组，可使独立的外显子组装成编码新蛋白质的基因。此过程即外显子的改组。外显子的改组可导致蛋白质的快速进化。类似于DNA改组：两者都是在各自含突变的片段间进行交换，外显子改组尤其适用于真核生物。在自然界中，不同分子的内含子间发生同源重组，导致不同外显
34、子的结合，是产生新蛋白质的有效途径之一。不同于DNA改组：外显子改组是靠同一种分子间内含子的同源性带动，而DNA改组不受任何限制，发生在整个基因片段上。,62,外显子在蛋白质进化中的作用有两种看法：1. 外显子改组理论的“原生内含子”假说，认为当前所有的蛋白质都经过外显子改组。2. “后生内含子”假说认为外显子改组仅出现在真核细胞中，以提高这些生物基因的韧性。以上两种假说都具有这样一个认识基础，即：承认外显子改组是蛋白质进化的重要机制。进而为酶分子定向进化获得新酶提供了一条途径。,63,定向进化的应用,一. 对酶性质的改造1. 提高酶分子的催化活力L-天冬氨酸酶定向进化研究确定易错PCR筛选（
35、优势突变实验重组筛选)n。共进行了4轮易错PCR，每一轮PCR约筛选了3000个菌落。最终得到一株酶活力提高28倍的突变体。对天然酶和进化酶的酶学性质进行了分析，结果表明进化酶的pH稳定性和热稳定性均优于天然酶。,64,65,为了提高酶体外定向进化的成功率，需要注意以下几点：1. 确定目的酶在所需功能方面的进化程度和潜力。2.选择一个最接近人们需要的酶分子作为起点。3.若用于理论研究，应控制较低的突变率，只有选择了最佳的进化策略，保证库中所有克隆只含有单一氨基酸取代，那么从一代的功能变化便能与突变表型一一对应起来。4.建立有效且灵敏的选择方法，确保检测出单一氨基酸取代而引起的功能变化。,66,
36、目的物的检验方法：筛选和选择,任何一种方法都很很容易构建出就有高度多样性的突变基因库，而成功的关键在于建立一种有效的高通量筛选方法来确认性能改善的突变体。筛选和选择是定向进化的“有理”部分，其难度不亚于有理设计。筛选：将库中的每个个体进行活性调查，如果从表型上不能区分活性，则只能随机进行逐个测试，虽然表型和活性的关联有助于筛选，但无活性的个体也总是存活，增加了信噪比。选择：则使没有活性或活性不高的个体无法存活，选择的优点：可以同时分析较多的库中个体，因为不符合要求的个体根本不能出现,67,最好的筛选方法基于荧光底物或生色底物，筛选数目大概105。,68,代表性的选择方法,69,生物催化剂改造的
37、研究概况与展望,非合理设计的实用性很强，往往可以通过随机产生的突变，改进酶的特性。对酶分子的设计与改造方法是基于基因工程、蛋白质工程和计算机技术互补发展和渗透的结果，它标志着人类可以按照自己的意愿和需要改造酶分子，甚至设计出自然界中原来并不存在的全新的酶分子。目前，在酶分子人为改造技术还不成熟的情况下，通过定点突变技术改造成功了大量的酶分子，获得了酶活更高、稳定性更好的工业用酶。但总体来说，不能对复杂的生物体系进行有效的人为改造。近年来，随着易错PCR、DNA shuffling和高突变菌株等技术的应用，在对目的基因表型有高效检测筛选系统的条件下，建立酶分子的定向进化策略，尽管不清楚酶分子的机
38、构，仍能获得具有预期特性的新酶，基本上实现了酶分子的人为快速进化,70,有理设计是富人的技术：制备晶体需要充足的经验和时间，结构鉴定需要非常专业的实验室，分子模建和分子图像分析需要昂贵的计算机软件和硬件设备，更重要的是需要对目标酶相当熟悉、通晓生物学和结构化学的专家来制定改造方案。而定向进化的门槛要低的多：只要有分子生物学技术员就可以开始做，除了高通量筛选方法，其他都是标准的、低成本的常规技术。定向进化技术再结合基于生物信息学的有理设计手段，酶的改造就更有希望成功,71,组合改造,有理设计和定向进化的改造位置往往大相径庭：有理设计改造靠近活性中心、结合口袋的AA残基，定向进化的变异体的结构分析
39、表明突变点远离催化部位。组合改造：结构-功能研究必不可少+定向进化的惊人效果。如：谷草芽孢杆菌3-异丙基苹果酸脱氢酶的改造，用3个定点突变在进行易错PCR，可以提高热稳定性，易错PCR发现了另2个增加稳定性的突变，然后和先前的定点突变进行组合,72,应用：定向进化不仅应用与工业化酶制剂的酶活、热稳定性、耐操作条件，而且应用到疫苗和蛋白质药物的改造，许多领域取得成功。组合改造：体外定向进化是接近与自然进化的蛋白质工程研究策略，与合理设计互补，能更加全面的改造酶分子，体现蛋白质工程学的强大威力。定向进化改进：突变基因文库建立的方法还需不断优化，对突变控制的能力要进一步提高，在筛选目的突变酶方面有必
40、要建立一些能进行大规模筛选的小型化、自动化的筛选模式。,73,定向进化的应用,一. 对酶性质的改造二. 提高酶分子稳定性的定向进化三. 适应人工环境中提高酶活力或稳定性的进化四. 提高底物专一性和增加对新底物催化活力的进化五. 对映体选择的定向进化六. 变换催化反应专一性,74,对酶性质的改造-提高酶分子的催化活力,Eg.1 L-天冬氨酸酶定向进化研究L-天冬氨酸酶可催化富马酸和氨生成L-天冬氨酸。由于天冬氨酸酶的活性尚未完全确定，催化机理也需要进一步证实。在这种情况下通过酶的合理化设计来进一步提高酶活力具有一定的困难。为此采用定向进化的方法对酶基因进行改造，以期获得较高活力的酶。确定实验路线
41、：易错PCR筛选（优势突变实验重组筛选)n。共进行了4轮易错PCR，每一轮PCR约筛选了3000个菌落。最终得到一株酶活力提高28倍的突变体。对天然酶和进化酶的酶学性质进行了分析，结果表明进化酶的pH稳定性和热稳定性均优于天然酶。因此适合于工业化生产L-天冬氨酸。,75,Eg.2 -天冬氨酰二肽酶的定向进化 -天冬氨酰二肽酶，存在于鼠伤寒沙门氏菌中，能够高度专一地水解N端为L-天冬氨酸的-羧基形成的二肽。已知该酶是由299个残基组成的单亚基酶。酶分子内只有一个半胱氨酸残基，不存在二硫键。但-天冬氨酰二肽酶存在酶活力低、稳定性差、不利于工业生产的应用。所以利用定向化改造-天冬氨酰二肽酶以提高它的
42、酶活力和稳定性。改造方法是双重选择压力下对其进行筛选，一次性优化了该酶的两种性质。即经过3轮易错PCR和DNA改组，在酶活力和热稳定性双重选择压力下，筛选得到一株酶活力和热稳定性都有较大提高的进化酶。它的Kcat/Km值是野生型-天冬氨酰二肽酶的47倍。且在60保温30min后活力仍能保持80%。基因序列测定表明：共发生了3个导致了aa残基的改变。,76,二. 提高酶分子稳定性的定向进化,生产中高温可以提高底物溶解度，降低介质粘度，减少卫生污染和增加酶活力。而每一个酶分子都有一个特异的最适T范围。增加和降低温度都将导致酶活力不同程度的降低。而在实验室自然界酶的催化活力和最适T都会在进化过程中不
43、断的变化。Eg. 提高枯草菌蛋白酶的稳定性和酶活，利用连续易错PCR技术获得随机突变，并用交错延伸方法重组DNA，采用连续提高培养温度对突变体进行筛选，最终得到了一株突变体，使枯草菌蛋白酶的最适T提高17 。酶在65 下的T增加了200倍。,77,适应人工环境中提高酶活力或稳定性的进化,利用有机溶剂可以提高底物的溶解度或提高专一反应的速率。而天然酶在有机溶剂中，即使有时能保持天然构想也极易失活。因此在这种酶分子的应用环境中对酶分子的定向进化就十分必要。进化方法相同，只是在一个特定环境和条件下进行定向进化。,78,提高底物专一性和增加对新底物催化活力的进化,催化效率的提高是通过降低Km来实现的,79,对映体选择的定向进化,可定向进化提高R转氨酶的对映体选择性。转氨酶可以应用于生产几种手性aa。大多数转氨酶转化酮酸的效率都高于99%。但一种S型选择性转氨酶转化丁酮，仅有60%的手性专一性。通过10000个随机突变的菌株的筛选，获得了10个手性专一性在8094%间的酶。个别突变体专一性达到8591%。,80,变换催化反应专一性,对映体的选择性合成是酶催化反应的一种重要的应用。但是许多酶自身对底物较强的选择性阻止了科学家们投入更多的精力去研究新的立体选择性酶 ，也妨碍了各种酶的商业化。最近研究表明，立体选择酶的专一性是可以变化的，利用定向进化可以改变它的专一性。,
