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1、Chapter 4 Modification of Enzyme Molecule,酶的分子修饰,Contents of chapter 4,1、什么是酶分子修饰,2、酶分子修饰的基本要求和条件,3、酶分子的修饰方法,4、酶修饰后的性质变化,Go,Go,Go,Go,5、酶的定向进化附：酶的活性中心,Go,4.1 什么是酶分子修饰？,通过各种方法使酶分子的结构发生某些改变，从而改变酶的某些特性和功能的技术过程称为酶分子修饰。即：在体外将酶分子通过人工的方法与一些化学基团（物质），特别是具有生物相容性的物质，进行共价连接，从而改变酶的结构和性质。,酶化学修饰原因,1 稳定性不够，不能适应大量生产的
2、需要。2 作用的最适条件不符。3 酶的主要动力学性质的不适应。4 临床应用的特殊要求。,酶修饰的方向,1)通过分子修饰的方法来改变已分离出来的天然酶的活性。2)通过基因工程方法改变编码酶分子的基因而达到改造酶的目的。,酶分子修饰的意义,提高酶的活力 activity增强酶的稳定性 stability降低或消除酶的抗原性 immunological property研究和了解酶分子中主链、侧链、组成单位、金属离子和各种物理因素对酶分子空间构象的影响 structure,一、如何增强酶天然构象的稳定性与耐热性 修饰剂分子存在多个反应基团，可与酶形成多点交联。使酶的天然构象产生“刚性”结构。二、如何
3、保护酶活性部位与抗抑制剂 大分子修饰剂与酶结合后，产生的空间障碍或静电斥力阻挡抑制剂，“遮盖”了酶的活性部位。,酶分子修饰的原理：,三、如何维持酶功能结构的完整性与抗蛋白水解酶 酶化学修饰后通过两种途径抗蛋白水解酶：1.大分子修饰剂产生空间障碍阻挡蛋白水解酶接近酶分子。“遮盖”酶分子上敏感键免遭破坏。2.酶分子上许多敏感基团交联上修饰剂后，减少了受蛋白水解酶破坏的可能性。,四、如何消除酶的抗原性及稳定酶的微环境1.酶蛋白氨基酸组成的抗原决定簇，与修饰剂形成了共价键。破坏了抗原决定簇抗原性降低乃至消除“遮盖”了抗原决定簇阻碍抗原、抗体结合2.大分子修饰剂本身是多聚电荷体，能在酶分子表面形成“缓冲
4、外壳”，抵御外界环境的极性变化，维持酶活性部位微环境相对稳定。,4.2 酶分子修饰的基本要求和条件,对酶分子进行修饰必须在修饰原理、修饰剂和反应条件的选择以及酶学性质等方面都要有足够的了解。一 修饰剂的要求二 酶性质的了解三 反应条件的选择四 酶修饰方法,修饰剂的要求,1 修饰剂的分子量、修饰剂链的长度对蛋白质的吸附性。2 修饰剂上反应基团的数目及位置。3 修饰剂上反应基团的活化方法与条件。,酶的性质,（1）酶的稳定性 热稳定性、酸碱稳定性、作用温度、pH、抑制剂等。（2）酶活性中心的状况 活性中心基团、辅因子等。其他如分子大小、性状、亚基数等。（3）酶分子侧链基团的化学性质及反应活泼性等。,
5、酶分子修饰的条件,修饰反应尽可能在酶稳定条件下进行，并尽量不破坏酶活性功能的必需基团，使修饰率高，同时酶的活力回收高。（1）pH与离子强度 pH决定了酶蛋白分子中反应基团的解离状态。由于它们的解离状态不同，反应性能也不同。（2）修饰反应的温度与时间 严格控制温度和时间可以减少以至消除一些非专一性的修饰反应。（3）反应体系中酶与修饰剂的比例,酶修饰方法选择,1 酶分子侧链基团的化学修饰 2 有机大分子对酶的化学修饰3 蛋白质类及其他。,4.3 酶分子的修饰方法,金属离子置换修饰,大分子结合修饰(共价/非共价)侧链基团修饰肽链有限水解修饰氨基酸置换修饰酶分子的物理修饰,(1)酶的金属离子置换修饰,
6、把酶分子中的金属离子换成另一种金属离子，使酶的特性和功能发生改变的修饰方法称为金属离子置换修饰。有些酶分子中含有金属离子，而且往往是酶活性中心的组成部分，对酶催化功能的发挥有重要作用。-淀粉酶中的钙离子（Ca2+），谷氨酸脱氢酶中的锌离子(Zn2+)，过氧化氢酶分子中的铁离子(Fe2+)，酰基氨基酸酶分子中的锌离子（Zn2+）,超氧化物歧化酶分子中的铜、锌离子(Cu2+,Zn2+)若从酶分子中除去其所含的金属离子，酶往往会丧失其催化活性。如果重新加入原有的金属离子，酶的催化活性可以恢复或者部分恢复。若用另一种金属离子进行置换，则可使酶呈现出不同的特性。有的可以使酶的活性降低甚至丧失，有的却可以
7、使酶的活力提高或者增加酶的稳定性。,金属离子置换修饰的过程,a.酶的分离纯化：首先将欲进行修饰的酶经过分离纯化，除去杂质，获得具有一定纯度的酶液。b.除去原有的金属离子：在经过纯化的酶液中加入一定量的金属螯合剂，如乙二胺四乙酸（EDTA）等，使酶分子中的金属离子与EDTA等形成螯合物。通过透析、超滤、分子筛层析等方法，将EDTA-金属螯合物从酶液中除去。此时，酶往往成为无活性状态。c.加入置换离子：于去离子的酶液中加入一定量的另一种金属离子，酶蛋白与新加入的金属离子结合，除去多余的置换离子，就可以得到经过金属离子置换后的酶。金属离子置换修饰只适用于那些在分子结构中本来含有金属离子的酶。用于金属
8、离子置换修饰的金属离子，一般都是二价金属离子。,金属离子置换修饰的作用：,(1)阐明金属离子对酶催化作用的影响：(2)提高酶活力：(3)增强酶的稳定性：(4)改变酶的动力学特性：,将锌型蛋白酶的Zn2+除去，然后用Ca2+置换成钙型蛋白酶，则酶活力可提高20-30%。若将钙型蛋白酶制成结晶，则其酶活力比锌型蛋白酶结晶的酶活力提高2-3倍。,(2)酶的大分子修饰,使用一些能与酶非共价地相互作用而又能有效地保护酶的一些添加物，如聚乙二醇、右旋糖苷等，它们既能通过氢键固定在酶分子表面，也能通过氢键有效地与外部水相连，从而保护酶的活力。一些添加物，如多元醇、多糖、多聚氨基酸、多胺等能通过调节酶的微环境
9、来保护酶的活力。另一类添加物就是蛋白质。蛋白质分子之间相互作用时，其表面区域内排除了水分子，因而增加了相互作用力，其稳定性也就增加了。,非共价修饰,采用水溶性大分子与酶的侧链基团共价结合，使酶分子的空间构象发生改变，从而改变酶的特性与功能的方法,用可溶性大分子，如聚乙二醇、右旋糖苷、肝素等，通过共价键连接于酶分子的表面，形成一层覆盖层。例如：用聚乙二醇修饰超氧物歧化酶，不仅可以降低或消除酶的抗原性，而且提高了抗蛋白酶的能力，延长了酶在体内的半衰期从而提高了酶药效。每分子核糖核酸酶与6.5分子的右旋糖酐结合，可以使酶活力提高到原有酶活力的2.25倍；每分子胰凝乳蛋白酶与11分子右旋糖酐结合，酶活
10、力达到原有酶活力的5.1倍,共价修饰,大分子修饰(共价)的过程,修饰剂的选择：大分子结合修饰采用的修饰剂是水溶性大分子。例如，聚乙二醇（PEG）、右旋糖酐、蔗糖聚合物（Ficoll）、葡聚糖、环状糊精、肝素、羧甲基纤维素、聚氨基酸等。要根据酶分子的结构和修饰剂的特性选择适宜的水溶性大分子。修饰剂的活化：作为修饰剂中含有的基团往往不能直接与酶分子的基团进行反应而结合在一起。在使用之前一般需要经过活化，然后才可以与酶分子的某侧链基团进行反应。修饰：将带有活化基团的大分子修饰剂与经过分离纯化的酶液，以一定的比例混合，在一定的温度、pH值等条件下反应一段时间，使修饰剂的活化基团与酶分子的某侧链基团以共
11、价键结合，对酶分子进行修饰。分离：需要通过凝胶层析等方法进行分离，将具有不同修饰度的酶分子分开，从中获得具有较好修饰效果的修饰酶。,应用：消除了抗原性如：PEG超氧化物歧化酶（SOD）PEG溶血类蛋白质（链激酶、尿激酶等）PEG天门冬酰胺酶（ASNase）延长了酶在体内的半衰期又如：用Dextran修饰-淀粉酶，淀粉酶，胰蛋白酶、过氧化氢酶，提高了酶的热稳定性。,聚乙二醇是线性分子具有良好的生物相容性和水溶性，在体内无毒性、无残留、无免疫原性，并可消除酶的抗原性，使其末端活化后可以与酶产生交联，因而，它被广泛用于酶的修饰。,大分子结合修饰的作用：,(1)通过修饰提高酶活力:：(2)通过修饰可以
12、增强酶的稳定性：(3)通过修饰降低或消除酶蛋白的抗原性：,(3)酶分子的侧链基团修饰,采用一定的方法（一般为化学法）使酶蛋白的侧链基团发生改变，从而改变酶分子的特性和功能的修饰方法。可以用于研究各种基团在酶分子中的作用及其对酶的结构、特性和功能的影响。在研究酶的活性中心中的必需基团时经常采用。,酶有蛋白类酶和核酸类酶两大类别。它们的侧链基团不同，修饰方法也有所区别。,（1）蛋白类酶主要由蛋白质组成，酶蛋白的侧链基团是指组成蛋白质的氨基酸残基上的功能团。主要包括氨基、羧基、巯基、胍基、酚基、咪唑基、吲哚基等。这些基团可以形成各种副键，对酶蛋白空间结构的形成和稳定有重要作用。侧链基团一旦改变将引起
13、酶蛋白空间构象的改变，从而改变酶的特性和功能。（2）核酸类酶主要由核糖核酸（RNA）组成，酶RNA的侧链基团是指组成RNA的核苷酸残基上的功能团。RNA分子上的侧链基团主要包括磷酸基，核糖上的羟基，嘌呤、嘧啶碱基上的氨基和羟基（酮基）等。,催化活性/非催化活性基团的修饰,对非催化基团修饰可改变酶的动力学性质，改变酶对特殊底物的束缚能力。经常被修饰的残基是：亲核的Ser、Cys、Met、Thr、Lys、His亲电的Tyr、Trp对催化活性基团可以通过选择性修饰侧链成分来实现氨基酸的取代。,几种重要的修饰反应：烷基化反应酰化反应氧化还原反应芳香环取代反应,1.化学修饰反应的类型,1)烷基化反应试剂
14、特点：烷基上带活泼卤素，导致酶分子的亲核基团（如NH2，-SH等）发生烷基化。可作用基团：氨基（Lys，Arg），巯基（Cys），羧基（Asp、Glu），甲硫基（Met），咪唑基（His）。修饰剂：2，4二硝基氟苯、碘乙酸、碘乙酰胺等。,烷基化反应,2)酰基化反应试剂特点：含有 结构，作用于侧链基团上的亲核基团，使之酰基化。可作用基团：氨基，巯基，醇羟基（Ser、Thr），酚羟基（Tyr）,酰基化反应,3)氧化和还原反应试剂特点：具有氧化性或还原性。氧化剂：H2O2，N-溴代琥珀酰亚胺可被氧化的侧链基团：巯基，甲硫基，吲哚基（Trp）、咪唑基，酚基等。还原剂：2巯基乙醇、DTT等。可被还原的侧
15、链基团：二硫键。,连四硫酸盐氧化巯基，DTT还原逆回，用于保护巯基。,4)芳香环取代反应试剂：卤（碘）化，硝化试剂。碘代：I2+HI 硝化：(NO2)4C+(NO2)3CH,（四硝基甲烷）,2.特定氨基酸残基侧链基团的化学修饰1)氨基的化学修饰：来源：Lys,Arg,His,Gln修饰反应：酰基化与烷基化酰基化修饰剂:三硝基苯磺酸（TNBS）、丹磺酰氯（DNS）烷基化修饰剂：2，4二硝基氟苯（DNFB）、碘乙酸、碘乙酰胺、亚硝酸等,2)羧基的化学修饰修饰羧基的反应专一性较差。常用水溶性碳化二亚胺修饰天冬氨酸和谷氨酸。可定量测定酶分子中羧基的数目。+水溶性碳化二亚胺,3)胍基的化学修饰来源：Ar
16、g修饰反应：本质上是羰基对氨基酰基化。修饰剂：丁二酮 二羰基化合物 1，2环己二酮 苯乙二醛,4)巯基的化学修饰 来源：Cys 修饰反应:烷基化 修饰剂：碘乙酸(IAA)碘乙酰胺(IAM)E-SH+R-X E-SR+HXN-乙基马来酰亚胺（NEM）（常用的专一修饰巯基试剂）,5)二硫键的化学修饰还原：巯基乙醇、二硫苏糖醇（DTT）,氧化：过甲酸:Performic acid,6)咪唑基的化学修饰 来源：His 修饰反应:酰基化与烷基化 酰基化修饰剂:常用焦碳酸二乙酯（diethyl paracarbonate）+C2H5OH+CO2 烷基化修饰剂：碘乙酸,+ICH2COOH+HI,7）酚羟基的
17、化学修饰来源：Tyr修饰反应：芳香环取代反应修饰剂：碘、硝化试剂（四硝基甲烷）,8）吲哚基的化学修饰 来源：Trp 修饰反应：氧化反应 修饰剂：N-溴代琥珀酰亚胺,各种氨基酸侧链的修饰剂,但解释修饰效果须十分小心，因为：任何一种修饰剂不是绝对专一的。有些修饰剂引起蛋白质构象变化失活，不一定是活性中心基团被共价修饰。不同部分的相同基团，修饰效果不同，分子内部的必需基团，不易被修饰。,(4)酶蛋白主链修饰(肽链有限水解修饰),利用酶分子主链的切断和连接，使酶分子的化学结构及其空间结构发生某些改变，从而改变酶的特性和功能的方法。酶蛋白主链修饰主要是靠酶切/酶原激活法。,酶蛋白的肽链被水解后，可能出现
18、以下三种情况中的一种：1 引起酶活性中心的破坏，酶失去催化功能。2 仍维持活性中心的完整构象，保持酶活力。3 有利于活性中心与底物结合并形成准确的催化部位，酶活力提高。后两种情况，肽链的水解在限定的肽键上进行，称肽链有限水解。,主链切断修饰,应用实例：1）提高酶活力：2）消除抗原性：,主链连接修饰,将两种或两种以上的酶通过主链连接在一起，形成一个酶分子具有两种或多种催化活性。多酶融合体,肽链上含有2种或2种以上催化活性的酶，往往是基因融合的产物。它可以是单体酶，也可以是寡聚酶或更复杂的多酶体系。例如Ecoli天冬氨酸激酶I-高丝氨酸脱氢酶I融合体，在天冬氨酸到丝氨酸生物合成中催化两步反应，该酶
19、是4四聚体，每条肽链含有两个活性：N-端部分的天冬氨酸激酶和C-端部分的高丝氨酸脱氢酶，所以又称双头酶；来自樟树种子的克木毒蛋白由一条肽链组成，具有3种不同的酶活性；红色链孢霉的AROM多酶融合体是一个二聚体，每条肽链含5种酶活性。,a、胃蛋白酶原的激活,b、胰蛋白酶原（trypsinogen）的激活,c、胰凝乳蛋白酶原（chymotrypsinogen）的激活,氨基酸或核苷酸的置换修饰可以采用化学修饰方法，例如，Bender等成功地利用化学修饰法将枯草杆菌蛋白酶活性中心的丝氨酸转换为半胱氨酸，修饰后，该酶失去对蛋白质和多肽的水解能力，却出现了催化硝基苯酯等底物水解的活性。但是化学修饰法难度大
20、，成本高，专一性差，而且要对酶分子逐个进行修饰，操作复杂，难以工业化生产。现在常用的氨基酸置换修饰的方法是定点突变技术。定点突变（site directed mutagenesis）是20世纪80年代发展起来的一种基因操作技术。是指在DNA序列中的某一特定位点上进行碱基的改变从而获得突变基因的操作技术。是蛋白质工程（Protein Engineering）和酶分子组成单位置换修饰中常用的技术。定点突变技术，为氨基酸或核苷酸的置换修饰提供了先进、可靠、行之有效的手段。,(5)氨基酸置换修饰,酶分子的定点突变,1、基因序列分析2、蛋白质结构分析3、酶活性中心分析4、引物设计进行基因定点突变5、酶基
21、因克隆表达6、变异特性分析,(6)酶分子的物理修饰,通过物理修饰，可以了解不同物理条件下，特别是在极端条件下（高温、高压、高盐、极端pH值等）由于酶分子空间构象的改变而引起酶的特性和功能的变化情况。特点在于不改变酶的组成单位及其基团，酶分子中的共价键不发生改变，只是在物理因素的作用下，副键发生某些变化和重排。,回本章目录,4.4 酶修饰后的性质变化,热稳定性：一般来说，热稳定性有较大的提高。抗原性：比较公认的是PEG和人血清白蛋白在消除酶的抗原性上效果比较明显。各类失活因子的抵抗力：修饰酶对蛋白酶、抑制剂均有一定的抵抗能力，从而提高其稳定性。半衰期：一般在体内的半衰期得到有效延长。由于酶分子经
22、修饰后，增强对热、蛋白酶、抑制剂等的稳定性，从而延长了在体内的半衰期。最适pH：大部分酶经化学修饰后，酶的最适pH发生了变化，这种变化在应用研究上有时具有重要意义。修饰酶最适pH更接近于生理环境，在临床应用上有较大意义。Km的变化：大多数酶经修饰后，Vm没有明显变化，但有些酶经修饰后，Km值变大。,回本章目录,酶蛋白质工程的目标,功能改变 减小Km，Vmax，pH改变，去除抑制部位，改变专一性结构特性 稳定性新体系构建 杂合酶和多功能酶，添加便于分离的片断,化学修饰方法的局限性：随着M上升，扩散速度受限；蛋白表面被部分屏蔽，生物活性降低修饰剂呈现多聚合度，选择性不够高,蛋白质工程的主要手段,基
23、因突变定点突变；随机突变基因剪接基因缺失；基因融合,4.5 酶的定向进化,酶分子的合理设计(rational design)酶分子的定向进化(directed evolution),酶的合理设计,蛋白质工程改造的实际应用 1.枯草杆菌蛋白酶 1）增强抗氧化性 2）改变底物特异性,枯草杆菌蛋白酶是重要的工业用酶,但该酶很容易被氧化,氧化后的蛋白酶很快地失去活性.丝氨酸蛋白酶，275aa用途：洗衣粉缺点：表面剂对其结构破坏，漂白剂化学氧化失活活性位点：221的Ser,222位是易被氧化的Met,也是酶的活性中心.将Met222突变为Ala,得到了抗氧化能力较强并保留较高活性的突变。活性53；Ser
24、236位于横贯枯草蛋白酶E的-螺旋末端，远离催化活性中心，引入Ser236Cys,可能会形成分子间二硫键，有利于提高酶的稳定性。Ser236Cys变体酶(BP-1)活性是野生型蛋白酶E的15倍，热稳定性提高3倍；枯草杆菌蛋白酶的第99位门冬氨酸及156位谷氨酸替换为赖氨酸后，使这个酶在pH7时的活力提高了1倍，在pH6时活力提高了10倍。,2.溶菌酶（Lysozyme）1)抗菌范围的扩大 2)热稳定性的提高,T4溶菌酶的第 51位苏氨酸转变成脯氨酸,使该酶对ATP的亲和力增强,酶活力提高了25倍.,3：胰蛋白酶Arg117位自熔点缺失突变稳定性提高将酶分子表面正电荷改变成负电荷对精氨酸专一性提
25、高,4 木糖异构酶,特点：四聚体，45000，金属离子辅助因子缺点：热失活降低固定化寿命原因：两个二聚体相对欠稳定，几个lys高糖下易糖化；gly中断稳定的螺旋结构改造：Gly70S;Gly74T;Ala73S半衰期93上升114h,1993年,美国科学家Arnold F H首先提出酶分子的定向进化的概念，并用于天然酶的改造或构建新的非天然酶。,蛋白质定向进化概念的提出,体外定向进化的意义,理论上，蛋白质分子蕴藏着很大的进化潜力，很多功能有待于开发，这是酶的体外定向进化的基本先决条件。所谓酶的体外定向进化，又称实验分子进化，属于蛋白质的非合理设计，它不需事先了解酶的空间结构和催化机制，通过人为
26、地创造特殊的条件，模拟自然进化机制(随机突变、重组和自然选择)，在体外改造酶基因，并定向选择出所需性质的突变酶。酶的体外定向进化技术极大地拓展了蛋白质工程学的研究和应用范围，特别是能够解决合理设计所不能解决的问题，为酶的结构与功能研究开辟了崭新的途径，并且正在工业、农业和医药等领域逐渐显示其生命力。,人为地创造特殊的进化条件，模拟自然进化机制，在体外对基因进行随机突变，从一个或多个已经存在的亲本酶（天然的或者人为获得的）出发，经过基因的突变和重组，构建一个人工突变酶库，通过一定的筛选或选择方法最终获得预先期望的具有某些特性的进化酶。,定向进化技术,定向进化的原理,定向进化的原理,在待进化酶基因
27、的PCR扩增反应中，利用Taq DNA聚合酶不具有3-5校对功能的性质，配合适当条件，以很低的比率向目的基因中随机引入突变，构建突变库，凭借定向的选择方法，选出所需性质的优化酶(或蛋白质)，从而排除其他突变体。定向进化的基本规则是“获取你所筛选的突变体”。定向进化=随机突变+选择。前者是人为引发的，后者虽相当于环境，但只作用于突变后的分子群，起着选择某一方向的进化而排除其他方向突变的作用，整个进化过程完全是在人为控制下进行的,随机突变的策略,易错PCR技术(error-prone PCR)DNA改组(DNA shuffling)：由美国Stemmer 于1994 年首次提出 一项体外重组技术随
28、机引发重组(RPR)1998 年,Arnold 提出了一种有效的新方法交错延伸技术(StEP)：由Zhao 等 提出,是一种简化的DNA shuffling 技术,易错PCR,易错 PCR（error prone PCR）是指在扩增目的基因的同时引入碱基错配，导致目的基因随机突变。连续易错PCR(sequential error prone PCR)策略。即将一次PCR扩增得到的有用突变基因作为下一次PCR扩增的模板，连续反复地进行随机诱变。,DNA改组和外显子改组,DNA改组(DNA shuffling)又称有性PCR(sexual PCR)，原理如图所示。,外显子改组(exon shuff
29、ling类似于DNA改组，与但与其不同，它是靠同一种分子间内含子的同源性带动，而DNA改组不受任何限制，发生在整个基因片段上。,体外随机引发重组,体外随机引发重组(random priming in vitro recombination,RPR)以单链DNA为模板，配合一套随机序列引物，先产生大量互补于模板不同位点的短DNA片段，由于碱基的错配和错误引发，这些短DNA片段中也会有少量的点突变，在随后的PCR反应中，它们互为引物进行合成，伴随组合，再组装成完整的基因长度。,所谓随机引物是含有各种可能排列顺序的寡核苷酸片段的混合物，它可以与任意核苷酸序列杂交，起到聚合酶反应引物的作用。,交错延伸
30、,交错延伸(stagger extension process,StEP)在PCR反应中把常规的退火和延伸合并为一步,缩短其反应时间，从而只能合成出非常短的新生链，经变性的新生链再作为引物与体系内同时存在的不同模板退火而继续延伸。此过程反复进行，直到产生完整的基因长度。,定向进化的选择策略,1、定向进化中，突变具有随机性，但通过选择特定方向的突变限定了进化趋势，加之控制实验条件，限定突变种类，降低突变率，缩小突变库的容量，这不仅减少了工作量，更重要的是加快了酶在某一方向的进化速度。2、通常,筛选方法必须灵敏,至少与目的性质相关。另有一些其他的筛选方法，如加入能产生可见光信号的底物或利用绿色荧光
31、蛋白的荧光性质等。高通量的筛选体系,酶的筛选,酶的筛选可分为选择培养基筛选法和检测培养基筛选法。选择培养基筛选法通过添加或减少某种成分使目的菌株获得生长优势，而其它菌株的生长受到抑制，通过多次的筛选分离最终得到目的菌株。单一碳源的选择性培养基，使能够利用反应底物的微生物获得生长优势而大量增殖，无法利用反应底物的微生物由于无法获得营养生长受到抑制，从而得到所需的目的菌株。互补的方法，即在有营养缺陷的培养基上筛选能合成该种营养物质的菌株。检测培养基筛选法通常是在培养基中加入某种试剂或化学药物，使培养后发生某种可以辨别的变化，如培养基的透明度的变化或菌落周围颜色的变化，由此区别不同类型或生理特性不同
32、的微生物。这种筛选可以在检测平板中进行，也可以在微孔滴定板中进行，借助一些检测仪器很容易实现高通量筛选。,酶的高通量筛选基于比色法和荧光检测的高通量筛选,基于检测培养基筛选法的，生色基团或荧光基团的底物参加的催化反应是最容易实现高通量筛选的。通过监测反应过程中的颜色和荧光的变化可以有效地监测反应的进行。使用比色计或荧光计检测显色或荧光底物，pH指示剂显色反应和荧光共振能量转移还可以实现高通量实时检测。,基于比色法和荧光检测的高通量筛选显色或荧光底物的高通量筛选,大部分荧光和显色底物都带高酸度的苯酚或苯胺离去基团，当前广泛应用的是以硝基苯和伞形酮衍生物作为底物的检测方法。基于这种技术的检测方法简
33、单快捷，结果准确容易实现数字化，可以做到实时监控，得到了广泛的应用。但这类底物通常不够稳定，反应特异性差，反应速度快，比普通底物高出几个数量级，不适用于一些难转化的和难合成的反应以及粗酶催化的反应和一些条件剧烈的反应，如高温，高的pH值等。,基于比色法和荧光检测的高通量筛选 pH指示剂显色高通量筛选,许多水解反应伴随pH的变化，根据反应介质和反应平衡常数选择合适的pH指示剂可以准确的检测水解反应速率。pH指示剂显色技术被广泛地用于腈水解酶和酯水解酶等水解酶的筛选Quick E法通过pH指示剂的显色反应监测互为对映体底物的水解速率，根据水解速率的差异来评价酶的立体选择性。这一技术最近被用于荧光假
34、单胞菌酯酶定向进化中突变体的筛选，得到了立体选择性明显提高的突变体,Quick E 示意图,基于反应热力学变化红外检测的高通量筛选,所有的物质都可以发射红外线，光电平面聚焦阵列红外检测器可以灵敏地检测反应过程中的热量变化（检测波长范围3-5m，温度变化10-100mK）。放热反应在红外成像中表现为“热”点，相反吸热反应表现“冷”点，通过对“热”点或“冷”点的分辨，可以检测反应的进行与否。,红外检测技术是一种新颖的有发展前途的高通量筛选技术，它不需要生色基团或荧光基团的加入，避免了比色和荧光检测方法的局限性，但是这种技术目前还无法进行定量，只能检测催化活性较高的酶，对酶活的进一步研究还需借助传统
35、方法，方法本身还需要进一步的发展和完善。,借助复杂的仪器设备的高通量筛选,高效液相色谱,质谱和毛细管电泳也被用来检测反应速度，但是作为一种高通量筛选技术，这些方法测试成本较高，而且每天每台仪器最高只能检测几百个样品，方法的使用受到一定的限制。采用放射性同位素标记底物进行脂酶的筛选取得了较好的实验结果，这种方法灵敏而且准确，但由于放射性其使用会受到限制无法推广使用。,酶的筛选（小结）,比色和荧光检测为代表的高通量筛选方法得到了广泛的应用，是当前酶的高通量筛选的主要研究和发展方向。随着生物催化在精细化工和医药行业的广泛应用，对手性纯化合物的大量需求使手性酶的筛选成了当前的研究热点，同时产品价值的提
36、高也将使得很多借助复杂仪器设备的高成本的检测方法成为可能并将逐渐得到更多的应用。,酶的体外定向进化应用实例,回本章目录,定向进化与自然进化的异同点,定向进化的实质是达尔文进化论在分子水平上的延伸和应用。定向进化是在体外模拟突变、重组和选择的自然进化，使进化朝着人们需要的方向发展。两者的不同：,进化动力不同：保守突变 非保守取代；进化方向不同：适应突变的积累；进化速度不同：非常漫长 只需几年、甚至几天；进化目标不同：适应环境 超越生物学意义的要 求，探索所希望的蛋白质在顺序空间的可及性。,定向进化技术,Fig.1.Publication rate of the directed evolutio
37、n articles in biomedical literature between 1995 and 2004.The analysis was achieved using the National Institutes of Health MEDLINE bibliographic database.The figure shows the total number of articles published each year,which contain the key words directed evolution in their titles.,展望,总之，具有新功能和特性的
38、酶可以通过从大量未知的自然种系中寻找以及对现有的天然酶进行改造，对现有的天然酶进行改造可能更加合适。我们相信，随着基因工程技术、蛋白质工程技术以及高通量筛选技术的迅速发展，定向进化技术将成为获得新酶的一个有效快捷的手段，这将为工业生产提供更多性能优良的酶制剂。,附1 酶的稳定性 1.酶稳定的分子原因 1）共价键：肽键（peptide bond）稳定蛋白质和酶主链的核心力量。二硫键（disulfide bond）由两个Cys的侧链-SH氧化而成，是某些蛋白质维持结构稳定性的主要因素。,2）非共价键：疏水相互作用（hydrophobic interaction）:是维持蛋白质分子稳定的主要的作用力
39、。氢键（hydrogen bond）：是稳定蛋白质分子的空间结构，特别是二级结构的重要力量。,静电相互作用（electrostatic interaction）：又称离子键、盐键、盐桥，是正负电荷间的作用力。对酶分子稳定性有关的盐键大部分形成于分子表面上。范德华力：在电中性分子之间的非共价结合。分子间形成的范德华力越大越稳定。金属离子：Ca2+、Mg2+和Zn2+等高价阳离子与多肽链不稳定的弯曲部分结合，可显著增加酶分子的稳定性。,2.稳定酶的方法,附2：酶的活性中心（active site）一、活性中心的概念酶的必需基团(essential group):与酶活性有关的基团酶的活性中心(ac
40、tive center):由必需基团构成的与酶催化活性有关的特定区域.,酶分子,非必需基团,必需基团,活性中心必需基团,活性中心外必需基团,结合基团,催化基团,非活性中心,活性中心,活性中心的重要化学基团 7种氨基酸出现的频率最高 Lys Asp Glu Cys His Tyr Ser（兰天果拌猪肉丝）某些功能基团,如（氨基、羧基、巯基、羟基 和咪唑基）是酶的必需基团。赖氨酸的氨基 天冬氨酸和谷氨酸的羧基 半胱氨酸的巯基 组氨酸的咪唑基 酪氨酸和丝氨酸的羟基,与底物相结合，使底物与酶的一定构象形成复合物,二、活性中心的共性,(1)活性部位只占酶分子很小的一部分（1-2%）。(2)活性部位是一个
41、三维实体。(3)活性中心位于酶分子表面的疏水性裂缝中。(4)活性中心构象不是固定不变的（诱导契合）。(5)酶与底物通过盐键、氢键、范德华力和疏水作用等次级键结合。,Active siteThe active site is the region of the enzyme that binds the substrate,to form an enzyme-substrate complex,and transforms it into product.The active site is a three-dimensional entity,often a cleft or crevice
42、on the surface of the protein,in which the substrate is bound by multiple weak interactions.,三、研究酶活性中心的方法 1.物理学方法：用X射线衍射法直接检测底物或其类似物与酶形成的中间复合物（包括酶和底物）的相对位置。,2.化学修饰法：根据所用修饰试剂不同，分为 1)非专一性化学修饰 用非专一性的修饰试剂与氨基酸侧链基团作用。若某基团被修饰后：酶活性不变该基团可能不是酶的必需基团酶活性降低或丧失该基团可能是酶的必需基团但不能确定化学试剂是同活性中心内的必需基团结合。,活性中心基团的鉴定标准失活程度与修
43、饰剂浓度成一定比例关系。S或可逆抑制剂有保护作用（活性中心）。先加S或竞 加共价修饰剂 透析除去S或竞 活性不丧失,差别标记：底物或抑制剂存在 活性基团不与修饰剂作用去除底物或抑制剂 原来被保护的基团带同位素标记 可直接得到蛋白质发挥功能作用的必需基团。,化学修饰,含同位素标记,的同样试剂,2)专一性化学修饰（基团专一性修饰）用专一性化学修饰剂修饰酶活性中心的某一氨基酸残基的侧链基团。3)亲和标记（位点专一性修饰）采用的修饰试剂是根据底物的化学结构设计合成的含有活泼反应基团的底物类似物。作用机制：利用酶对底物的特殊亲和力将酶加以修饰标记。,化学修饰的专一性,Y,Y,Y,X-Y,X,亲和修饰剂：与S结构相似，与活性中心的氨基酸残基 亲和力大，而与活性中心以外的氨基酸 残基亲和力小。具有活泼的化学基团（如卤素）可与活性 中心的基团形成稳定的共价键。,
