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1、第二章菌种选育、保藏与复壮,Contents,第一节食品发酵与酿造工业菌种第二节菌种选育 第三节菌种保藏与复壮第四节国内外主要菌种保藏机构,第一节 食品发酵与酿造工业菌种,2022/12/3,4,一、现代发酵工业对菌种的要求,（1）非病源菌，不产生有害活性物或毒素；（2）发酵周期短，发酵产物的产生能力强；（3）高转化，易分离纯化，低成本，高质量；（4）生长繁殖力强，速度快，较强产孢能力；（5）原料广，价廉，易被微生物利用、转化；（6）对添加的前体物质有耐受能力；（7）菌种纯，遗传特性稳定，抗噬菌体能力强。,二、现代发酵工业常见菌种,枯草芽孢杆菌,戊糖片球菌,植物乳杆菌,多粘类芽孢杆菌,酿酒酵母
2、,粉状毕赤酵母,红葡萄浓缩汁中的酵母菌形态,产朊假丝酵母,黑曲霉,黑曲霉,青霉,米曲霉,蛋白酶、淀粉酶、糖化酶、纤维素酶、植酸酶等,根霉,绿色木霉,产生微晶纤维素酶，羧甲基纤维素酶、纤维二糖酶，可完全水解纤维素。,拟康氏木霉,产生纤维素酶，羧甲基纤维素酶、纤维二糖酶，可完全水解纤维素。,第二节菌种选育,一、新菌种的分离与筛选,利用人工环境，使样品中目标微生物成为优势菌。,样品来源越广泛，获得新菌种的可能性越大。,纯种分离的常用方法有平板划线分离法、稀释分离法和涂布分离法。,一般生产性能的测定通过初筛和复筛的方法来确定。,（一）样品采集, 原则 样品来源越广泛，获得新菌种的可能性越大。 土壤采样
3、方法土壤的有机质含量和通风状况（525cm深度）土壤的pH和植被状况地理条件季节条件,细菌、放线菌：耕地、菜园和近郊土壤；酵母菌：果园树根的土壤中；霉 菌：动植物残体及霉腐土层中；黑曲霉：稻场、谷物堆积处。,H7.0 ：霉菌、酵母菌居多pH7.0 7.5：细菌、放线菌丰富,（二）富集培养, 富集培养的目的 利用人工环境，使样品中目标微生物成为优势菌。 富集培养的方法控制培养基的营养成分控制培养条件 富集培养的方式分批培养（Batch culture ）连续培养（Continuous culture ）分批补料培养（Fed-batch culture ）,2022/12/3,26,（三）纯种分离
4、,（1）平板划线分离法（2）稀释分离法（3）涂布分离法（4）毛细管分离法（5）小滴分离法,2022/12/3,28,初筛和复筛,（1）初筛（定性粗放！）平板筛选 （变色圈、透明圈、生长圈、抑菌圈 ）摇瓶发酵筛选（2）复筛（定量精确！）1个菌株重复35瓶，精确分析如酶活力单位、耐酒精程度等。,溶磷细菌的平板筛选(5d),青霉菌溶磷实验,高效溶磷的真菌菌株,（四）性能鉴定,生产性能测定 通常使用初筛和复筛的方法确定。直接从自然界分离得到的菌株为野生型菌株。我们常将这些自然界中直接获得的新菌株称为进一步育种工作的原始菌株或出发菌株。毒性试验若毒性大而且无法排除者应予以淘汰。种属鉴定,二、自然选育,自
5、然选育的定义 利用微生物在一定条件下产生自发变异，通过分离、筛选，排除劣质性状的菌株，选择出维持原有生产水平或具有更优良生产性能的高产菌株，达到纯化与复壮菌种、保持稳定生产性能的目的。其主要原理是微生物群体分离。自然选育的方法（1）通过表现形态淘汰不良菌株；（2）考察目的代谢产物产量；（3）进行遗传基因型纯度试验，考察菌种纯度；（4）传代稳定性试验：斜面传3-5代。,自然选育,资料显示，某些芽孢杆菌具有分解和利用葡聚糖的能力，请设计方案从自然界中筛选一产葡聚糖酶的菌株，并简要分析各主要步骤的依据。,05年江南大学微生物(发酵)考研试题,三、诱变育种,诱变育种：指人为地、有意识地将对象生物置于诱
6、变因子中，使该生物体发生突变，从这些突变体中筛选具有优良性状的突变株的过程。 提高了菌种发生突变的频率和变异幅度，提高获优机率。突变：在自然状况下发生的突变自然突变（10-610-9）诱变：人为地利用物理或化学因素诱发的突变（10-410-5）诱变剂：能够显著提高突变频率的物理或化学因素。,（一）常见诱变剂及作用基本原理,物理诱变因子 紫外线、X射线、快中子等化学诱变因子 硫酸二乙酯（DES）、亚硝酸、 吖啶橙生物诱变因子 噬菌体、转座子等,（二）诱变基本方法及影响因素,诱变剂的选择：作用机理；突变谱诱变剂量选择：最适剂量（致死率70-80%时）增效（变）剂：氯化锂（0.5%）外部环境条件：如
7、温度、氧气、pH、水分出发菌株的选择：生产菌株、野生菌株出发菌株的生理状态：细菌-对数生长期；幼年孢子；营养体；湿态敏感（真菌：106 cfu/mL孢子悬浮液；细菌：108 cfu/mL的菌液）诱变效应的测定：直接法和浓缩法，培养后测定目的产物量诱变方法：单因子、复合诱变优良突变株的筛选方法：随机筛选或半理性化筛选,（三）诱变育种流程,第三节菌种保藏与复壮,一、菌种的衰退,菌种衰退（degeneration） 生产菌种或筛选出来的较优良菌株，由于进行接种传代或保藏之后，群体某些形态特征及生理特征逐渐减退甚至完全丧失的现象。 由于菌种的自发突变使其典型性状，特别是产量性状发生负变的现象。菌种退化
8、的主要表现产量下降，目的代谢产物减少，原料转化率下降；生长速度缓慢，目的代谢产物合成能力下降，发酵周期延长；产孢子能力变弱，孢子形成数量减少；抗逆性减弱；形态畸形等。,（一）引起菌种退化变异的因素,遗传基因型的分离丝状真菌、多细胞组成、有的单核、有的多核，遗传物质基础有多样性的复杂性，为群体繁殖，往往出现遗传基因型的分离-数量遗传的自体调节现象。自发变异的产生负向变异为多数，结果：目的代谢产物产量下降，生长逐步变弱变慢，孢子形成能力低下等。原因：长期保藏；频繁传代（例斜面保藏、发酵厂种子制备）；菌体在代谢过程中产生具有诱变作用的物质；存在增变。人工诱变导致的退化变异,基因突变（退化的根本原因）
9、连续传代（加速退化的直接原因）,（二）衰退的防止,控制传代次数：不超过7代，易变异的不过5代 砂土管、冻干管保藏的原种，开启不能超过3次，以防污染。选择良好保藏方法：保证菌不死、不衰、保存活性及原有典型性状良好的培养条件：注意斜面菌株的培养条件（保藏、活化培养基） 采用不同类型的细胞进行接种产孢子霉菌细菌,二、菌种的复壮,广义 是指在菌种的生产性状尚未衰退前，就经常有意识的进行纯种分离和生产性能的测定，从而使菌种的生产性能逐步提高的一种措施。狭义 指菌种已经发生衰退后，再通过纯种分离和性能测定的办法从衰退的群体中找出尚未衰退的个体，以达到保持该菌种原有典型性状的一种措施。复壮的方法纯种分离淘汰
10、已衰退的个体通过寄主体进行复壮,（一）纯种分离,菌落纯 用稀释平板法或平板划线法，取得单细胞菌落，再通过菌落和菌的特征分析和性能测定，获得具有原来性状或性状更好的菌株。菌株纯（细胞纯）只有菌丝的：在显微镜下用毛细管挑取只有一个核的菌；有孢子的：在显微镜下用毛细管挑取单个孢子。一般只要求达到菌落纯的水平用于退化不太严重的情况。,（二）淘汰已衰退的个体,可通过物理、化学方法处理菌体或孢子，使其大部分死亡(80%以上)，存活的菌多为生长健壮者，从中选出优良菌株。用10%酒精处理，能耐之的一般为原菌株（啤酒酵母）。在培养基内加青霉素，抗药性较强的细菌一般为原菌株(产抗生素)。适当提高培养温度 加乳酸，
11、淘汰酸奶菌种中的衰退个体。一般可将单菌落分离与培养条件综合进行复壮，效果更好,2022/12/3,46,（一）保藏原理 根据微生物的生理、生化特性，人工地创造条件，使之达到不死、不衰、不污染的休眠状态。（二）菌种保藏方法斜面低温保藏法（最简单的菌种保存法）矿油保藏法载体吸附保藏法冷冻真空干燥法（最佳的微生物菌体保存法之一）液氮超低温保藏法（当前最理想的保存法）,低温、干燥、缺氧、缺营养,三、菌种的保藏,CICC保藏菌种,GIMCC保藏菌种,请从保藏原理、保藏适应对象、保藏期及优缺点等方面对各种保藏方法进行比较说明。,2022/12/3,50,2022/12/3,51,第四节 国内外主要菌种保藏机构,表 国内主要菌种保藏机构,表 国外主要菌种保藏机构,本章小结,思考题,发酵工业用菌种应满足哪些条件？如何进行新菌种的分离和筛选？试述物理因素诱变的机理。引起菌种衰退的原因有哪些？防止菌种衰退的措施有哪些？如何进行菌种的复壮？菌种保存的机理是什么？简要介绍各种菌种保存方法。试设计一个从自然界中筛选高温淀粉酶产生菌的实验方案。,
