第7章 微生物遗传与菌种选育课件.ppt

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1、,遗传变异的物质基础基因突变和诱变育种基因重组和杂交育种（自学）基因工程菌种的衰退复壮和保藏,内容提要,第七章 微生物遗传与菌种选育,理想的工业发酵菌种应符合以下要求,遗传性状稳定；生长速度快，不易被噬菌体等异种微生物污染；目标产物的产量尽可能接近理论转化率；目标产物最好能分泌到细胞外，以降低产物抑制并利于分离；,尽可能减少产物类似物的产量，以提高目标产物的产量并利于分离；培养基成分简单、来源广、价格低廉；对温度、pH、离子强度、剪切力等环境因素不敏感；对溶氧的要求低，便于培养及降低能耗。,理想的工业发酵菌种应符合以下要求,微生物是遗传学研究的最好材料和对象,1、微生物结构简单,2、营养体一般

2、都是单倍体,3、微生物繁殖速度快,6、存在多种方式的繁殖类型,5、环境条件对微生物作用直接均匀,4、易积累不同的中间及最终代谢产物,7、微生物的变异易被识别,8、参与基因工程的载体、供体、受体三种角色,微生物是研究现代遗传学和其它许多主要的生物学基本理论问题中最热衷的研究对象。对微生物遗传规律的深入研究，促进了现代分子生物学和生物工程学的发展，为育种工作提供了丰富的理论基础，促使育种工作从不自觉到自觉、从低效到高效、从随机到定向、从近缘杂交到远缘杂交的方向发展。,研究微生物遗传学的意义,遗传型 又称基因型，指某一生物体所含有的全部遗传因子即基因的总和。 表 型 指某一生物体所具有的一切外表特征

3、及内在特性的总和，是遗传型在合适环境下的具体体现。 遗传型 + 环境条件 表型 变 异 生物体在某种内因或外因的作用下，引起的遗传物质结构或数量的变化。变异的特点：在群体出现的几率极低（10-5-10-10），变化后的新性状可遗传。 饰 变 不涉及遗传物质结构变化，而只发生在转录、转译水平上 的表型变化。,表 型 饰 变：,表型的差异只与环境有关，特 点：暂时性、不可遗传性、表现为全部个体的行为,Production of a red pigment (prodigiosin) by Serratia marcescens. From left to right: slant culture

4、grown at 25C, slant culture grown at 37C, broth culture grown at 25C, broth culture grown at 37C.,例如：粘质沙雷氏菌：在25下培养，产生深红色的灵杆菌素；在37下培养，不产生色素；如果重新将温度降到25，又恢复产色素的能力。,斜面培养,液体培养,第一节 遗传变异的物质基础,种质连续理论：18831889年间Weissmann提出。认为遗传物质是一种具有特定分子结构的化合物。,F Crick在研究DNA双螺旋结构,基因学说：1933年摩尔根（Thomas Hunt Morgan）发现了染色体，并证明

5、基因在染色体上呈直线排列，提出了基因学说，使得遗传物质基础的范围缩小到染色体上。DNA是遗传变异的物质基础的证明：1944年以后，先后有利用微生物为实验对象进行的三个著名实验肺炎球菌的转化试验噬菌体感染试验病毒的拆开与重建试验 人们普遍接受核酸才是真正的遗传物质。,三个经典实验证明核酸是微生物遗传物质,转化实验,噬菌体感染实验,植物病毒的重建实验,遗传物质在微生物细胞内的存在部位和方式,一、3个经典实验,有 荚 膜菌落光滑分泌毒素致 病,无 荚 膜菌落粗糙无 毒不 致 病,实验材料： 肺炎双球菌,（一）转化实验,说明：加热杀死的 S 型细菌中有一种具有遗传转化能力的物质，它通过某种方式进入 R

6、 型细胞，并使 R 型细菌获得表达 S 型荚膜形状的遗传特性,1928年Griffith进行的细菌转化实验,加S菌DNA加S菌DNA及DNA酶以外的酶加S菌的DNA和DNA酶加S菌的RNA加S菌的蛋白质加S菌的荚膜多糖,活R菌,长出S菌,只有R菌,1944年O.T.Avery、C.M.MacLeod和M。McCarty从热死S型S. pneumoniae中提纯了可能作为转化因子的各种成分，并在离体条件下进行了转化试验：,只有S型细菌的DNA才能将S. pneumoniae的R型转化为S型且DNA纯度越高，转化效率也越高。说明：S型菌株转移给R型菌株的DNA是遗传因子。,（二）噬菌体感染实验 （

7、p188）,步骤,1：用含同位素35, P32的培养基分别培养大肠杆菌,2：让T2感染上述大肠杆菌使其打上S35 、P32标记,（二）噬菌体感染实验,A. D. Hershey和M. Chase， 1952年,（1）含32P-DNA的一组：放射性85%在沉淀中,上清液中含15%放射性,沉淀中含85%放射性,沉淀中含25%放射性,以35S标记蛋白质外壳做噬菌体感染实验,（2）含35S-蛋白质的一组：放射性75%在上清液中,10分钟后用捣碎器使空壳脱离,吸附,离心,沉淀细胞进一步培养后，可产生大量完整的子代噬菌体,上清液中含75%放射性,为了证明核酸是遗传物质，H. Fraenkel-Conrat

8、（1956）用含RNA的烟草花叶病毒（TMV）进行了著名的植物病毒重建实验。将TMV在一定浓度的苯酚溶液中振荡，就能将其蛋白质外壳与RNA核心相分离。分离后的RNA在没有蛋白质包裹的情况下，也能感染烟草并使其患典型症状，而且在病斑中还能分离出正常病毒粒子。,（三）植物病毒的重建实验 （p189）,植物病毒蛋白质和RNA可以人为地分开,同时又可把它们重新组合成具感染性的病毒.,植物病毒的重建实验,甲乙r 感染症状同甲病毒；分离得到甲病毒,乙甲r 感染症状同乙病毒；分离得到乙病毒,原始株 拆 开 重 建 感 染 分离纯化,植物病毒的重建实验,遗传物质类型,核染色体,核外染色体,真核生物细胞器,原核

9、生物质粒,二、遗传物质在微生物细胞内的存在部位和方式,核外DNA的种类,核外染色体,真核生物的“质粒”原核生物的质粒,线粒体细胞质基因叶绿体中心体动 体共生生物：卡巴颗粒酵母菌的2m质粒,F因子R因子Col质粒Ti质粒巨大质粒降解性质粒,（一）核酸存在的 7 个水平及质粒细胞水平：存在于细胞核或核质体，单核或多核细胞核水平: 原核与真核生物的细胞核结构不同，核外 DNA染色体水平: 倍性 ( 真核 ) 和染色体数核酸水平：在原核中同染色体水平、存在部分二倍体 DNA或RNA，复合或裸露，双链或单链基因水平：具自主复制能力的遗传功能单位，长度与信 息量，转录翻译密码子水平：信息单位, 起始和终止

10、,核苷酸水平：突变或交换单位，四种碱基,基因是一段DNA,DNA就是脱氧核糖核酸（长链）,腺嘌呤（A）,鸟嘌呤（G）,胸腺嘧啶（T）,胞嘧啶（C）,A,T,C,G,A,A,A,T,T,T,T,T,T,A,A,A,G,G,G,G,G,C,C,C,C,C,G,C,基因测序就是读出 A-C-G-T-G-G-A-C-G.,DNA,基因是什么？,基因决定生物体的生、长、病、老死等一切生命现象,基因是生命的密码。,。基因记录和传递遗传信息。,大肠杆菌基因组,4100个基因，4.7106bp,遗传信息的连续性,功能相关的结构基因组成操纵子,结构基因单拷贝及rRNA多拷贝,基因的重复序列少而短,酵母菌基因组,

11、染色体,长度Kb,基因数,1,2,3,4,5,6,7,8,染色体,长度Kb,基因数,439,745,666,1078,924,784,1092,948,230,423,173,814,292,136,573,291,231,387,334,550,487,421,571,499,13,10,27,13,10,33,11,10,24,16,22,21,15,20,17,4,原核生物基因调控系统 （p193）,（二)原核生物的质粒 （p194）,功能：带有一些基因，如产生毒素、抗药性、固氮、产生酶类、降解功能等，并可进行细胞间转移。,结构与大小：质粒通常以共价闭合环状的超螺旋双链DNA分子状态存在

12、于细胞中。约为11000kb，上面携带有数个到数十个甚至上百个基因。,定义：存在于细菌、真菌等微生物细胞中，独立于染色体外，能进行自主复制的遗传因子。,质粒 核外环状小型DNA独立复制稳定遗传,F因子 与有性接合有关,种类,R因子 与抗药性有关,COL 编码免疫蛋白,Ti质粒 诱癌质粒,降解性质粒：编码降解有害物质的酶,用途 基因工程中作为目的基因载体,质粒,原核生物遗传物质存在的另一种方式,基 因 突 变,突变与育种,第二节 基因突变和诱变育种,突变的特点,基因突变,诱变机制,突变率,突变类型,条件致死突变型（株）,（一）突变类型,突变株的表型,选择性突变株,非选择性突变株,营养缺陷型（株）

13、,抗性缺陷型（株）,形态突变型（株）,抗原突变型（株）,产量突变型（株）,按方法分：按突变株的表型是否能在选择 性培养基上加以鉴别来区分。,微生物突变体的主要类型,形态突变型,生化突变型,营养突变体(营养缺陷型),发酵突变体,抗性突变体,条件致死突变体,抗原突变型,产量突变型,按突变实质分,营养缺陷型因突变而丧失产生某种生物合成酶的能力，必须在培养基中添加某种物质才能生长的突变类型。野生型和缺陷型分别用+、-表示，如分别用his+和his-表示组氨酸野生型和缺陷型。,抗性突变型因突变而产生了对某种化学药物或致死物理因子的抗性。抗性和敏感型分别用r和s表示，如用strr和strs分别表示链霉素抗

14、性和敏感性。,条件致死突变型突变后在某种条件下可正常生长繁殖，而在另一条件下却无法生长繁殖的突变型。（温度敏感突变株ts）,形态突变型细胞形态变化或菌落形态变化。如菌落颜色变化，菌体失去荚膜、鞭毛等。,（三)基因突变的特点 （p200）,不对应性,自发性,稀有性,独立性,诱变性,稳定性,可逆性,基因（自发）突变的特点：,自发性：是不经诱变剂处理而自然发生的突变。,突变率：每一个细胞在每一世代中发生某一特定突变的几率。突变率=突变细胞数/分裂前群体细胞数,稀有性：突变率低且稳定。,不对应性：突变的发生与环境因子之间无直接的对应关系。,若干细菌某一性状的自发突变率,菌 名 突变性状突变率E. co

15、li抗T1噬菌体3 108E. coli抗T3噬菌体1 107 E. coli不发酵乳糖1 1010E. coli 抗紫外线1 105Staphylococcus aureus 抗青霉素1 107S. aureus 抗链霉素1 109 Salmonella typhi抗25g/L链霉素1 106 Bacillus megaterium 抗异烟肼5 105,可逆性： 从原始的野生型基因到变异株的突变称为正向突变（forward mutation）， 从突变株回到野生型的过程则称为回复突变或回变（back mutation或reverse mutation）。,独立性：各种突变独立发生，不会互相影

16、响。,可诱发性：诱变剂可提高突变率。,稳定性：变异性状稳定可遗传。,（四）基因突变自发性和不对应性的证明,变 量 试 验,涂 布 试 验,影印培养试验,变量实验（fluctuation analysis）Salvador Luria and Max Delbruck（1943）,Salvador Luria,Max Delbruck,The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1969,(在同一个大管中作整体培养),3 7 1 4 4 3 5,抗噬菌体菌落数 抗噬菌体菌落数,变量试验,涂布试验,涂布试验中突变率的计算,初始接种量：5 104 个/皿培养5

17、小时，繁殖了12.3代，每个微菌落约含5100个细菌这时，每个平皿上的细胞数为：5100 5 104 2.6 108个/皿在6个平板上，比接种时增加的细胞数为：6 （2.6 108 5 104）= 15.6 108在未涂布的平板上共发现28个突变，故突变率 = 28/15.6 108 = 1.8 108,影印培养试验,影印实验（replica plating ）Joshua Lederberg and Esther Lederberg（1952）,Joshua Lederberg,J. Lederberg is awarded the Noble Prize in Medicine and P

18、hysiology in 1958,（五）基因突变及机制 p202,1. 诱发突变：人为地用物理、化学、生物的方法处理微生物，使其遗传物质发生变异，从而达到改变其表型的目的。,诱变机制,物理诱变剂：紫外线（UV）、X射线、射线、离子束、热等。,生物诱变因子：转座子、温和性噬菌体等。,化学诱变剂：碱基类似物：5-溴尿嘧啶、2-氨基嘌呤插入染料：易引起移码突变，如溴化乙锭、丫啶橙与碱基起反应的诱变剂：硫酸二乙脂（DES，碱基烷基化）、亚硝基胍（NTG）、亚硝酸等。,诱变剂：人工诱变时用来处理微生物并能提高生物体突变频率的物理或化学因素，称为诱变因素，又称诱变剂。,诱变机制,移码突变,染色体畸变,碱

19、基的置换,（1）碱基的置换,直接引起置换的诱变剂,间接引起置换的诱变剂,碱基的置换,T：烯醇式,（2）移码突变,分子中缺失或增加少数几个碱基对而引起,造成突变点以后全部遗传密码转录与转释发生错误,增添一个碱基,缺少一个碱基,（3)染色体畸变,某些理化因子，如射线，紫外线， 亚硝酸等，除能引起点突变外，还会引起DNA分子大损伤，包括染色体易位，倒位，缺失，重复等，即为染色体畸变。,染色体畸变,紫外线诱变作用机理,1、使链裂断，破坏核糖和磷酸间的键联,2、引起胞嘧啶和尿嘧啶产生水合作用造成氢键断裂,3、使胸腺嘧啶成二聚体，使结构发生改变,二、突变与育种（p208）,效价：指有效成分的浓度。1ug/

20、ul称为1 单位,从 青 霉 素 产 量 看 诱 变 育 种,1. 诱变育种的基本环节（p209）,2. 诱变育种工作中应考虑的几个原则,选优良的出发菌株,选择简便有效的诱变剂,处理单孢子（或单细胞）悬液,选用最适剂量,设计或采用高效筛选方案或方法,利用复合处理的协同效应,利用和创造形态，生理与产量间的相关指标,（1）选择简便有效的诱变剂,利用回变检测致癌剂 艾姆斯试验法（p210）,平板上无大量菌落出现，说明样品不含诱变剂； 有抑制圈出现，并在外围长满大量菌落，说明浓度过高； 在滤紙片周围长满菌落说明浓度合适。 该法广泛用于监测食品饮料药物等试样中的致 癌物时间3天，准确率85%。,（2）挑

21、选优良的出发菌株 （p211）,生产中用过的自发变异菌株,采用具有有利性状的菌株,采用已发生其他变异的菌株,采用前体或最终产物代谢高的菌株,采用增变菌株,（3）处理单孢子（或单细胞）悬液,芽孢杆菌应处理芽孢,放线菌，霉菌应处理孢子,细菌指数期，放线菌霉菌要稍加萌发后使用,出发菌株应制成均匀悬夜,（4）选用最适剂量,剂量以诱变剂浓度和处理时间来表示,合适剂量：能扩大变异幅度又能促使 变异移向正变范围的剂量,（5）充分利用复合处理的协同效应,两种或多种诱变剂先后使用,同种诱变剂重复使用,两种或多种诱变剂同时使用,（6）利用和创造形态，生理与产量间的相关指标,淀粉酶变色圈试验,变色圈大的为淀粉酶高产

22、菌落,（7）设计或采用高效筛选方案或方法,第一轮,第二轮,五个出发菌株,3. 突变株的筛选方法 (p212）,高产突变菌株的筛选方法,抗性突变体的筛选方法,营养缺陷型的的筛选方法,与突变株的筛选相关的几个概念,高产突变株的筛选,琼脂块培养法筛选 春日霉素高产菌种,(2) 抗性突变体的筛选方法,青霉素浓缩法,梯度培养皿法,青霉素浓缩法,(3)营养缺陷型的筛选 (p214),基本培养基（MM）-：凡是能满足野生型菌株营养要求的最低成分的合成培养基。 完全培养基（CM）+：满足一切营养缺陷型菌株生长的天然或半合成培养基。 补充培养基（SM）x：在MM中有针对性地加入一或几种营养成分以满足相应营养缺陷

23、型菌株生长的合成培养基。,与筛选营养缺陷型突变株相关的3类培养基,三类遗传型,野生型 A+B+,营养缺陷型型A+B-,原养型 A+B+,与营养缺陷型突变相关的3类遗传型个体 （p215）,与营养缺陷突变有关的三类遗传型个体：营养缺陷型：经诱变产生的一些合成能力出现缺陷，而必须在 培养基内加入相应有机养分才能正常生长的变异菌株。如：lys -， bio- 野生型：自然界分离到的任何微生物，在其发生营养缺陷突变前的原始菌株，为该微生物的野生型。 如：lys + ; bio + ;原养型 ：指营养缺陷型突变菌株回复突变或重组后产生的菌株，与野生型的表型相同。,营养缺陷型的筛选办法 (p215),1.

24、 诱变剂处理,2. 淘汰野生型,3. 检出缺陷型,夹层培养法,限量补充培养法,逐渐检出法,影印接种法,4. 鉴定缺陷型,菌丝过滤法,突变株的筛选方法,诱变,检出营养缺陷型,淘汰野生型,鉴定营养缺陷型,富集培养（抗生素法）（菌丝过滤法）,夹层培养法限量补充培养法逐个检出法影印平板法,生长谱法,夹层培养法 （p216）,夹层培养法及结果,限量补充培养法,微量蛋白质的完全培养基上 小菌落是营养缺陷型突变株,逐个检出法,逐个检出法,缺陷型的检出,影印接种法,菌丝过滤法筛选营养突变株,菌丝过滤法,适用于：丝状（放线菌、霉菌） 原理：基本培养基上只有发育成菌丝；auxo孢子可通过滤膜，野生型菌丝不能通过。

25、,生长谱法方法简便； 回变和污染不影响结果 测定物质可为粉末或纸片,补充：缺陷型的鉴定,测定一般应分两阶段：第一阶段：测定是哪类物质的缺陷型；第二节段：根据第一阶段确定的范围，进一步确定是哪种具体化合物的缺陷型；,组合营养物法,步骤（以氨基酸缺陷型的鉴定为例）：a. 将多种营养因子编组；b. 将组合液的纸片放在涂菌的基本培养基上培养；c. 结果分析；,一组：1 2 3 4 5 二组：2 6 7 8 9 三组：3 7 10 11 12 四组：4 8 11 13 14 五组：5 9 12 14 15,营养因子分组编排时注意；1）每组内无重复的营 养因子 2）每组中应包含只出 现一次的因子 3）每组

26、中其他因子应 分别出现二次,如：,一组：1 2 3 4 5 二组：2 6 7 8 9 三组：3 7 10 11 12 四组：4 8 11 13 14 五组：5 9 12 14 15,缺陷型的应用,作为菌株的遗传标记：进行基因工程、诱变育种、研究代谢过程时用作亲本标记；作为生产菌种：aa、核苷酸等生产菌种； 作为aa、维生素、碱基的测定菌株。,一、微生物菌种的衰退二、微生物菌种的复壮三、微生物菌种的保藏,第五节 微生物菌种的衰退、复壮和保藏,P.231,衰退的含义：由于自发突变的结果，而使某物种原有一系列生物学性状发生量变或质变的现象。,一 、微生物菌种的衰退,衰退的表现形式 1）原有的形态不典

27、型 2）生长速度变慢 3）代谢产物生产能力下降 4）致病力下降 5）抗性下降,（一）衰退的防止方法,1）控制传代的次数,2）创造良好培养条件,3）采用有效的菌种保藏方法,4）采用不易衰退的细胞进行传代,P.232,复壮的含义,（二） 微生物菌种的复壮,1）狭义：是一种消极的措施，它指的是菌种已发生衰退，再通过纯种分离和性能测定等方法，从衰退的群体中找出少数尚未衰退的个体，以达到恢复该菌种原有典型性状的一种措施。,2）广义：是一项积极的措施，即在菌种性能尚未衰退前就经常有意识地进行纯种分离和生产性能的测定工作，以期从中选择到自发的正突变体（以期菌种的生产性能逐步有所提高）。,复壮的方法,1.纯种

28、分离； A、平板划线分离： 主要适合细菌，酵母菌， 可达到菌落纯的水平。B、单孢子分离：主要适合产孢子的微生物，例霉菌和放线菌。用显微操作器进行分离，可达到细胞纯的水平。,2.通过寄主主体复壮,3.淘汰已衰退的个体,P.232,二、微生物菌种的保藏,目的：不死亡，不污染，不变异三不原则随时为生产、科研提供优良菌种。,原理：选用优良的纯种（最好是休眠体，如分生孢子、芽孢等），在干燥、低温、缺氧、缺营养以及添加保护剂等环境条件下，降低微生物代谢活动强度，抑制微生物生长繁殖，并使其难以发生突变。,P.233,菌种保藏机构的任务：广泛收集科研和生产菌种、菌株，并加以妥善保管，使之达到不死、不衰、不乱以

29、及便于研究、交换和使用的目的。菌种保藏机构： 中国微生物菌种保藏委员会(CCCCM) 美国的典型菌种保藏中心(ATCC) 英国国家典型菌种保藏所（NCTC） 法国里昂巴斯德研究所（IPL）,国内外菌种保藏机构：,（1）传代培养保藏,常用方法：琼脂斜面、半固体琼脂柱及液体培养等。低温保藏法：菌种管置4冰箱保藏。石蜡油低温保藏法：橡皮塞取代棉塞或加石蜡油。,菌种保藏的方法,传代培养保藏的菌种多可以直接使用，是进行微生物保藏的基本方法。,需注意的问题：进行冷冻时，适当采取速冻的方法；而解冻时也应快速升温。在采用冷冻法保藏菌种时，一般应加入各种保护剂以提高培养物的存活率。例如甘油或二甲亚枫和大分子物质

30、如糊精、血清蛋白、脱脂牛奶或聚乙烯吡咯烷酮（PVP）等。,液氮超低温保藏法 将菌种置于保护剂中，预冻后保存在液氮超低温冰箱中（-196）。适用于各种微生物的较理想的保藏方法。适合专业菌种保藏机构。 低温冰箱（-70）和普通冰箱（-30-20）也可用于冷冻保藏。,（2）冷冻保藏,冷冻真空干燥法 加有保护剂的菌悬液在冻结状态下予以真空干燥。适用于各种微生物，便于大量保藏，菌种存活时间长，是目前最好的保藏方法。大多数菌种保藏机构采用，且方便邮寄。,干燥保藏法 将菌种置于土壤、细沙、滤纸、硅胶等干燥材料上保藏。如沙土管法，适用于产孢子的微生物，如放线菌、芽孢菌和某些真菌保藏，保藏时间几至几十年。适合一般实验室以及发酵工厂采用。,（3）干燥保藏法,