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1、第五章 微生物的生长繁殖 与生存因子,第一节 微生物的生长繁殖,一、微生物生长繁殖的概念,生长：微生物不断吸收营养物质进行新陈代谢，同化作用大于异化作用，微生物细胞不断增长，这就叫做生长。繁殖：一个亲代细胞分裂为两个与亲代细胞相似的子代细胞，即为单细胞微生物的繁殖。世代时间：细菌两次细胞分裂之间的时间，称为世代时间。在一定培养条件下世代时间是一定的。,二、研究微生物生长的方法,微生物的生长可分为个体微生物生长群体微生物生长微生物多数通过培养研究群体生长。培养方法有分批培养和连续培养。,（一）分批培养,将细菌接种到一定量新鲜的液体培养基中培养，定时取样计数，以细菌量为纵坐标，以时间为横坐标，连接
2、各点形成一条曲线，即细菌的生长曲线。 停滞期指数期静止期衰亡期,细菌的生长曲线（growth curve）,1.停滞期（Lag phase）,现象：培养体系内细胞数目几乎保持不变。原因：细胞需要合成分裂所需的酶、ATP和其他成分，为细胞分裂作准备 。影响因素： 菌种的生理活性培养基的组分接种量,细菌的生长曲线（growth curve）,2.指数期（exponenial phase）,现象：细胞代谢活动旺盛，分裂速度最快、代时最短，细胞数以几何级数的方式增加。原因：细胞完成生理调整，基质营养和环境适宜。影响因素： 遗传特性培养条件和环境,细菌的生长曲线（growth curve）,指数期的重要
3、参数（1）繁殖代数（n）指数生长可以用下式表示：,X1:起始时细胞数目X2:指数生长某个时刻 的细胞数目。N:世代数,x1,x2,例如：一培养液中微生物数目由开始的12，000（ x1 ），经4h （ t ）后增加到49，000，000（ x2 ），共经过几代？ 解： n (lg4.9107lg1.2104）0.30112（2）生长速率常数（k）,（3）代时（G） 借助于 n 和 t ，还可以计算出不同培养条件下的代时G： 在上例中， G 460 / 12 20min该种微生物的代时为20分钟。在4小时内共 繁殖了12代。,3.稳定期(staionary),现象：体系内新生细胞数与死亡细胞数相
4、等，活菌数达到最大值，产生次生代谢产物。 原因：营养物质逐渐消耗，代谢废物逐渐积累。影响因素： 遗传特性培养条件和环境,细菌的生长曲线（growth curve）,4.衰亡期(decline phase),现象：体系内细胞死亡速率超过生长速率。原因：菌体老化、生长环境进一步恶化。影响因素： 遗传特性培养条件和环境,细菌的生长曲线（growth curve）,（二）微生物的连续培养,连续培养又称开放培养，是在研究典型生长曲线的基础上，通过认识稳定期到来的原因，并采取相应的有效措施而实现的。常用连续培养装置：恒浊器恒化器,1、恒浊器(turbidostat),根据培养器内微生物的生长密度，借助光电
5、控制系统来控制培养液流速，以取得菌体密度高、生长速度恒定的微生物细胞。控制因子：菌体密度,2、恒化器(chemostat或bactogen),恒化器是一种设法使培养液流速保持不变，并使微生物始终在低于其最高生长速率条件下进行生长繁殖的一种连续培养装置。适用于污水处理。控制因子稀释率：控制生长速率限制性营养因子：控制菌体密度,稀释率,概念：稀释率(D) F/V，表示单位容积培养液(V)中不断流入的新鲜培养液的速率(F)，其单位为h-1。在恒化器中，生物量随时间的变化是： dX / dt X - DX 在稳态运转时，dX/dt=0，所以D等于该微生物的比生长速率()。,限制性营养因子,概念：凡是处
6、于较低浓度范围内，可影响生长速率和菌体产量的营养物就称限制性生长因子。 作用方式：影响微生物的生长速率和总生长量。,恒浊器与恒化器的比较,三、细菌生长曲线在污(废)水生物处理中的应用,常规活性污泥法利用生长率下降阶段，包括静止期及衰亡期。生物吸附利用静止期。高负荷活性污泥法利用对数生长期。延时曝气利用衰亡期（BOD5与COD比值小于0.3，可生化性差的废水）。,四、微生物生长量的测定方法,测定微生物总数测定活细菌数计算生长量,计数器直接计数法,（一）测定微生物总数,对于16 25规格，通常计算4个角中格的细胞平均数， 再换算成样品中的微生物数量。对于25 16规格，通常计算4个角及1个中央中格
7、的细胞平均 数。再换算成样品中的微生物数量。,比浊法测菌悬液浓度,（一）测定微生物总数,平板菌落计数法,步骤1.梯度稀释,（二）测定活细菌数,步骤2.涂布或混合倒平板,平板菌落计数法,步骤3.保温培养并计数,平板菌落计数法,第二节 微生物的生存因子,一、温度,根据对微生物的影响可将温度分为四种：最低温度：微生物能生长的温度低限。最适温度：微生物生长繁殖速度最快的温度。 最高温度：微生物能生长的温度高限。致死温度：微生物在10min内被杀死的最低温度。,(一)不同微生物类群适应的温度范围,污水冷却塔,调节池,(二)高温和低温对微生物的影响,1、高温的影响 一定范围内，升高温度可加速酶促反应。极端
8、高温引起菌体蛋白质变性。极端高温引起细胞膜脂类溶解，产生穿孔。影响高温效应的因素： 菌种与菌龄 温度与延续的时间 菌体含水量 PH条件 菌体密度,2、低温对微生物的影响 代谢影响 降低代谢速率，抑制菌体生长，导致敏感菌死亡。物理效应 裂解或冰晶刺伤化学效应 脱水反馈抑制效应 影响因素：菌种降温速度介质,(三) 微生物对高温和低温的适应,1、微生物高温下的生存机理嗜热微生物可在高温环境下进行正常的生长繁殖,主要原因是:微生物体内的酶和蛋白质比其他微生物更耐热。细胞膜中含有较多的饱和脂肪酸,形成强疏水键保持细胞膜在高温下的稳定性。,2、微生物低温下的生存机理嗜冷微生物可在低温环境下进行正常的生长繁
9、殖,主要原因是:微生物体内具有在低温下仍可有效工作的酶。细胞膜中含有较多的不饱和脂肪酸,在低温下仍可保持具有活性的半流动性。,(三) 微生物对高温和低温的适应,灭菌 干热灭菌和湿热灭菌消毒 巴斯德消毒和煮沸消毒菌种保存 低温抑制微生物生长与变异,(四) 温度控制的应用,干热灭菌,电热干燥箱灭菌适用对象：不含水的器皿。应用条件：160，12h,湿热灭菌,适用对象：含水基质或易燃物品，如培养基、无菌水，工作服等。灭菌方法高压蒸汽灭菌：121，1530 min。间歇灭菌：100，每天处理一次（约30min），一般需三次。,巴斯德消毒,鲜乳的消毒,低温下微生物仍可存活，但生长、繁殖停滞，不发生变异，因
10、而低温又广泛用于菌种保藏。通常使用超低温冰箱（-70）或者液氮（-196）。,菌种保存,二、pH,微生物对PH的要求细菌大多数要求中性和偏碱性。放线菌在中性及偏碱性环境生活。酵母菌和霉菌要求酸性或偏酸性环境。微生物培养过程中培养基PH会发生变化，必要时可添加缓冲物质。污（废）水生物处理的PH值宜维持在6.5到8.5。PH较低的工业废水可用酵母和霉菌处理。,引起微生物表面的电荷改变，进而影响营养物的吸收。影响培养基中有机化合物的离子化作用，间接影响微生物。使酶的活性降低，影响生物化学过程。降低微生物对高温的抵抗能力。使微生物对很多毒剂更为敏感。,极端PH对微生物的影响机制,三、氧化还原电位,各种
11、微生物对氧化还原电位要求不同。影响环境氧化还原电位的因素：氧分压与氧化还原电位成正比。环境PH值低时氧化还原电位高，pH值高时氧化还原电位低。氧化还原电位可用一些还原剂加以控制。,四、溶解氧,好氧微生物:专性好氧微生物:在氧分压 0.21101kPa下正常生长。微量好氧微生物: 生长所需氧浓度低于大气中氧浓度。兼性好氧微生物: 无氧状态下能够生长，有氧气生长状况更好。厌氧微生物: 耐氧微生物: 生长不需要氧气存在，有氧的情况下生长无变化。严格厌氧微生物: 氧气对其有害，甚至是致死的。,不同氧需求微生物培养特征,1.专性好氧 2.微好氧 3.兼性好氧 4.严格厌氧 5.耐氧,大多数放线菌、霉菌、
12、原生动物、微型后生动物等都属于好氧性的。氧对好氧微生物的作用：作为好氧呼吸的最终电子受体。参与甾醇类和不饱和脂肪酸的合成。,（一）好氧微生物与氧的关系,利用氧的过程中产生的有害物质,利用氧的过程中会产生一些自由基物质，具有强氧化性，对微生物有毒害作用：超氧阴离子 (O2-)过氧化氢 (H2O2)羟自由基 (OH.)过氧化物,微生物对有害氧化物的去除方式,(a) H2O2+H2O2 2H2O+O2(b) H2O2+NADH+H+ 2H2O+NAD+(c) O2-+O2-+2H+ H2O2 +O2(d) 4O2-+4H+ 2H2O +3O2,Peroxidase,过氧化物酶,Catalase,过氧
13、化氢酶,Superoxide dismutase,超氧化物歧化酶,Catalase+Superoxide dismutase,（二）兼性厌氧微生物与氧的关系,兼性厌氧微生物在有氧条件氧化呼吸链完整存在，进行有氧呼吸。兼性厌氧微生物在无氧条件下氧化呼吸链连组分不完整甚至消失，进行发酵。巴斯德效应：氧对葡萄糖耗量的抑制现象。,在供氧不足时，兼性厌氧微生物仍起积极作用，将各种有机物转化为有机酸和醇等。兼性厌氧微生物的反硝化作用常被用于污(废)水脱氮。,兼性厌氧微生物在水处理中的作用,（二）兼性厌氧微生物与氧的关系,（三）厌氧微生物与氧的关系,厌氧微生物分为两种：专性厌氧微生物：氧对其有致死作用。耐氧
14、微生物：不利用氧，不受氧毒害。,紫外辐射对微生物的影响导致胸腺嘧啶二聚体形成。应用：空气及表面消毒,五、 辐射对微生物的影响,电离辐射对微生物的影响低剂量促进生长或引发变异高剂量引起水分解，产生强氧化性物质对微生物产生致死作用。应用：食品防腐、诱导微生物变异筛选优良菌种。,五、 辐射对微生物的影响,六、水的活度与渗透压（一）水的活度,水活度（ w )表示水被吸附和溶液因子对水的可利用性影响的一种指标。水的活度分基质的水活度和渗透压的水活度。w = Ps / Pw,六、水的活度与渗透压（二）渗透压,任何两种浓度的溶液被半渗透膜隔开，均会产生渗透压。溶液的渗透压决定于其浓度，溶质的离子或分子，数目
15、越多渗透压越大。应用：腌渍食品防腐 含盐量高的污水生物处理,七、表面张力,表面张力是作用在物体表面单位长度的边上的收缩力。环境表面张力对微生物生长有影响。,八、超声波对微生物的影响,超过20000Hz的人听不见的声波，叫超声波。超声波对微生物的影响机制：细胞内含物絮凝、凝胶液化。空穴作用。,九、重金属对微生物的影响,重金属及其化合物杀菌和防腐机理:与酶的巯基结合，失活酶。与菌体蛋白结合，使之变性或沉淀。 应用：波尔多液某些细菌能够耐汞甚至转化汞，可以用于处理含汞废水，并从菌体中回收汞。,十、干燥对微生物影响,干燥能使菌体内蛋白质变性，因其代谢活动停止，所以干燥会影响微生物的活性。应用：保藏食品
16、。,十一、若干有机物对微生物的影响,醇：脱水剂及脂溶剂甲醛：蛋白质变性剂表面活性剂：酚：引起蛋白质变性，细胞膜破坏新洁尔灭：季铵盐合成洗涤剂：阳离子型、阴离子型、非离子型染料：孔雀绿、结晶紫等,十二、抗生素,许多微生物在代谢过程中能杀死其他微生物或抑制其它微生物生长的化学物质，即抗生素。抗生素分类：广谱抗生素狭谱抗生素抗生素作用部位：细胞壁细胞膜蛋白质核酸,抗生素活力测定最小抑菌浓度 法(MIC),试管梯度稀释技术,抑菌圈法,第四节 微生物与微生物之间的关系,一、竞争关系(competition)：,不同微生物种群在同一环境中，对食物等营养、溶解氧、空间和其他共同要求的物质互相竞争，互相受到不
17、利影响。,二、互生关系(cooperation),两种可以单独生活的生物共同生活在一起时，一方为另一方提供有利的生活条件，或双方互为有利。例如：固氮菌和纤维素分解菌食酚细菌和硫细菌各种硝化细菌,三、共生关系(symbiosis),不能单独生活的两种微生物共同生活后组成共生体，在营养上互为有利所。 例如：地衣=藻类+真菌原生动物和藻类S-菌株和布氏甲烷杆菌,四、偏害关系（amensalism),一种微生物在代谢过程中产生某些代谢产物对一种微生物生长不利。非特异性偏害关系特异性偏害关系,五、捕食关系(predation),微生物之间的对抗表现为吞食与被吞食，这种关系就叫捕食关系。,六、寄生关系(p
18、arasitism),寄生菌需要在宿主体内生活，从中摄取营养才能得以生长繁殖，这种关系称为寄生关系。专性寄生兼性寄生,第五节 菌种的退化、复壮与保藏,一、菌种的退化和复壮,菌种退化是指群体中退化细胞占一定数量后表现出的菌种性能下降。菌种复壮的方法：纯种分离 通过寄主进行复壮 联合复壮,二、菌种的保藏,保藏的原理是使微生物代谢基本停滞，生长繁殖受抑制。常用菌种保藏方法：定期移植法干燥法隔绝空气法蒸馏水悬浮法综合法,菌种保藏机构的任务：广泛收集科研和生产菌种、菌株，并加以妥善保管，使之达到不死、不衰、不乱以及便于研究、交换和使用的目的。菌种保藏机构： 中国微生物菌种保藏委员会(CCCCM) 中国典
19、型培养物保藏中心(CCTCC) 美国的典型菌种保藏中心(ATCC) 英国国家典型菌种保藏所（NCTC） 法国里昂巴斯德研究所（IPL）,国内外菌种保藏机构：,ATCC采用的两种保存方法,课后习题,1.细菌分批培养所表现的规律是什么？2.生长曲线各个时期在污水处理中有何应用？3.温度对微生物有何影响？有些微生物为何能够耐受极端温度？4.为什么用活性污泥法处理污水需要pH保持在6.5以上？5.试述氧气与微生物的关系。6.紫外辐射与电离辐射对微生物有何影响？7.何谓水活度？各类微生物所需的水活度是多少？8.简述微生物之间的关系。9.常用的菌种保存方法有哪些？10.试述平板菌落计数法的操作步骤及原理。,
