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1、,延时符,目录 Contents,02,延时符,第五节 单核细胞增生李斯特菌检验技术 GB 4789.302016 一、单核细胞增生李斯特菌生物学特性 二、单核细胞增生李斯特菌定性检验（第一法） 三、单核细胞增生李斯特菌平板计数法（第二法） 四、单核细胞增生李斯特菌MPN 计数法（第三法）,一、单核细胞增生李斯特氏菌的生物学特性,04,延时符,概况单核细胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes，LM）简称单增李斯特菌，归属李斯特氏菌菌属，该属含有6个菌种，分别为单核细胞增生李斯特菌(L. monocytogenes）、格氏李斯特菌(L. grayi)、斯氏李斯特菌(L.
2、seeligeri)、威氏李斯特菌(L. welshimeri) 、伊氏李斯特菌(L. ivanovii)、英诺克李斯特菌(L. innocua)。单核细胞增生李斯特氏菌(L. monocytogenes）和伊氏李斯特菌(L. ivanovii)（又称绵羊李斯特菌）具有致病性，其余菌种均为非致病菌；单核细胞增生李斯特氏菌(L. monocytogenes）是李斯特菌属的代表种，是李斯特氏菌属中唯一能引起人类疾病的菌种。,一、单核细胞增生李斯特氏菌的生物学特性,04,延时符,概况单核细胞增生李斯特氏菌(L. monocytogenes）能引起新生儿败血症、脑膜炎、孕妇流产等疾病，具有较高的临床死
3、亡率(20%70%)。单核细胞增生李斯特氏菌(L. monocytogenes）广泛存在于自然界中，耐低温，4 的环境中能增殖，是冷藏食品威胁人类健康的主要病原菌之一。单核细胞增生李斯特氏菌(L. monocytogenes）主要污染乳及乳制品、肉类制品、生蔬菜、冰淇淋以及水产品等。,一、单核细胞增生李斯特氏菌的生物学特性,04,延时符,菌体形态特征单核细胞增生李斯特氏菌(L. monocytogenes）为规则短杆状，两端纯圆，大小为0.4 m 0.5 m 0.5 m2.0 m，多单生，偶有排列为V型或短链。 G+，无芽孢，一般不形成荚膜，但在营养丰富的生境中也可形成荚膜。20 25 培养可
4、产生4根周生鞭毛，有动力，穿刺培养2-5天可见“倒伞状”生长。肉汤培养物在显微镜下可见翻跟斗运动。,一、单核细胞增生李斯特氏菌的生物学特性,04,延时符,培养特征需氧或兼性厌氧，生长温度范围1 45 ，最适生长温度30 37 ，4 或以下温度能缓慢增殖。对营养要求不高，在一般培养基上均能良好的生长，在血清或全血琼脂培养基上生长良好，加入0.21葡萄糖和23甘油更利于其生长。,一、单核细胞增生李斯特氏菌的生物学特性,04,延时符,菌落特征普通营养琼脂平板上为微带珠光露水样菌落，细小，半透明、边缘整齐；45度斜射光下，菌落呈特征性蓝绿光泽。血平板上培养的菌落呈灰白色、圆润，型溶血，溶血环直径达3
5、mm，4 放置4 d 后, 菌落和溶血环直径均增至5 mm，呈典型的奶油滴状。,一、单核细胞增生李斯特氏菌的生物学特性,04,延时符,菌落特征液体培养基培养18 h24 h后，呈轻度浑浊，数天后产生黏稠的沉淀，振荡时呈螺旋状上升，继续培养可形成颗粒状沉淀，不形成菌环、菌膜。半固体培养基中37 、24 h穿刺培养，沿穿刺线呈云雾状，随后缓慢扩散，在培养基表面下3 mm5 mm处呈伞状。,一、单核细胞增生李斯特氏菌的生物学特性,04,延时符,生化特征单核细胞增生李斯特氏菌(L. monocytogenes）37 、24 h培养,可以分解葡萄糖、果糖、海藻糖、水杨苷、鼠李糖，产酸不产气；不分解棉子糖
6、、肌醇、菊淀粉、卫茅醇、侧金盏花醇、木糖和甘露醇。MR和VP试验阳性，不产生靛基质，硫化氢阴性。,一、单核细胞增生李斯特氏菌的生物学特性,04,延时符,血清分型单核细胞增生李斯特氏菌(L. monocytogenes）的血清型是由O抗原（菌体抗原）和H抗原（鞭毛抗原）的特异性组合决定，共有13种血清型：1/2a、1/2b、1/2c、3a、3b、3c、4a、4ab、4b、4c、4d、4e和7。O抗原用阿拉伯数字表示，H抗原用英文字母表示。,二、单核细胞增生李斯特氏菌定性检验-GB 4789.30-2016 第一法,04,延时符,单核细胞增生李斯特氏菌定性检验程序流程图,适用于食品中单核细胞增生李
7、斯特氏菌的定性检验。,二、单核细胞增生李斯特氏菌定性检验-GB 4789.30-2016 第一法,04,延时符,增菌 以无菌操作取样品25 g(mL)加入到含有225 mL LB1 增菌液的均质袋中，在拍击式均质器上连续均质1 min2 min；或放入盛有225 mL LB1 增菌液的均质杯中，以8,000 r/min10,000 r/min均质1 min2 min。于30 1 培养24 h2 h，移取0.1 mL，转种于10 mLL B2 增菌液内，于30 1 培养24 h2 h。分离 取LB2 二次增菌液划线接种于李斯特氏菌显色平板和PALCAM 琼脂平板，于36 1 培养24 h48 h
8、，观察各个平板上生长的菌落。典型菌落在PALCAM 琼脂平板上为小的圆形灰绿色菌落，周围有棕黑色水解圈，有些菌落有黑色凹陷；在李斯特氏菌显色平板上的菌落特征，参照产品说明进行判定。,二、单核细胞增生李斯特氏菌定性检验-GB 4789.30-2016 第一法,04,延时符,初筛 自选择性琼脂平板上分别挑取3个5个典型或可疑菌落，分别接种木糖、鼠李糖发酵管，于36 1 培养24 h2 h，同时在TSA-YE平板上划线，于36 1 培养18 h24 h，然后选择木糖阴性、鼠李糖阳性的纯培养物继续进行鉴定。,二、单核细胞增生李斯特氏菌定性检验-GB 4789.30-2016 第一法,04,延时符,鉴定
9、(或选择生化鉴定试剂盒或全自动微生物鉴定系统等) 染色镜检动力试验 生化鉴定 过氧化氢酶试验，过氧化氢酶阳性反应的菌落继续进行糖发酵试验和 MR-VP试验。 溶血试验 协同溶血试验cAMP(可选项目)小鼠毒力试验(可选项目),二、单核细胞增生李斯特氏菌定性检验-GB 4789.30-2016 第一法,04,延时符,结果与报告 综合以上生化试验和溶血试验的结果，报告25 g(mL)样品中检出或未检出单核细胞增生李斯特氏菌。,三、单核细胞增生李斯特氏菌平板计数法-GB 4789.30-2016第二法,04,延时符,单核细胞增生李斯特氏菌平板计数程序流程图,适用于单核细胞增生李斯特氏菌含量较高的食品
10、中单核细胞增生李斯特氏菌的计数。,三、单核细胞增生李斯特氏菌平板计数法-GB 4789.30-2016 第二法,04,延时符,样品的稀释以无菌操作取样品25 g(mL)，放入盛有225 mL 缓冲蛋白胨水或无添加剂的LB肉汤的无菌均质袋内(或均质杯)内，在拍击式均质器上连续均质1 min2 min或以8,000 r/min10,000 r/min均质1 min2 min。液体样品，振荡混匀，制成1:10的样品匀液。用1 mL无菌吸管或微量移液器吸取1:10样品匀液1 mL，沿管壁缓慢注于盛有9 mL缓冲蛋白胨水或无添加剂的LB肉汤的无菌试管中(注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面)，振摇试管，制
11、成1:100的样品匀液。依次制备10倍系列稀释样品匀液。每递增稀释1次，换用1支1mL无菌吸管或吸头。,三、单核细胞增生李斯特氏菌平板计数法-GB 4789.30-2016 第二法,04,延时符,样品的接种根据对样品污染状况的估计，选择2个3个适宜连续稀释度的样品匀液(液体样品可包括原液)，每个稀释度的样品匀液分别吸取1 mL以0.3 mL、0.3 mL、0.4 mL的接种量分别加入3块李斯特氏菌显色平板，用无菌L棒涂布整个平板，注意不要触及平板边缘。培养 通常情况下，涂布后，将平板静置10 min；如样液不易吸收，可将平板放在培养箱36 1 培养1 h，等样品匀液被吸收后翻转平皿，倒置于培养
12、箱，36 1 培养24 h48 h。,三、单核细胞增生李斯特氏菌平板计数法-GB 4789.30-2016 第二法,04,延时符,确认实验-初筛典型菌落确定： 李斯特氏菌显色平板上的菌落特征以产品说明为准。典型菌落挑选：从典型菌落中任选5个菌落(小于5个全选)，分别初筛和鉴定。自选择性琼脂平板上分别挑取3个5个典型或可疑菌落，分别接种木糖、鼠李糖发酵管，于36 1 培养24 h2 h，同时在TSA-YE平板上划线，于36 1 培养18 h24 h，然后选择木糖阴性、鼠李糖阳性的纯培养物继续进行鉴定。 确认实验-鉴定 ：染色镜检、动力试验、生化鉴定、溶血试验、协同溶血试验cAMP(可选项目),三
13、、单核细胞增生李斯特氏菌平板计数法-GB 4789.30-2016 第二法,04,延时符,典型菌落计数以及对应的计算公式的应用计数范围要求：选择有典型菌落的平板，菌落数合计在15 CFU150 CFU之间的平板，计数典型菌落数。计算公式1计算公式2.,三、单核细胞增生李斯特氏菌平板计数法-GB 4789.30-2016 第二法,04,延时符,典型菌落计数以及对应的计算公式的应用计数范围要求：选择有典型菌落的平板，菌落数合计在15 CFU150 CFU之间的平板，计数典型菌落数。公式1适用情况只有一个稀释度的平板菌落数在15 CFU150 CFU 之间且有典型菌落，计数该稀释度平板上的典型菌落。
14、所有稀释度的平板菌落数均小于15 CFU且有典型菌落，应计数最低稀释度平板上的典型菌落。某一稀释度的平板菌落数大于150 CFU 且有典型菌落，但下一稀释度平板上没有典型菌落，应计数该稀释度平板上的典型菌落。所有稀释度的平板菌落数大于150 CFU且有典型菌落，应计数最高稀释度平板上的典型菌落。所有稀释度的平板菌落数均不在15 CFU150 CFU之间且有典型菌落，其中一部分小于15 CFU或大于150 CFU时，应计数最接近15 CFU或150 CFU的稀释度平板上的典型菌落。,三、单核细胞增生李斯特氏菌平板计数法-GB 4789.30-2016 第二法,04,延时符,公式1应用举例:计算并
15、报告下表检测结果,三、单核细胞增生李斯特氏菌平板计数法-GB 4789.30-2016 第二法,04,延时符,公式1应用举例 结果如下： 根据计数公式的要求，对表内数据与GB 4789.30-2016的计数要求进行比对分析，其中样品序号15适用计算公式1，按照公式1进行计算具体计算如下：样品1：T=（8+12+10）450.1=240；报240 CFU/g(mL)或2.4102 CFU/g(mL)。样品2：T=（2+2+0）340.130；报30 CFU/g(mL)。样品3：T=(18+26+21) 350.1=390; 报390 CFU/g(mL)或3.9102 CFU/g(mL)。样品4：
16、T=(8+12+5) 450.01=2000; 报2,000 CFU/g(mL)或2.0103 CFU/g(mL)。样品5：T=(6+5+4) 350.1=90; 报90 CFU/g(mL)。注：菌落数小于100CFU 时,按“四舍五入”原则修约,以整数报告；菌落数大于或等于100CFU 时，第3位数字采用“四舍五入”原则修约后,取前2位数字，后面用0代替位数;也可用10的指数形式来表示，按“四舍五入”原则修约后，采用两位有效数字；T0,则以小于1乘以最低稀释倍数报告。,三、单核细胞增生李斯特氏菌平板计数法-GB 4789.30-2016 第二法,04,延时符,典型菌落计数以及对应的计算公式的
17、应用计数范围要求：选择有典型菌落的平板，菌落数合计在15 CFU150 CFU之间的平板，计数典型菌落数。公式2适用情况2个连续稀释度的平板菌落数均在15 CFU150 CFU之间且均有典型菌落。,三、单核细胞增生李斯特氏菌平板计数法-GB 4789.30-2016 第二法,04,延时符,公式2应用举例： :计算并报告下表检测结果,具体计算如下： T=(12+8+11) 25 (6+9+1) 35 1.10.1=733.09; 报730 CFU/g(mL)或7.3102 CFU/g(mL)。注：菌落数小于100CFU 时,按“四舍五入”原则修约,以整数报告；菌落数大于或等于100CFU 时，第
18、3位数字采用“四舍五入”原则修约后,取前2位数字，后面用0代替位数;也可用10的指数形式来表示，按“四舍五入”原则修约后，采用两位有效数字；T0,则以小于1乘以最低稀释倍数报告。,三、单核细胞增生李斯特氏菌平板计数法-GB 4789.30-2016 第二法,04,延时符,结果与报告 根据计算结果，报告每g(mL)样品中单核细胞增生李斯特氏菌菌数，以CFU/g(mL)表示；如T 值为0，则以小于1乘以最低稀释倍数报告。,四、单核细胞增生李斯特氏菌MPN 计数法-GB 4789.30-2016 第三法,04,延时符,适用于单核细胞增生李斯特氏菌含量较低(100 CFU/g)而杂菌含量较高的食品中单
19、核细胞增生李斯特氏菌的计数，特别是牛奶、水以及含干扰菌落计数的颗粒物质的食品。,四、单核细胞增生李斯特氏菌MPN计数法-GB 4789.30-2016第三法,04,延时符,样品的稀释以无菌操作称取样品25 g(mL)，放入盛有225 mL 缓冲蛋白胨水或无添加剂的LB肉汤的无菌均质袋内(或均质杯)内，在拍击式均质器上连续均质1 min2 min或以8,000 r/min10,000 r/min均质1 min2 min。液体样品，振荡混匀，制成1:10的样品匀液。用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1:10样品匀液1 mL，沿管壁缓慢注于盛有9 mL缓冲蛋白胨水或无添加剂的LB肉汤的无菌试管中(注意
20、吸管或吸头尖端不要触及稀释液面)，振摇试管或换用1支1 mL无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成1:100的样品匀液。依次制备10倍系列稀释样品匀液。每递增稀释1次，换用1支1mL无菌吸管或吸头。,四、单核细胞增生李斯特氏菌MPN计数法-GB4789.30-2016 第三法,04,延时符,接种和培养根据对样品污染状况的估计，选取3个适宜连续稀释度的样品匀液(液体样品可包括原液)，接种于10 mL LB1肉汤，每一稀释度接种3管，每管接种1 mL(如果接种量需要超过1 mL，则用双料LB1增菌液)于30 1 培养24 h2 h。每管各移取0.1 mL，转种于10 mL LB2 增菌液内，于30 1
21、 培养24 h2 h。用接种环从各管中移取1环，接种李斯特氏菌显色平板，36 1 培养24 h48 h。,四、单核细胞增生李斯特氏菌MPN计数法-GB 4789.30-2016第三法,04,延时符,确证试验-初筛 自每块平板上挑取5个典型菌落(5个以下全选)，进行初筛和鉴定。自选择性琼脂平板上分别挑取3个5个典型或可疑菌落，分别接种木糖、鼠李糖发酵管，于36 1 培养24 h2 h，同时在TSA-YE平板上划线，于36 1 培养18 h24 h，然后选择木糖阴性、鼠李糖阳性的纯培养物继续进行鉴定。确证试验-鉴定 染色镜检、动力试验、生化鉴定 、溶血试验、协同溶血试验cAMP(可选项目),四、单
22、核细胞增生李斯特氏菌MPN计数法-GB 4789.30-2016第三法,04,延时符,结果与报告 根据证实为单核细胞增生李斯特氏菌阳性的试管管数，查MPN 检索表，报告每g(mL)样品中单核细胞增生李斯特氏菌的最可能数，以MPN/g(mL)表示。注意：表采用3个稀释度0.1 g(mL)、0.01 g(mL)和0.001 g(mL)，每个稀释度接种3管。 表内所列检样量如改用l g(mL）、0.1 g(mL)和0.01 g(mL)时，表内数字应相应降低10倍；如改用0.01 g(mL)、0.001 g(mL)、0.0001 g(mL)时，则表内数字应相应增加10倍，其余类推。,03,请输入标题,延时符,谢谢观赏,THANK YOU FOR YOUR GUIDANCE.,
