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1、.,1,外 泌 体,研 究 生 科 研 汇 报,精准肿瘤学的明星,.,2,研 究 生 科 研 汇 报,1,外泌体的发现与研究,外泌体的特征,外泌体的分离与鉴定,外泌体与肿瘤的关系,总结与展望,2,3,4,5,.,3,研 究 生 科 研 汇 报,1983年, Pan等人在绵羊网织红细胞体外成熟的过程中, 用异硫氰酸荧光素或者125I标记的转铁蛋白受体的抗体, 对转铁蛋白受体进行追踪, 发现细胞膜的转铁蛋白受体在与一种包含多肽的囊泡结合后, 囊泡与细胞膜分离, 分泌到上清, 这是人类首次观测到游离于细胞外存在的囊泡。,外泌体的发现与研究,1987年, 他们发现这些囊泡中含有在网织红细胞成熟过程中丢
2、失的一些成分（乙酰胆碱酯酶、葡萄糖转运蛋白、核苷转运蛋白和转铁蛋白受体等），同时, 他们发现这些囊泡膜具有网织红细胞细胞膜的特征, 比如也有极高的鞘磷脂含量, 显示了其区别于细胞或血小板等其他组分的独特性. 他们将其命名为外泌体(exosome)。,.,4,研 究 生 科 研 汇 报,外泌体的发现与研究,外泌体却并没有因为初次被发现而被引起重视，反而被误认为是细胞处理胞内垃圾的一种囊泡外泌形式，用于装载和运送细胞在成熟过程中所产生的诸如质膜受体一类的废弃物。,2007年，Valadi证实了细胞分泌的外泌体中含有的mRNA以及MicroRNA均具备良好的生物活性。,随后，许多研究均发现外泌体可通
3、过携带蛋白质及核酸等成分在细胞间传递信息并发挥功能。,1996年, Raposo等人发现外泌体具有呈递抗原, 并刺激T细胞增殖的作用。,热点话题,.,5,外泌体的发现与研究,研 究 生 科 研 汇 报,.,6,外 泌 体 的 特 征,研 究 生 科 研 汇 报,细胞内由多囊泡胞内体(multivesicular bodies, MVBs)向外出芽形成, 通过MVBs与细胞膜融合, 由细胞主动分泌释放到细胞外的腔内囊泡 (intraluminal vesicles, ILVs)。,直径约为30-150nm，具有“杯状”或“碟状”形态, 外侧含有脂质双分子层。,被认为是细胞间分子交换和信息传递的生
4、物纳米颗粒。,表面标记蛋白主要有 Alix，TSG101，CD63，CD9，CD81和 HSP70。主要含有以下几种物质：MHC I 类和/或 II 类分子、热休克蛋白（hsp）、四跨膜蛋白、整合素、细胞骨架蛋白以及一些生物酶类。,携带母体细胞特征性生物信息分子，如蛋白质、脂质、脱氧核糖核酸(DNA)、信使RNA(mRNA)、微小RNA（miRNA）以及非编码RNA（Non-codingRNA）等。,.,7,外 泌 体 的 特 征,研 究 生 科 研 汇 报,正常细胞及肿瘤细胞均分泌外泌体，恶性肿瘤细胞较非恶性细胞能分泌更多外泌体。通过分析外泌体可以直接获得癌细胞的基本信息。,被分泌出的外泌体
5、会进入血液、唾液、尿液及乳汁等体液中，通过循环系统到达其他细胞与组织，产生远程调控作用。,人体中大约有1014个外泌体，近乎于平均每个细胞产生1000-10000个。,.,8,外 泌 体 的 特 征,研 究 生 科 研 汇 报,外泌体通过内吞进入受体细胞后，将“货物”释放进入胞质内，并重新形成多泡体。,外泌体直接与受体细胞膜融合，将携带的“货物”释放进入受体细胞胞质。,外泌体上的配体与受体细胞膜上特殊受体结合，既能起到信号传导作用，也能通过内吞作用，将“货物”运入胞内。,不同来源的外泌体进入受体细胞的方式,.,9,外泌体的分离与鉴定,研 究 生 科 研 汇 报,利用外泌体表达的特异性抗体标记的
6、免疫磁珠进行富集，可获得纯度较高的外泌体，但操作复杂且影响因素较多。,超速离心法,沉淀法,免疫亲和捕获法,超速离心法获得的外泌体数量多，但常有蛋白杂质。,改良后的蔗糖密度梯度离心法，操作简便，成本较 低，得到了广泛应用。,使用聚乙二醇沉淀法获得的外泌体，蛋白污染少，分离效率高，但颗粒大小不一。,近年来各种商业化的外泌体提取试剂盒逐渐得以推广。,试剂盒,.,10,外泌体的分离与鉴定,研 究 生 科 研 汇 报,透射电子显微镜(transmission electron microscopy, TEM)观察外泌体的大小、 形态，测量直径,纳米粒子跟踪分析 (nanoparticle trackin
7、g analysis, NTA)测量外泌体的直径,流式细胞技术(flow cytometry, FACS)分离外泌体并分析其纯度,Western-blot（WB）法或磁珠分选的免疫学方法等可清楚地分析外泌体表面存在标志蛋白,.,11,外泌体与肿瘤的关系,研 究 生 科 研 汇 报,发 生,发 展,转 移,恶 化,免疫逃逸,胶质瘤细胞分泌的外泌体可以促进其自身的增殖,间充质干细胞分泌的外泌体可以促进胃癌细胞的生长,外泌体递送EGFR调节肝脏微环境促进胃癌肝转移,乳腺癌分泌的外泌体可以促进肿瘤血管生成、肿瘤生长和扩散，促进周围正常乳腺细胞的增殖并抑制它们的凋亡,黑色素瘤所分泌的外泌体膜上含有Fas
8、配体分子，可与T细胞的Fas受体相互作用，介导T细胞凋亡以逃脱免疫监视,免疫激活,肿瘤分泌的外泌体膜上携带肿瘤细胞的抗原, 被树突状细胞识别并呈递给T细胞, 从而诱发免疫反应, 促进免疫激活,.,12,外泌体与肿瘤的关系,研 究 生 科 研 汇 报,肿瘤诊断的生物标志物,肿瘤治疗的生物标志物,肿瘤潜在的治疗靶点,抗肿瘤药物的有效载体,.,13,外泌体与肿瘤的关系,研 究 生 科 研 汇 报,含量波动,影像学生化病理学,早期检测难,早期确诊难,容易引发扩散,循环肿瘤细胞（CTC）,循环肿瘤DNA/RNA（ctDNA/RNA）,肿瘤细胞分泌的外泌体,液体活检,微创,早期诊断,随机性,不确定性,不能
9、反映肿瘤的病理状态,对肿瘤远端转移不是一个可靠的标准,半衰期短,监测病人即时情况,检测与肿瘤细胞类型、疾病进程、治疗手段等有关,准确度较低,敏感性差,循环肿瘤细胞（CTC）,循环肿瘤DNA/RNA（ctDNA/RNA）,.,14,外泌体与肿瘤的关系,研 究 生 科 研 汇 报,几乎存在于人体所有的体液里,是液体活检的重要组成部分,在体液中含量多于CTC,保护内部的核酸分子免于被降解,较为容易进入体液被检测到,比CTC更加灵敏,每毫升血液超过10个,具有脂质双分子层结构,体积较小，直径30150nm,通透能力较强,目前被看好的作为液体活检的检测靶点之一,.,15,外泌体与肿瘤的关系,研 究 生
10、科 研 汇 报,含有癌细胞信息的外泌体被分泌到细胞外环境中, 可以被利用作为肿瘤早期诊断的生物标志物。,肿瘤细胞分泌的外泌体由于其中丰富的内含物可作为诊断肿瘤发生、发展、转移及其恶化程度的标志物,外泌体中生物标志分子,蛋白质分子,核酸分子,蛋白质分子,细胞膜,细胞质,反应癌细胞的状态, 具有作为衡量细胞生理状态生物标志物的潜力。,核酸分子,.,16,外泌体与肿瘤的关系,研 究 生 科 研 汇 报,改变细胞微环境促进细胞重编程,参与肿瘤细胞免疫逃逸,影响细胞成纤维化,可以被癌细胞内吞,.,17,外泌体与肿瘤的关系,研 究 生 科 研 汇 报,相关蛋白,小分子化合物,siRNA/miRNA,改造后
11、的外泌体是肿瘤治疗的重要靶点和工具,.,18,外泌体与肿瘤的关系,研 究 生 科 研 汇 报,外泌体来源于机体细胞本身，属于内源性物质，故可以轻松逃逸机体的免疫排斥反应，减少因为治疗而对人体造成的额外伤害。,现已经发现天然外泌体中含有的包括蛋白质、RNA、细胞因子等在内的众多生物活性分子，说明外泌体的装载物范围广，大部分药物可以被有效装载。,大部分内容物在外泌体的保护下能够存在较长时间不被降解并保持活性，具有较长的半衰期，能够增加药物在体内发挥作用的时间，从而达到对药物的有效利用。,源自特定细胞的外泌体具有靶向性和特异性，增加药物供给的精准性。,外泌体分布广泛，能够存在于大部分体液中，使用其装
12、载的药物具有良好的耐受性并且能作用于体内大部分器官，甚至于中枢神经系统。普通药物会因为血脑屏障的存在而被拒之脑外，无法发挥其药物活性，而外泌体作为一种脂质囊泡则能够通行自由，对于靶向脑部的药物有非常大的发展空间。,间充质干细胞（）的外泌体作为包装、递送紫杉醇的载体已得到广泛应用,.,19,研 究 生 科 研 汇 报,外泌体作为具有生物学功能的小囊泡内容物丰富、稳定性高，具有一定的组织特异性，是近年肿瘤研究领域关注的热点。,充分认识并利用外泌体的特点优势，筛选并发现新型标志物，有望克服肿瘤异质性等难题，在肿瘤早期诊断、治疗、监测与预后评价等方面将具有重要的临床意义。,外泌体有望作为一种药物载体，在肿瘤治疗方面可能具有巨大的开发潜能。,总,结,.,20,随着蛋白质组学、转录组学、高通量测序等技术平台以及纳米技术、生物信息学分析技术等的飞速进展，外泌体必定会成为精确肿瘤学中一颗 璀璨明星,研 究 生 科 研 汇 报,展,望,，,.,21,研 究 生 科 研 汇 报,
