第八章分子荧光光谱法课件.ppt

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1、第八章 分子发光分析法Molecular luminescence spectroscopy,概论 分子荧光和磷光光谱分析法 化学发光分析法,First observed from quinine by Sir John Frederick William Herschel in 1845, blue fluorescence 450nm.,Quinine Solution,Blue glass Filter 400nm,Yellow glass of wineEm filter 400nm,1575年西班牙内科医生和植物学家N.Monardes，提到贮存在由菲律宾紫檀木“Lignum Nep

2、hriticum”制成的杯中的水，呈现了极为可爱的天蓝色。,8.1 概论,1852年，Stokes在用分光光度计考察奎宁和叶绿素的荧光时，观察到其荧光波长比入射光波长稍长些，判断这种现象是物质在吸收光能后重新发射不同波长的光，从而导入了荧光是光发射的概念，他还由发荧光的矿石“萤石” 而提出“荧光”这一术语。,George Gabriel Stokes （1819-1903）,1858 E. Becquerel 第一次发现磷光。 1867年，Goppelsroder进行了荧光的首次应用分析，应用铝桑色素配合物的荧光进行铝的测定。 19世纪以前，荧光的观察是靠肉眼进行的，直到1928年，才由Jet

3、te和West设计了第一台荧光计。,Many materials emits fluorescenceLiquids, solids, gasOrganic compoundsaromatic hydrocarbons(anthracene, perylene,naphthalene), fluorescein,rhodamines, aminoacids(tryptophan, tyrosine), etc.Inorganic compoundslanthanide ions (Eu3+, Tb3+), doped glasses (e.g. with Nd, Mn, Ce , Sn, Cu

4、, Ag), crystals (ZnS, CdS, ZnSe, GaS), etc.Organometallic compounds,Fluorophore Samples,荧光灯管-电激发发光,3-Br-Carbazole 磷光,荧光棒-化学反应发光,水母-生物发光,按激发的模式分类：,按分子激发态的类型分类：,光致发光Photoluminescence 化学发光/生物发光热致发光场致发光摩擦发光,按光子能量分类：,斯托克斯荧光(Stokes)： exem共振荧光(Resonance)： ex=em,8.1.1 分子发光的类型,8.1.2 分子发光分析法的特点 基于化合物的荧光/磷光测量而

5、建立起来的分析方法称为分子荧光/磷光光谱法。灵敏度高, 比吸收光谱法低13个数量级；试样量小, 线性范围宽；选择性比吸收光谱法好，因为能产生紫外可见吸收的分子不一定发射荧光或磷光；应用范围不如吸收光谱法广; 在传感器, 生物医药和环境科学等方面的研究具有优越性。,Ground singlet state,Excited state,1 荧光和磷光的产生,泡利不相容原理,8.2 分子荧光和磷光光谱分析法,8.2.1 基本原理,激发后分子的多重性可能改变( S/T两态).,单重态: 所有电子自旋都配对的分子的电子状态。大多数有机物分子的基态是单重态。当基态一对电子中的一个被激发到较高能级，其自旋方

6、向没有改变，分子仍处于单重态。 三重态: 有两个电子的自旋不配对而平行的状态。激发三重态能量较激发单重态低。,振动弛豫：激发态分子由同一电子能级中的较高振动能级转至较低振动能级的过程，其效率较高，10-14 10-12s内完成。内转换：电子在相同多重态的两个能级间，由高能级回到低能级的过程。 系间窜越：不同多重态间进行的跃迁, 激发态分子的电子自旋发生倒转: S1T1。在10-210-6s内完成。,无辐射跃迁过程：,激发态分子的失活: 激发态分子不稳定，要以辐射或无辐射跃迁的方式回到基态。,辐射跃迁: 荧光Fluorescence： 受光激发的分子从S1的最低振动能级回到基态S0所发出的辐射。

7、寿命10-8 10-10s，是相同多重态之间的跃迁，跃迁几率、速度较大，速率常数kf为106109s-1。 磷光Phosphorescence： 从T1态的最低振动能级回到基态S0所发出的辐射。由于磷光的产生伴随自旋多重态的改变，辐射几率、速度远小于荧光，寿命长（10-4 10s）, 能量更低！,除极少数例外，通常在发生辐射跃迁之前便发生了非辐射跃迁而回到S1态，不论开始处于哪个激发S态，最后到达S1最低振动能级。所以荧光是来自S1态的最低振动能级的辐射跃迁。,06:15:21,去活化演示,e,e,吸收,振动驰豫,e,e,06:15:21,去活化演示,e,内转换,e,产生荧光,e,S0,S2,

8、S1,Ground StateElectrons,S1,S2,Phosphorescence,T1,IntersystemCrossing,1) 荧光(磷光)寿命,分子在激发态的平均时间或者说处于激发态的分子数目衰减到原来的1/2所经历的时间。处于S1(T1)电子态的荧光体平均寿命()可以表示为：,2. 荧光磷光寿命及量子产率,KF（P）是荧光/磷光发射过程的速率常数Ki 是非辐射跃迁的速率常数,发光寿命及量子产率是两个重要的参数.,2) 荧光(磷光)量子产率,物质分子发射荧光/磷光的能力用荧光(磷光)量子产率（）表示：,kFkp 荧光或磷光发射速率常数，主要取决于物质的分子结构； Ki 非辐

9、射跃迁的速率常数，主要取决化学环境，同时也与物质的分子结构有关。,使kF增大而使其他失活过程（系间窜越、外转换、内转换）的速率常数Ki 减小都可使荧光增强。 大多数荧光物质的量子产率在0.11之间；f0.1具有分析应用价值。 例如：0.05mol/L的硫酸喹啉，F=0.55； 荧光素, F=1,跃迁的类型:,8.2.1.2 荧光磷光与分子结构的关系,对于有机荧光物质:,*,n* max100 平均寿命10-510-7sec,* max104 平均寿命10-710-9sec,* n,* 是有机化合物产生荧光的主要跃迁类型。,强荧光有机化合物具备以下特征: 具有大的共轭键结构； 具有刚性的平面结构

10、； 具有最低的单重激发态S1为*型； 取代基团为给电子取代基。, 共轭效应,产生荧光的有机物质，都含有共轭双键体系，通常1个苯环。共轭体系越大，离域大键的电子越容易激发，荧光与磷光越容易产生。,芳香族化合物的荧光最常见且最强; 随着环的数目和稠合程度增加，大多数未取代芳烃荧光峰红移，。简单杂环化合物不发荧光，但具有稠环结构的杂环化合物都发荧光。,有刚性结构的分子容易发荧光，荧光物质的刚性和平面性增加，有利于荧光发射。, 刚性平面结构,芴 F=1,联苯 F=0.2,不产生荧光,产生荧光,荧光黄F=0.92,不产生荧光,萘,VA,F(萘)= 5F(VA),酚酞,偶氮菲,偶氮苯,1）给电子取代基加强

11、荧光,3. 取代基的影响,NH2， NHR， NR2， OH， OR， CN,产生 p 共轭,2）得电子取代基减弱荧光、加强磷光,C=0， COOH ， NO2等，,硝基苯：不产生荧光、弱磷光,二苯甲酮：弱荧光、强磷光S1T1的系间窜跃产率接近1,重原子取代基效应： Cl， Br ， I,S1 T1的系间窜跃增强，荧光减弱，磷光增强。,空间位阻,3）取代基的位置,反式二苯乙烯强荧光物质,F=0.75,F=0.03,立体异构体,顺式二苯乙烯非荧光物质,电离效应,H=1, 有荧光,H=13, 无荧光,4. 最低电子激发单重态的性质 （p212）,大多数芳香化合物的激发态比基态极性大，溶剂极性增大，

12、则激发态能量降低，荧光波长红移并使荧光强度增强。 除溶剂极性的影响之外，若溶剂和荧光物质发生了特殊的相互作用，如形成氢键或使荧光物质电离状态改变，会使荧光强度、波长改变。形成氢键能力越大，荧光波长发生更大的位移，向短波移动。 例：奎宁在苯、乙醇、水中的荧光强度比为1:30:1000 另，含重原子的溶剂（碘乙烷、四溴化碳）使荧光体荧光减弱。,1. 溶剂效应,8.2.1.3 影响分子发光的环境因素,2. 介质酸碱性的影响,当荧光物质是弱酸或弱碱时，带有酸性或碱性取代基, 溶液的pH值对荧光强度有较大的影响。因为弱酸或弱碱在不同酸度中，分子和离子的电离平衡发生改变，因此荧光强度也有差异。 例如苯胺在

13、pH7-12溶液中会发生蓝色荧光，在pH小于2或大于13的溶液中都不发生荧光。,3. 温度和黏度 温度影响非常大。温度降低会使荧光强度增大；磷光影响更大。,如荧光素的乙醇溶液在0以下每降低10，荧光效率增加3%，冷至-80时，荧光效率为100%。,4. 有序介质的影响,另外，溶解氧的存在往往使荧光强度降低。,表面活性剂或环糊精属于有序介质，对分子的发光特性有着显著的影响。,8.2.1.4 荧光磷光的猝灭 Quenching of fluorescence/phosphorescence,发光分子与溶剂或溶质分子之间发生的使发光强度下降的物理或化学作用过程(狭义)。 使荧光物质荧光强度下降/荧光

14、量子产率下降的作用;荧光物质的荧光强度与浓度偏离线性关系(广义).,实质-与发光过程相互竞争从而缩短发光分子激发态寿命的过程.,猝灭剂-使发光分子发光强度下降的物质。,卤素离子、重金属离子、氧分子、硝基化合物、重氮化合物、羰基化合物等吸电子极性物质。,动态猝灭：Collisional quenching 猝灭剂与发光物质的激发态分子之间的相互作用。属碰撞作用，有能量转移和电荷转移。 静态猝灭：Static quenching 猝灭剂与发光物质的基态分子之间的相互作用。形成不发光的络合物。,猝灭类型：,荧光猝灭的主要原因是碰撞猝灭。,* 转入三重态猝灭 分子由于系间跨越跃迁，由单重态跃迁到三重态

15、。转入三重态的分子在常温下不易发光。* 发生电子转移反应猝灭 某些猝灭剂分子与荧光物质分子相互作用时，发生了电子转移反应，引起荧光猝灭。* 荧光物质自猝灭 在浓度较高的荧光物质溶液中，单重激发态的分子在发荧光之前和未激发的荧光物质分子碰撞而引起的自猝灭。有些荧光物质在浓度较高时会形成二聚体或多聚体，使它们的吸收光谱发生变化，也引起溶液荧光强度的降低或消失。,荧光猝灭法是利用随着猝灭剂的加入，荧光体荧光强度的减少与猝灭剂的浓度呈线性关系而用于测定猝灭剂的含量。,猝灭现象的应用:,一般说来，荧光猝灭法比直接荧光法更灵敏，并具有更高的选择性； 猝灭效应还可用以揭示猝灭剂的扩散速率，或在生物化学研究中

16、用以推测小分子与蛋白质/DNA的结合位点、构象变化等。,猝灭常数公式,动态猝灭方程,F0和F分别为不存在猝灭剂和猝灭剂浓度为Q时的荧光强度。 0为没有猝灭剂存在时荧光分子的平均寿命（s）.KSV为Stern-Volmer猝灭常数（molL-1）.kq 为双分子猝灭速率常数（Lmol-1s-1）.,Stern-Volmer方程表明， F0/F（或 0/）与猝灭剂的浓度Q呈线性关系。方程的斜率KSV即猝灭常数。作为有效的猝灭剂,KSV约为1001000Lmol-1.,静态猝灭方程,K为络合物的形成常数，且络合比为1：1时才符合此式。,区分方法：,* 改变温度 温度升高，猝灭常数增大为动态猝灭，相反

17、为静态猝灭。* 考察吸收光谱的变化 吸收光谱变化为静态猝灭；不变化为动态猝灭。* 测量荧光寿命 猝灭剂加入荧光寿命不变为静态猝灭，改变为动态猝灭。,T1,T2,T1,T2,动态猝灭,静态猝灭,T1 T2,荧光(磷光)均为光致发光.在光辐射作用下任何发光化合物都具有两种特征光谱。,A. 激发光谱,固定某一发射波长，扫描激发波长,测定该波长下荧光强度随激发波长变化所得的光谱。荧光激发光谱与紫外-可见吸收光谱类似.,8.2.1.5 激发光谱和发射光谱,B. 发射光谱,固定某一激发波长,扫描发射波长，测定荧光发射强度随发射波长变化得到的光谱。,固定em=620nm(MAX),ex =290nm (MA

18、X),激发波长和荧光波长如何选择?,若无散射光的干扰，一般以最大激发波长为激发波长，最大发射波长为荧光的测定波长，此时测定的灵敏度最高。,荧光光谱的特点： 斯托克斯位移（Stokes shift)。 与激发光谱相比，荧光光谱的波长总是出现在更长的波长处；其数值为激发和发射波长的波数之差。 荧光光谱与激发波长无关。 无论用280和350nm作激发光源，所得荧光发射光谱形状和峰位置都相同; 只是强度有所变化。最大激发波长下产生的荧光最强。, 荧光光谱通常只含一个发射带,分子的激发光谱可能含有几个激发带，但发射光谱通常只含一个发射带；因为分子如被激发到高于S1的电子态，由于经过极快的内转换和振动弛豫

19、降到S1电子态的最低振动、转动能级，然后以辐射形式释放能量回到基态,与分子被激发到哪个能级无关。, 荧光物质的激发光谱与紫外吸收光谱形状相似,固定em=620nm(MAX),固定ex=290nm (MAX),em= 620nm(MAX), 吸收光谱与发射光谱大致成镜像对称,1. 荧光强度与浓度的关系 If=fIa Ia=（I0It）; I0入射光强度； It透射光强度； 荧光量子产率（f）。,8.2.1.6 发光强度与溶液浓度的关系 分子荧光分析和分子磷光分析是基于光致发光现象而建立起来的分析方法。荧光强度与荧光物质的吸光程度及其发射荧光的能力有关。,t,根据朗伯-比尔定律:,It/Io =e

20、-abc,If=2.303f I0 bc当I0一定时, If =KC。 在低浓度时(当A0.05)，溶液的荧光强度与荧光物质的浓度成正比，这是荧光法定量的基础。,If=f(I0-It)= fI0(1- It/Io),测定最佳浓度范围为： 10-5g/ml100g/ml,当浓度较浓时（A0.05），荧光强度同浓度的线性关系将向浓度轴偏离。,光源,单色器1,样品池,单色器2,检测器,放大与记录,垂直方向,8.2.2 荧光/磷光分析仪器,荧光分光光度计可用于测绘激发光谱和荧光光谱, 并用于定量分析，,8.2.2.1 荧光分光光度计(spectrofluorometer),紫外-可见分光光度计:,荧光

21、(磷光)分光光度计:,荧光仪与分光光度计的主要差别：,垂直测量方式，消除透射光影响. 高灵敏度原因. 两个单色器（激发和发射）常用光栅.,06:15:21,PerkinElmer,1. 光源,发射强度高且稳定 光辐射强度随波长的变化小 有足够长的使用寿命,1) 弧光灯和白炽灯,A. 高压氙灯：,波长范围：400800nm 使用寿命：20004000h,目前应用最广泛的一种光源。发射波长范围宽, 强度大.,B. 汞灯:,应用广泛的线光源.,2) 固态光源,3) 激光光源,第一单色器选择激发光波长,波长落于紫外区，称为激发单色器。 第二单色器（荧光单色器）与激发光入射方向垂直，用来选择荧光波长，把

22、激发光所发射的容器表面的散射光、瑞利散射光、拉曼散射光以及溶液中杂质荧光滤去，让荧光物质发出的荧光通过照射到检测器上。可提高方法的选择性和准确度。,2. 单色器,平面衍射光栅,3. 样品池,吸收池的形状： 通常都为1X1 cm的柱型液池 紫外-可见分光光度计吸收池两面透光 荧光分光光度计样品池四面透光2. 样品池的材料： 根据测量波长范围，紫外-可见分光光度计吸收池在可见光区采用玻璃，在紫外光区采用石英。荧光分光光度计样品池采用石英。,紫外-可见分光光度计的吸收池与荧光分光光度计的样品池（荧光池）有什么区别？,紫外-可见分光光度计吸收池,荧光分光光度计样品池,I0,It,I0,It,IF,p,

23、使用注意事项,4. 检测器,大都采用光电倍增管放大倍数：2n5n;n=10,103107，最大108109,5. 读数装置,磷 光：1010-4 sec,8.2.2.2 磷光分析仪器,磷光镜:一种机械切光装置.转筒式和转盘式。,磷光仪中的2种机械切光器,样品池与荧光分光光度计的区别：,室温下样品池与荧光样品池相同; 在低温情况下，样品池需要放在盛液氮的石英杜瓦瓶内，来测定低温磷光。,8.2.3 荧光的常规测定方法,直接测量法 间接测量法 荧光衍生法 荧光猝灭法 敏化荧光法 多组分混合物的荧光分析,应用,无机物：已有70种元素可分析。 鳌合物法：Be Al B Ga Se Mg 与荧光物质缔合猝

24、灭法：F S Fe Ag 催化荧光法：Cu Be Fe Os H2O2 有机物： 简单有机物与其他有机试剂作用后产生荧光 芳族通常可直接测定,8.2.4 磷光的测定方法,低温磷光分析,由于激发三重态寿命长，激发态分子发生非辐射去活化过程、与周围溶剂分子间发生碰撞和能量转移过程，或发生某些光化学反应的几率增大，这些都将使磷光强度减弱，甚至完全消失。为减少这些去活化过程的影响，通常在低温测量磷光。,低温磷光分析中，液氮是最常用的冷却剂。因此要求所使用的溶剂，在液氮温度（77K）下具有足够的粘度并能形成透明的刚性玻璃体，对分析试样具有良好的溶解特性。溶剂应在所研究的光谱区域内没有很强的吸收和发射。

25、试样的刚性可减少荧光的碰撞猝灭，磷光强。,室温磷光分析,由于低温磷光需要低温实验装置，溶剂选择的限制及操作繁琐等因素，从而发展了多种室温磷光法（RTP）。 但是室温下，T1态分子与溶剂碰撞失活，很难产生磷光。除了分子的结构要求外，实验条件非常苛刻,尤其是除氧。,室温下测量吸附于固体基质上的有机化合物的磷光。所用的基质种类较多，有纤维素载体（如滤纸、玻璃纤维）、无机载体（如硅胶、氧化铝）以及有机载体（如乙酸钠、聚合物、纤维素膜）等。 理想的载体能将分析物质牢固地束缚在表面或基质中以增加其刚性，并能减小三重态的碰撞猝灭等非辐射去活化过程，而本身又不产生磷光背景。,1. 固体基质表面室温磷光（SS-

26、RTP),当溶液中表面活性剂的浓度达到临界胶束浓度后，便相互聚集形成胶束。由于这种胶束的多相性，改变了磷光团的微环境和定向约束力，从而强烈影响了磷光团的物理性质，减小了非辐射去活化过程的趋势，明显增加了三重态的稳定性，从而实现在溶液中测量室温磷光。利用胶束稳定因素、结合重原子效应、并对溶液除氧，是MS-RTP的三个要素。,2. 胶束增稳室温磷光法（MS-RTP）,分析物质被激发后经过系间跨越衰减至最低激发三重态，当有某种合适的能量受体存在时，发生了由分析物质到受体的三重态能量转移，最后通过测量受体所发射的磷光强度而间接测定该分析物质。 在这种方法中，分析物质本身不发磷光，而是引发受体发磷光。,

27、3. 敏化室温磷光分析（S-RTP）,含重原子的溶剂，由于重原子的高核电荷增大了S0T1吸收跃迁和S1T1系间跨越跃迁的几率，有利于磷光的发生和增大磷光的量子产率。这种作用称为外部重原子效应。 分子中引入重原子取代基，会发生内部重原子效应，导致磷光量子效率的提高。,重原子效应 heavy-atom effect,引入重原子,荧光增强吗?,荧光对微环境敏感，用于表征研究体系的理化性质，并可用于物质的定性或定量分析。定性分析：依据不同结构的物质所发射的荧光波长不同；定量分析：同种物质的稀溶液，其产生的荧光强度与浓度呈线性关系。,8.2.5 荧光/磷光分析法的应用,灵敏度高、选择性好，可用于痕量分析

28、，但是能发生荧光的化学体系不多。在有机化合物中应用较广。芳香化合物多能发生荧光，可直接测定。脂肪族化合物往往与荧光试剂作用后才可产生荧光。无机物已有70种元素可分析。通过与荧光试剂作用生成荧光螯合物而进行荧光分析，荧光试剂具有两个（或以上）与MZ+形成螯合物的电子给体官能团结构。非过渡金属离子的荧光螯合物较多。,荧光法的应用,低温法:多环芳烃, VK, VB6, VE,固表法: 多环芳烃, 杂环化合物,与荧光法互补，主要用于测定有机化合物，如石油产品、多环芳烃、农药、药物、临床、环境分析等方面。Stokes位移大，干扰小。,磷光法的应用,8.3 化学发光Chemiluminescence (C

29、L),生物体化学发光现象的研究起源于古代，但是直到十九世纪末，这种现象与简单的有机反应相联系才得到解释。许多有机反应可产生CL。,1877年 洛粉碱CL1905年 洛粉碱类似物1928年 鲁米诺(luminol)1935年 光泽精(lucigenin),8.3.1 概述,特点： 灵敏度高。 鲁米诺体系测定Cr3+等, 检测限10-9 g/L. 线性范围宽：56个数量级。 设备简单：无光源，无需单色器，测发光总量。 快速。用于痕量元素、环境检测、生物医学分析。,8.3.2 原理,化学发光(CL)是利用化学反应的能量把体系中共存的某种分子从基态激发到激发态而产生发光的现象。,8.3.3.1 气相化

30、学发光,波长范围600875nm. 检测限1ng/ml。可用于测NO或O3，可间接测定NO2 和NH3 ,测量汽车尾气中NOx,8.3.3 化学发光反应的分类,1. 臭氧的化学发光反应2. 氮氧化合物化学发光,3. 利用氧原子的化学发光反应4. 火焰化学发光,8.3.3.2 液相化学发光,最常用鲁米诺(3-氨基苯二甲酰肼)体系,max=425nm可检测10-9 mol/L 的H2O2过渡金属离子可催化此反应, 发光大大增强。可测量多种金属离子。,直接化学发光A + B C* + DC* C + h例: NO + O3 NO2* + O2 NO2* NO2 + h,间接化学反应发光 A + B C* + D C* + E E* + C E* E + h,例:,分子发光分析法教学要求,掌握分子荧光、磷光和化学发光的产生机理；掌握激发光谱和发射光谱特征。 掌握荧光与分子结构的关系以及溶液的荧光（磷光）强度影响因素。 了解荧光（磷光）分析法的特点及定量测定方法。 了解荧光、磷光和化学发光分析仪器的结构。,作业：P232 第1，3，5，6，7，8题,