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1、.,1,2008年诺贝尔化学奖,下村修现年80岁的下村修1928年出生于日本京都府，1960年获得名古屋大学理学博士学位后赴美，先后在美国普林斯顿大学、波士顿大学和伍兹霍尔海洋生物实验所工作。他1962年从一种水母中发现了荧光蛋白，被誉为生物发光研究第一人。,马丁沙尔菲马丁沙尔菲出生于1947年，现年61岁，是美国哥伦比亚大学生物学教授。他获奖的主要贡献在于向人们展示了绿色荧光蛋白作为发光的遗传标签的作用，这一技术被广泛运用于生理学和医学等领域。,瑞典皇家科学院8日宣布，美籍华裔科学家钱永健、美国生物学家马丁沙尔菲和日本有机化学家兼海洋生物学家下村修共同获得2008年度诺贝尔化学奖，将均分10
2、00万瑞典克朗（约合140万美元）奖金。帮助他们获奖的是绿色荧光蛋白。这种蛋白为生物与医学实验带来革命，它发出的荧光像一盏明灯，帮助研究人员照亮生命体在分子层面和细胞层面的诸多反应。,由于绿色荧光蛋白用紫外线一照就发出鲜艳绿光，研究人员将绿色荧光蛋白基因插入动物、细菌或其他细胞的遗传信息之中，让其随着这些需要跟踪的细胞复制，可“照亮”不断长大的癌症肿瘤、跟踪阿尔茨海默氏症对大脑造成的损害、观察有害细菌的生长，或是探究老鼠胚胎中的胰腺如何产生分泌胰岛素的细胞。,.,2,.,3,用荧光抗体染色之原生动物,澳大利亚科学家最新发现，一种叫“螳螂虾”的海里动物通过发出色彩鲜艳的荧光来恐吓警告敌对者或者吸
3、引性配偶，,.,4,K. Brejc et.al., PNAS 94 (1997) 2306,green-fluorescent protein (GFP),.,5,第五章 荧光分析法,第一节 荧光分析法的基本原理第二节 荧光定量分析方法第三节 荧光分光光度计,.,6,某些物质受到光照射，除吸收某种波长的光之外，发射出比原来所吸收光的波长更长的光光致发光（二级光）。,光致发光,荧光分析法是根据物质的荧光谱线的位置及其强度进行物质鉴定和含量测定的仪器方法。,.,7,分子荧光分析的特点：,灵敏度高：一般紫外一可见分光光度法的检出限约为10-7g/ml，而荧光分析法的检出限可达到10-10甚至10-
4、12 g/ml。选择性好线性范围宽应用范围窄,.,8,第一节 荧光分析法的基本原理,1. 分子荧光的产生,一、分子荧光 molecular fluorescence,分子能级比原子能级复杂在分子体系中，每个电子能级上都存在振动、转动能级室温下大多数分子处于基态的最低振动能层,在基态时，含有偶数个电子的分子，电子的ms为+1/2和-1/2, s=0，M=1。则该分子所处的电子能态称为基态单重态,用符号S0表示,.,9,分子吸收辐射后,电子被激发且不发生自旋方向的改变ms为+1/2和-1/2, s=0，M=1。则该分子所处的电子能态称为激发单重态,用符号S表示。 （S1 S2 S3）,电子被激发且
5、伴随着自旋方向的改变ms为+1/2和+1/2, s=1，M=3。则该分子所处的电子能态称为激发三重态,用符号T表示。（T1 T2 T3）,S0,.,10,小结：分子能级与跃迁 基态(S0)激发态：吸收特定频率的辐射；量子化；跃迁 一次到位； 激发态基态：多种途径和方式(见能级图)；速度最快、激发态寿命最短的途径占优势，发生的几率大； 第一、第二、电子激发单重态 S1 、S2 ； 第一、第二、电子激发三重态 T1 、 T2 ；,电子能级的多重性 M=2S+1,平行自旋比成对自旋稳定(洪特规则)，三重态能级比相应单重态能级低； 大多数有机分子的基态处于单重态；,.,11,S0S1、S2 允许跃迁；
6、S0T1、T2 禁阻跃迁；通过其他途径进入(见能级图)；进入的几率小；,小结：激发单重态与激发三重态的不同 激发单重态分子中没有净电子自旋，因而具有反磁性；激发三重态有2个自旋平行电子，是顺磁性的 激发单重态分子平均寿命短（10-810-6s），而激发三重态的长（10-410s） 基态单重态到激发单重态的激发，不涉及电子自旋方向的改变而容易发生，属于允许跃迁；而到激发三重态属于禁阻跃迁,.,13,激发态基态的能量传递途径,电子处于激发态是不稳定状态，返回基态时，通过辐射跃迁(发光)和无辐射跃迁等方式失去能量；,荧光：10-710-9s，第一激发单重态的最低振动能级基态磷光：10-410s； 第
7、一激发三重态的最低振动能级基态,.,14,辐射和非辐射能量传递过程,振动弛豫：同一电子能级中，以热能量交换形式由高振动能层至低相邻振动能层间的跃迁。发生振动弛豫的时间10-12s,内转换：相同多重态的电子能级间的等能级的无辐射跃迁。 通过内转换和振动弛豫，高激发单重态的电子跃回第一激发单重态的最低振动能级。发生内转换的时间10-13s。,荧光发射：电子由第一激发单重态的最低振动能层基态( 荧光多为 S1 S0跃迁)，发射波长为 3的荧光，10-710-9s 。 发射荧光的能量比分子吸收的能量小，波长长： 3 2 1 ；,系间跨越：激发态的电子发生自旋反转而使分子的多重性发生变化的非辐射跃迁。
8、禁阻跃迁，但当能层有较大重叠时S1T1 就可发生系间跨越，通过自旋轨道耦合进行。 10-6s,外转换：激发态分子与溶剂或其他溶质分子之间碰撞引起的转移能量的非辐射跃迁。常发生在S1或 T1 S0 外转换使荧光或磷光减弱或“猝灭”。,磷光发射：电子由第一激发三重态的最低振动能级基态(T1 S0跃迁)；发光速度很慢： 10-4100s、磷光的能量比荧光小 电子由S0进入T1的过程：（ S0 T1禁阻跃迁） S0激发振动弛豫内转移系间跨越振动弛豫 T1 光照停止后，可持续一段时间,.,16,2. 荧光的激发光谱与荧光光谱excitation spectrum and fluorescence spe
9、ctrum,（1）荧光的激发光谱,激发光谱：表示不同激发波长下所引起物质发射某一波长荧光的相对效率。,绘制激发光谱：固定发射波长(选最大发射波长),然后以不同波长的入射光激发荧光物质，以荧光强度F对激发波长作图，即为激发光谱。,荧光分子都具有两个特征光谱：激发光谱和发射光谱（荧光光谱）。,激发光谱曲线的最高处，处于激发态的分子最多，荧光强度最大，称为最大激发波长 ex,（2）荧光的发射光谱（荧光光谱）,荧光光谱表示在所发射的荧光中各种波长组分的相对强度。绘制发射光谱时， 使激发光波长固定在ex处，然后对发射光谱扫描，测定各种波长下相应的荧光强度，以荧光强度F 对发射波长作图，得发射光谱图（即荧
10、光光谱）。,发射光谱（荧光光谱）的位置？磷光光谱的位置？,.,19,激发光谱与发射光谱的关系,a. Stokes位移 荧光光谱总是位于物质激发光谱的长波一侧，即荧光波长大于激发光波长的现象。 激发光谱与发射光谱之间的波长差值： 振动弛豫、外转换等无辐射跃迁损失了部分能量。,b. 荧光光谱的形状与激发波长无关 电子可以跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能量(如能级图 2 、 1)，产生不同吸收带，但荧光光谱却只有一个发射态，如 3 。 为什么？,.,20,c. 镜像规则 由于电子基态的振动能级分布与激发态相似，故通常荧光光谱与它的激发光谱成镜像对称关系。,各小峰波长递减值与振动能级差有关，各小
11、峰的高度与跃迁几率有关。,基态上的各振动能级分布与第一激发态上的各振动能级分布类似；,基态上的某振动能级若跃迁到第一激发态的某振动能级的几率较大的话，相反跃迁也如此。,.,22,二、荧光的产生与分子结构的关系 relation between fluorescence and molecular structure,1.分子产生荧光必须具备的条件（1）具有合适的结构；（2）具有一定的荧光量子产率。 荧光量子产率（）：,物质的荧光量子产率范围一般是多少?,如果一个分子将吸收的光子全部释放，则其量子产率为100%。,.,23,2.有机化合物的分子结构与荧光的关系,（1）跃迁类型：* 的荧光效率高，
12、系间跨越过程的速率常数小，有利于荧光的产生；（2）共轭效应：提高共轭度有利于增加荧光效率并产生红移,（4）取代基效应：芳环上有供电子基，使荧光增强。,（3）刚性平面结构：可降低分子振动，减少与溶剂的相互作用，故具有很强的荧光。如荧光素和酚酞有相似结构，荧光素有很强的荧光，酚酞却没有。,.,24,.,25,三、影响荧光强度的因素 relation between fluorescence and molecular structure,影响荧光强度的外部因素1.溶剂的影响 同一物质在不同溶剂中，其荧光光谱的形状和强度都有差别。一般情况下，荧光波长随着溶剂极性的增大而长移，荧光强度也有所增强。这是
13、因为在极性溶剂中，*跃迁所需的能量差E小，而且跃迁几率增加，从而使紫外吸收波长和荧光波长均长移，强度也增强。 溶剂粘度减小时，可以增加分子间碰撞机会，使无辐射跃迁增加而荧光减弱。故荧光强度随溶剂粘度的减小而减弱。由于温度对溶剂的粘度有影响，一般是温度上升，溶剂粘度变小，因此温度上升，荧光强度下降。,.,26,2.温度的影响 荧光强度对温度变化敏感，温度增加，分子运动速度加快，分子间碰撞的几率增加，外转换去活的几率增加，荧光效率降低。例如荧光素钠的乙醇溶液，在0以下，温度每降低10， f增加3，在80时， f为1。,.,27,当荧光物质本身是弱酸或弱碱时，溶液的pH值对该荧光物质的荧光强度有较大
14、影响，这主要是因为在不同酸度中分子和离子间的平衡改变，离子结构发生变化，因此荧光强度也有差异。每一种荧光物质都有它最适宜的发射荧光的存在形式，也就是有它最适宜的pH值范围。例如苯胺在不同pH值下有下列平衡关系：苯胺在pH712的溶液中主要以分子形式存在，由于NH2为提高荧光效率的取代基，故苯胺分子会发生蓝色荧光。但在pH2和pH13的溶液中均以苯胺离子形式存在，故不能发射荧光。,3. 溶液pH 对酸碱化合物，溶液pH的影响较大，需要严格控制；,.,28,4.内滤光作用和自吸现象,自吸现象：化合物的荧光发射光谱的短波长端与其吸收 光谱的长波长端重叠，产生自吸收；如蒽化合物。,内滤光作用：溶液中含
15、有能吸收激发光或荧光物质发 射的荧光，如色胺酸中的重铬酸钾；,.,29,5.荧光熄灭剂,荧光熄灭是指荧光物质分子与溶剂分子或溶质分子相互作用引起荧光强度降低的现象。引起荧光熄灭的物质称为荧光熄灭剂(quenching medium)。如卤素离子、重金属离子、氧分子以及硝基化合物、重氮化合物、羰基和羧基化合物均为常见的荧光熄灭剂。,.,30,6、散射光,小部分光子和物质分子相碰撞，使光子的运动方向发生改变而向不同角度散射。,瑞利光：光子和物质发生弹性碰撞，不发生能量交换，只是光子运动方向发生改变。其波长与入射光波长相同。,拉曼光：光子和物质发生弹性碰撞，发生能量交换，光子把部分能量转移给物质分子
16、或从物质分子获得部分能量。从而发射出比入射光稍长或稍短的光。,散射光对荧光测定有干扰，尤其是波长比入射光波长更长的拉曼光，与荧光波长接近，对测定的干扰大，必须采取措施消除。拉曼光的干扰主要来自溶剂，当溶剂的拉曼光与被测物质的荧光光谱相重叠时，应更换溶剂或改变激发光波长,.,31,选择适当的激发波长可消除拉曼光的干扰,a:320nm或350nm为激发光，荧光峰总是在448nm。 b:将空白溶剂分别在320nm及350nm激发光照射下测定荧光，激发光波长为320nm时，拉曼光波长是360nm，360nm的拉曼光对荧光无影响；当激发光波长为350nm时，拉曼光波长是400nm，400nm的拉曼光对荧
17、光有干扰，因而影响测定结果。,硫酸奎宁在不同波长激发下的荧光与散射光谱,.,32,四、荧光试剂,荧光试剂是一种可以使非荧光物质或弱荧光物质与其反应之后，得到强荧光性产物的标记物，从而可扩大荧光分析法的使用范围,1.有机化合物的荧光分析,脂肪族化合物能产生荧光的为数不多。芳香族及具有芳香结构的化合物，因存在共轭体系而容易吸收光能，在紫外光照射下很多能发射荧光。有时为了提高测定的灵敏度和选择性，常使弱荧光性物质与某些荧光试剂作用，以得到强荧光性产物(衍生化)。因此，荧光分析法在有机物测定方面的应用很广。,.,33,能用荧光分析法测定的有机物包括多环胺类、萘酚类、嘌呤类、吲哚类、多环芳烃类、具有芳环
18、或芳杂环结构的氨基酸类及蛋白质等；药物中的生物碱类如麦角碱、蛇根碱、麻黄碱、吗啡、喹啉类及异喹啉类生物碱等；甾体类如皮质激素及雌醇等；抗生素类如青霉素、四环素等；维生素类如维生素A、B1、B2、B6、B12、E、抗坏血酸、叶酸及烟酰胺等。此外，中草药中的许多有效成分，不少是属于芳香性结构的大分子杂环类，都能产生荧光，可用荧光分析法作初步鉴别及含量测定。荧光分析法的灵敏度高，选择性较好，取样量少，方法快速，已成为医药学、生物学、农业和工业等领域进行科学研究工作的重要手段之一。以下是几个重要的荧光试剂：,1荧光胺(fluorescamine)：能与脂肪族或芳香族伯胺类形成高度荧光衍生物，典型反应如
19、下：,荧光胺及其水解产物不显荧光。100mg荧光胺溶于100ml无水丙酮中，放置24小时后即可使用。取相当于10mg药物的甲醇或水溶液0.lml，加适宜pH值的磷酸缓冲溶液5ml，加荧光胺试剂0.lml，混合，放置15分钟后测定荧光强度。荧光条件为：ex=275、390nm，em=480nm。,.,35,2邻苯二甲醛(OPA) 在2巯基乙醇存在下，pH910的缓冲溶液中OPA能与伯胺类、特别是除半胱氨酸、脯氨酸及羟脯氨酸外的a氨基酸生成灵敏的荧光产物。取OPA 500mg溶于10ml乙醇中，加200ml 2巯基乙醇，将此混合液加至1L 3的硼酸溶液中，再用KOH调节至pH10，即为常用试剂溶液
20、。荧光条件为：ex=340nm，em=455nm。,.,36,31二甲氨基5氯化磺酰萘(Dansyl-Cl，丹酰氯) 能与伯胺、仲胺及酚基的生物碱类反应生成荧光性产物。取50mg或100mg试剂，溶解于500ml无水丙酮中即可使用。与丹酰氯类似的一个试剂是丹酰肼(DansylNHNH2)，它能与可的松的羰基缩合，产生强烈荧光。荧光条件为：ex=365nm，em=500nm左右。 丹酰氯试剂不稳定，其水解产物DansylOH呈蓝色荧光，必须暗处保存，每周重新配制。,.,37,2.生物与有机化合物的分析,.,38,无机离子一般不显荧光，与有机试剂形成有荧光的配合物后，可测量约60种元素及离子 铍、
21、铝、硼、镓、硒、镁、稀土采用荧光分析法 氟、硫、铁、银、钴、镍采用荧光熄灭法测定 铜、铁、钴、锇及过氧化氢采用催化荧光法测定 铬、铌、铀、碲采用低温荧光法测定 铈、铕、锑、钒、铀采用固体荧光法测定,2.无机化合物的分析,.,39,第二节 荧光定量分析方法,一、荧光强度与物质浓度的关系,当一束强度为I0的紫外/可见光照射一浓度为c、液层厚度为d的液槽时，可在溶液的各个方向观察到荧光，其,由于能产生荧光的物质占被分析物的数量相当有限，且就这少量的荧光物质几乎在同一波长段产生光致发光，所以荧光法很少用来定性分析,吸收光强度为Ia透过光强度为It荧光强度为F,垂直方向,（= I0 - It ）,荧光强
22、度正比于被荧光物质吸收的光强度Ia,F = K(I0 It),K ：取决于荧光效率f,根据Beer Law,F = K(I0 - I0 10- c l ) = KI0(1- 10- c l ) = KI0(1- e2.303 c l ),由于 ex =1+x+x2/2!+x3/3!+xn/n!,所以 e-2.3 c l =1 - 2.3cl + (-2.3cl) 2/2!+ (-2.3cl) 3/3!+,e-2.3 c l =1 - 2.3cl,e-2.3 cl =1 - 2.3cl 代入,F = KI0(1- e2.303 cl ),F = KI0(1- 1+2.3 c l ) =2.3 K
23、 I0 l c,当荧光效率f 、入射光强度I0、物质的摩尔吸收系数 、液层厚度b 均固定不变时，荧光强度正比于该溶液的浓度,F = K c,荧光定量分析的依据,荧光强度可以在很弱的背景下被检测，这完全取决于检测器的灵敏度，也是荧光分析方法灵敏度高的原因,.,42,二、定量分析方法,1.标准曲线法 配制一系列标准浓度试样，测定荧光强度，绘制F-c的标准校正曲线，再在相同条件下测量未知试样的荧光强度，在标准曲线上求出试样的浓度,2. 比较法 在线性范围内，测定标样和试样的荧光强度，比较之,空白调0，标品调100%或50%,.,43,第三节 荧光分光光度计,四个部分激发光源、样品池、双单色器系统、检
24、测器特殊点有两个单色器，光源与检测器通常成直角,单色器：选择激发光波长的第一单色器和选择发射光(测量)波长的第二单色器光源：氙灯、高压汞灯、激光器(可见与紫外区)检测器：光电倍增管,.,44,荧光光谱（fluorecence spectrum）：固定激发光波长为最大激发波长，而让荧光物质发射的荧光通过发射单色器分光扫描并检测不同波长下的荧光强度，以发射波长为横坐标，荧光强度为纵坐标作图，得到物质的荧光光谱。荧光物质的最大激发波长（ex）和最大发射波长（em）是鉴定物质的根据；也是定量测定最为灵敏的条件。,.,45,.,46,荧光光谱的普遍特性,1.斯托克斯位移(Stokes shift):,激
25、发光谱与发射光谱之间的波长差值；荧光发射波长总是大于激发光谱波长。,室温下菲的乙醇溶液荧光光谱,.,47,2.荧光光谱的形状与激发波长无关,电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能量，产生不同吸收带，但均回到第一激发单重态的最低振动能级再跃迁回到基态，从而荧光发射光谱只有一个发射带，而且荧光光谱的形状与激发波长无关。,3.荧光光谱与激发光谱的镜像关系,荧光光谱的普遍特性,激发光谱与荧光光谱成对称镜像关系。,.,48,蒽的激发光谱（虚线）荧光光谱（实线）,蒽的能级跃迁,.,49,二、荧光与分子结构,（一）荧光寿命和荧光效率,以,对t作图，斜率即为,.,50,荧光效率与物质的分子结构和所处的化学
26、环境条件有关。,.,51,（二）有机化合物分子结构与荧光的关系,物质产生荧光必须具备的条件：（1）物质的分子必须具有能够吸收紫外和较短波长可见光的结构（2）物质必须具有较大的荧光效率,.,52,1.长共轭结构（芳香族化合物） 共轭度越大，荧光效率越大，荧光波长长移,.,53,2.分子的刚性,分子刚性越强，分子振动少，与其它分子碰撞失活的机率下降，荧光量子效率提高，荧光长移。,.,54,3.取代基,给电子基团使荧光增强；荧光波长长移。吸电子基团会减弱甚至破坏荧光。同电子体系相互作用小的取代基对荧光影响不明显。,.,55,（三）荧光试剂,1.荧光胺,2.邻苯二甲醛(OPA),3.1-二甲氨基5氯化
27、磺酰萘,4.测定无机离子的荧光试剂,.,56,三、影响荧光强度的外部因素,温度增加，荧光效率和荧光强度下降。,1.温度,2.溶剂,随着溶剂的极性的增加，荧光物质的*跃迁几率增加，荧光强度将增强，荧光波长也发生红移；溶剂粘度降低，荧光强度降低。,.,57,3.酸度,具酸或碱性基团的荧光物质，在不同pH值时，其结构可能发生变化，因而荧光强度将发生改变。,利用金属离子与有机试剂生成配合物进行测定金属离子时，配合物的稳定性和组成受溶液pH值影响较大，从而影响到它们的荧光性质。,蓝色荧光,无荧光,无荧光,.,58,荧光猝灭：荧光物质分子与溶剂分子或其他溶质分子的相互作用引起荧光强度降低的现象称为荧光猝灭
28、。荧光熄灭剂：能引起荧光强度降低的物质。,4.荧光熄灭剂,碰撞猝灭 M+hvM*,M*+Q M+热静态猝灭 M+Q MQ 非荧光物质转入三重态的猝灭 三重态荧光物质的自猝灭 荧光物质浓度较高,导致荧光熄灭的原因：,.,59,荧光熄灭法: 荧光物质加入某些猝灭剂后，其荧光强度的减少与荧光猝灭剂的浓度呈线性关系，可用于测定猝灭剂的含量，这种方法称为荧光熄灭法。,5.散射光,瑞利光：光子与物质分子发生弹性碰撞，不发生能量交换，运动方向改变；瑞利光入射光,拉曼光：光子与物质分子发生非弹性碰撞，发生能量交换，运动方向改变；拉曼光入射光,.,60,a.强度,b.强度,硫酸奎宁在不同激发波长下的荧光（a）与
29、拉曼光谱（b）,.,61,在不同波长激发光下主要溶剂的拉曼光波长(nm),.,62,第二节 荧光定量分析方法,一、荧光强度与物质浓度的关系,.,63,(荧光定量分析法的依据),结论：荧光强度和溶液浓度呈线性关系，只限于极稀的溶液(A0.05)。对于较浓溶液，会产生自熄灭现象。,.,64,二、定量分析方法,优点,1.灵敏度高 比紫外-可见分光光度法高24个数量级； 检测下限：0.10.001g/mL 2.选择性强 既可依据发射光谱特征，又可根据激发光谱特征； 3.试样量少和方法简单,缺点,应用范围小,.,65,1.校正曲线法,步骤：1.配制不同浓度的标准溶液2.做FC关系曲线3.求得浓度,注意：
30、固定仪器和测定条件； 试样浓度在线性范围内,.,66,2.比例法,注意：样品与标样溶液浓度接近，在线性范围内,步骤：1.配制标准溶液和试样溶液2.测F3.求浓度,.,67,3.联立方程式法,两组分的荧光峰相互不干扰,可直接测定 分别在各自的荧波长处测定,求出它们的含量,两组分的荧光峰相互干扰,但激发光谱有显著区 别,在某一激发光下一个组分产生荧光峰,另一组分不产生荧光;选用不同的激发光进行测定,.,68,第三节 荧光分光光度计和其他荧光分析技术,用于测量荧光强度的仪器有：1.滤光片荧光计2.滤光片单色器荧光计3.荧光分光光度计,.,69,一、荧光分光光度计,1.荧光分光光度计的主要部件：光源、
31、激发单色器、发射单色器、样品池、检测系统,.,70,.,71,SK-2003A型荧光光谱仪(国内首创）,.,72,RF-5400荧光光度计,.,73,Hitachi(日立)F-2500荧光分光光度,.,74,荧光分光光度计澳大利亚,.,75,2.仪器的校正,灵敏度的校正 在选定波长及狭缝宽度的条件下，用一种稳定的荧光物质，配成浓度一致的对照品对仪器进行校正，使每次测得的荧光强度调节到相同数值（50或100）。,波长校正 汞灯的标准谱线对单色器波长刻度校正。,.,76,激发光谱和荧光光谱的校正1.单光束荧光光度计，可用仪器上附有的校正装置将每一波长的光源强度调整到一致，然后以表观光谱上每一波长的
32、强度除以检测器对每一波长的感应强度进行校正。2.双光束荧光光度计，可用参比光束抵消光学误差。,.,77,二、其他荧光分析技术简介,1.激光荧光分析,特点：激光作光源，一个单色器，用于分析超低浓度物质。,2.时间分辨荧光分析特点：利用不同物质的荧光寿命不同，在激发和检测之间延缓的时间不同，实现分别检测的目的。,.,78,3.同步荧光分析特点:选择适宜的,同时扫描激发波长和发射波长，得到同步荧光光谱；减少光谱重叠，提高分辨率；用于定量分析。,.,79,4.胶束增敏荧光分析特点：采用化学方法提高荧光效率；胶束溶液对荧光物质有增溶、增敏和增稳的作用。,.,80,无机物的荧光分析,很多金属或非金属无机离
33、子与一些有机化合物形成有荧光的配合物，测定荧光强度可以进行定量分析。常用的试剂：1. 8羟基喹啉及其衍生物：用于Al、Ga、In、Sc、La、Mg、Zn、Cd等元素的荧光测定。,2.黄酮类试剂：桑色素、黄烷醇、槲皮素用于、族元素的荧光测定3.二氨基化合物：用于测定Se,.,81,Al的测定方法：将大约40 mL不含硝酸根的弱酸性试液，加入10mL 8羟基喹啉溶液振荡2min，加入氨水调节到pH811，再用力振荡30s，水相以每次4mL氯仿洗涤二次。合并萃取液并以氯仿稀释至20mL,再加入Na2SO4。然后在荧光分光光度计上测定，激发波长365nm、发射波长560nm。,.,82,有机物的荧光分
34、析,芳香族及具有芳香结构的有机化合物在紫外光照射下大多数能产生荧光，某些弱荧光物质可与荧光剂作用生成强荧光物质。,1.油脂苯并（a）芘测定：油样经提取、浓缩、纯化后进行荧光测定，ex 386nm、em406nm。2.尿中N1甲基尼克酰胺的测定：尿液经纯化、碱处理和酮缩合成为带有黄色荧光的衍生物，在酸性溶液中加热变成稳定而产生强蓝色荧光的物质,ex 355nm、em430nm 。,.,83,3.1-2-甲氨基5氯化磺酰萘(Dansyl-Cl ,DNS-ce 丹酰氯）用于氨基酸的荧光测定：DNS-Cl是一种荧光试剂，DNS-C1能与所有的氨基酸生成具荧光的衍生物，在碱性条件下与氨基酸(肽或蛋白质)
35、的氨基结合成带有荧光的DNS-氨基酸(DNS-肽或DNS-蛋白质) ，DNS-氨基酸在紫外光照射下呈现黄色荧光 。,.,84,核酸分子荧光探针,遗传物质的脱氧核糖酸 (DNA), 自身的荧光效率很低，一般条件下几乎检测不到DNA的荧光，因此，常选用某些荧光分子作为探针，通过探针标记分子的荧光变化来研究 DNA 与小分子及药物的作用机理，从而探讨致病原因及筛选和设计新的高效低毒药物。目前,典型的荧光探针分子为溴化乙锭，此外也使用钉的配合物等。在基因检测方面，已逐步使用荧光染料作为标记物来代替同位素标记，从而克服了同位素标记物产生的污染,价格昂贵及难保存等的不足。,.,85,DNA序列分析中的荧光
36、染料：在电泳分离荧光法检测DNA序列分析中，通常分四组（A,C,G,T体系）进行，如果用四种不同的荧光染料为探针,标记一个共同的引物，分别用在A,C,G,T四个反应体系中，等于用不同的探针专一地标记了不同的碱基，利用各荧光探针光谱的差别便可把不同的碱基区分开，因此选择一组四种合适的染料成为关键。,.,86,荧光染料应满足以下条件：1.吸收和发射光谱应在可见光区，以降低散射和荧光背景；2.各染料的荧光发射波长应该有明显不同，以便区分不同染料;3.应有很强的荧光强度，以获得高灵敏度；4.不严重干扰引物的杂交作用，使其不影响测序反应效率；5.染料的存在不严重改变电泳谱图。,.,87,1.分子荧光分析
37、中，含有重原子如碘、溴的分子易发生： ( )A 振动弛豫B 内部转换C 体系间跨跃D 荧光发射答案：C2.在下列的四种说法中，哪一种是不正确的（）A分子荧光发射光谱通常与吸收光谱互为镜像关系；B分子荧光发射光谱与激发波长没有关系；C分子荧光发射光谱s随激发波长不同而变化；D分子荧光发射的强度与激发光的强度成正比的关系。答案：C,.,88,3. 荧光计与分光光度计的主要不同是什么？磷光计与荧光计的主要差别是什么？( )A光路设计不同；光路设计不同；B光路设计不同；磷光计比荧光计多装有液氮的杜瓦瓶及斩波器；C检测器不同；磷光计比荧光计多装有液氮的杜瓦瓶及斩波器D检测器不同；光路设计不同答案：B4.下列说法正确的是 ( )A 分子的刚性平面有利于荧光的产生B 磷光辐射的波长比荧光短C 磷光比荧光的寿命短D 荧光猝灭是指荧光完全消失答案：A,
