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1、第八章 荧光免疫技术,目录,返回总目录,第一节 概述,一、荧光的基本知识,某些物质受到一定波长光的激发后会发射荧光（fluorescence）。不同的荧光物质具有不同的发射光谱、激发光谱和荧光寿命。,（一）荧光技术中有关的概念和参数,荧光：某些物质受到一定波长光的激发后跃迁到激发态，当其在极短时间内回复至基态发射出的波长大于激发光波长的光。,发射光谱：指固定激发波长，在不同波长下记录到的样品所发射的荧光强度。,激发光谱：指固定检测发射波长，用不同波长的激发光激发样品所记录到的相应的荧光发射强度。 Stokes位移：荧光物质从激发态回到基态过程中，部分能量丢失，发射光波长比激发光波长长。 荧光效
2、率：荧光物质将吸收的光能转变成荧光的百分率。,吸收光的光量子数（激发光强度）,荧光寿命：指荧光物质被激发后所产生的荧光衰减到一定程度时所用的时间。 荧光的淬灭：荧光物质在某些理化因素或受到激发光较长时间的照射作用，会发生发射荧光减弱甚至消退的现象。 荧光偏振： 当P=0时，表明完全不偏振；P在-1至+1之间为部分偏振。,（二）影响荧光的因素,H温度荧光素的浓度试剂中杂质细胞固定剂,（三） 荧光物质,1. 荧光色素：FITC、RB200、TRITC、PE、ECD、PeCy5、PeCy7、APC、PI。2. 镧系螯合物 ：Eu3+ 等。,表8-1 常用荧光物质的荧光特点,FITC,TRITC,二、
3、荧光抗体的制备,（一）荧光素标记物的制备,1. 抗体的要求：抗体应具有高特异性、高纯度和高亲和力，经纯化后标记。2. 荧光素要求：结合后不易解离，而未结合的易于去除，结合后仍保持较高的荧光效率和不影响蛋白质原有的生化与免疫性质，荧光色泽与背景色泽对比鲜明，结合物稳定，安全无毒，易于保存。,3. 荧光素标记抗体的方法：见表8-2。,(1)去除游离荧光素及其降解产物：透析或凝胶过滤;(2)去除荧光素未结合和结合过度的抗体：阴离子交换层析法;(3)去除交叉反应或非期望抗体：动物肝粉吸收或固相抗原吸收。,4. 荧光素标记抗体的纯化,荧光素与蛋白结合率、抗体效价、抗体特异性、抗体抗体特异性染色滴度。,加
4、入0.1%NaN3或0.01%硫柳汞防腐，避免反复冻融，-20冻存可保存12年，真空干燥后可长期保存。稀释后的抗体不宜长时间保存。,5. 荧光素标记抗体的鉴定,6. 荧光记抗体的保存,（二）镧系元素标记物的制备,1.镧系元素标记物：铕（Eu3+）、钐（Sm3+）、 铽（Tb3+）、钕（Nd3+）和镝（Dy3+）。 2.标记方法：一步法、二步法。,三、荧光免疫技术的原理及类型,用荧光物质标记抗体或抗原，让其与相应抗原或抗体结合后，借荧光检测仪检测抗原抗体复合物中特异性荧光的存在情况及其存在的部位和强度，以判断抗原或抗体存在的位置、分布和含量。,（一）荧光免疫显微技术：用荧光素标记抗体与组织切片或
5、细胞表面的抗原反应，洗涤除去游离的荧光抗体后，在荧光显微镜下直接观察特异性荧光。（二）荧光免疫测定技术：以荧光物质标记抗体或抗原，与相应抗原或抗体结合，用荧光检测仪检测抗原抗体复合物中特异性荧光强度，对固体或液体标本中微量物质定量测定。,返回章目录,技术类型,第二节 荧光免疫显微技术,以荧光显微镜为检测工具，用荧光素标记抗体或抗抗体，检测组织切片中的细胞抗原或血清中的抗体，观察特异性荧光，用于样本的定性和定位检查。,一、标本的制作,1.抗原在染色、洗涤和封埋过程中应保持抗原的完整性。2.标本切片要求薄。3.常见的临床标本有组织、细胞和细菌三大类，可制作成涂片、印片或切片。 4.除活细胞外，其他
6、标本片应固定。,（一）直接法,二、荧光抗体染色的技术类型,（二）间接法,（1）抗原间接定位法,荧光标记的第二抗体 （二抗）,组织中的抗原,第一抗体（一抗）,（2）抗体间接定位法,荧光标记抗体,组织中的抗体,抗原,用两种荧光素分别标记两种不同的特异性抗体，对同一标本进行荧光染色，洗涤后在荧光显微镜下用两种不同的激发光激发，若有两种抗原存在，可显示两种颜色的荧光。,（三）双标记法,（1）直接法,三、荧光显微镜,表8-3 不同荧光免疫显微技术的比较,阳性细胞显色有均质型、核膜型、斑点型核仁型，显色深浅可作为抗原定性、定位和定量依据。 “-”为无或仅见极微弱荧光； “+”为荧光较弱但清楚可见； “2+
7、”为荧光明亮； “3+”为耀眼的强荧光。“2+”以上判定为阳性，对照光应呈“-”或“”。,结果判定,注意事项,标本应新鲜，立即处理或及时冷藏，力求保持抗原性和组织细胞结构完整。 陈旧标本的自身荧光和非特异性吸附的荧光将会增强，影响荧光免疫检测结果和灵敏度。,1.血清中自身抗体的检测；2.病原体快速鉴定及血清中抗体检测；3.免疫病理组织中免疫球蛋白、补体和抗原抗体复合物的检测；4.恶性肿瘤组织中肿瘤特异性抗原的鉴定；5.细胞表面抗原和受体检测；6.鉴定和计数T、B细胞及其亚群。,返回章目录,临床应用,用激光作扫描光源，逐点、逐行、逐面快速扫描成像，扫描的激光与荧光收集共用一个物镜，物镜的焦点即扫
8、描激光的聚焦点，也是瞬时成像的物点。,第三节 共聚焦显微技术,一、CLSM的工作原理,激光束经照明针孔形成点光源，对标本内焦平面上的每一点扫描，标本上的被照射点，在探测针孔处成像，由探测针孔后的光电倍增管逐点或逐线接收，迅速在计算机监视器屏幕上形成荧光图像。,二、CLSM的参数,仪器的参数有：物镜；激光功率；激光扫描程度；探测针孔；光电倍增管；扫描速度；重复扫描次数。,三、共聚焦显微镜的优点,CLSM具有图像静态采集和动态扫描功能。1. 高分辨率； 2断层扫描； 3共扼显像； 4微分干涉成像； 5三维重建； 6荧光的半定量和绝对定量。,四、CLSM的临床应用,共聚焦显微镜在生物医学中具有广泛的
9、应用细胞器的研究；细胞间通讯的研究；用于分层扫描、三维重建生物结构的分析；免疫荧光定量、定位测定；细胞内离子测定；细胞膜流动性分析。,1.激光扫描共聚焦显微镜观察：两种荧光素标记抗体，显示含有不同成分的两种细胞在同一区域的定位模式。,2.激光扫描共聚焦显微镜观察：不同的荧光素标记两种抗体，定位同一细胞内存在的两种不同成分。,返回章目录,第四节 荧光免疫测定技术,荧光抗体技术,荧光免疫测定,非均相荧光免疫测定,荧光免疫技术是将抗原抗体反应的特异性与荧光技术的敏感性相结合，对抗原或抗体进行定性、定位或定量检测。,时间分辨荧光免疫测定,荧光酶免疫测定,-荧光偏振免疫测定,荧光免疫技术,均相荧光免疫测
10、定,根据荧光素标记抗原与其抗原抗体复合物之间荧光偏振程度的差异，测定液体中小分子物质的含量。,一、荧光偏振免疫测定,荧光偏振免疫测定原理示意图,返回章目录,第五节 免疫芯片技术,一、免疫芯片的检测原理,将几个、几十个，甚至几万个或更高数量的抗原(或抗体)高密度排列在固相载体上，形成高密度抗原或抗体微点阵的免疫芯片，与少量待检样品或生物标本同时进行特异性免疫反应，可一次获得芯片中所有已知抗原(或抗体)的检测结果。,免疫芯片的检测原理图,1.芯片阵列项目要求合理组合2.设计阵列组合中的抗体要配齐，有阵列抗体库3.微阵列点样制备系统将抗体或抗原固化4.所有抗原抗体集中在同一张芯片的微细结构内反应5.
11、用同位素、荧光、化学发光、酶的成色反应等显示结果，通过扫描仪或CCD摄像技术记录和计算机软件分析综合成可读的生物样品信息,二、免疫芯片的关键技术,三、免疫芯片的分类,1. 根据载体分为 平板芯片（或固相芯片）、微球芯片（或液体芯片）；2. 根据实验原理分为 双抗体夹心法免疫芯片、间接法免疫芯片、竞争法免疫芯片、免疫-PCR 芯片；3. 根据检测方法分为 酶标法免疫芯片、放射性同位素法免疫芯片、荧光法免疫芯片、金标法免疫芯片以及生物素、抗生物素蛋白法免疫芯片、细胞免疫芯片。,一种免疫芯片与流式细胞术相结合的新技术。将微小的乳胶颗粒（5.6um）用荧光染色的方法进行编码，每种颜色的微粒代表一种检测
12、标志物，把针对不同检测物的彩色编码微粒混合后加入微量病人标本，在悬液中靶分子与微粒进行特异性地结合，通过激光流式仪判定后由电脑以数据信息的形式记录下来。,1.液体芯片,用于研究抗体的芯片，芯片上排列着多种已知单克隆抗体，其对应的抗原都是细胞结构和功能上重要的蛋白质，涉及信号传导、肿瘤、细胞周期调控、细胞结构、细胞凋亡和神经生物学等领域。通过一张芯片，能比较几百种蛋白质的表达变化。,2.抗体芯片,抗体芯片的整个操作流程图,抗体芯片检测多种蛋白质的表达情况,以细胞为研究对象, 利用免疫学原理和微型化操作方法, 实现对细胞样品的快速检测和分析。利用细胞表面抗原与抗体特异性结合原理，通过抗体微阵列和细
13、胞悬液样品的反应，捕获待测目的细胞，结合在不同抗体点上的细胞代表了不同的细胞免疫表型。,3.细胞免疫芯片,四、免疫芯片的应用,肿瘤标记物的检测感染性疾病的检测心血管疾病和自身免疫性疾病的检测细胞膜表面抗原的检测细胞因子的检测兴奋剂的检查,返回章目录,荧光免疫技术：是将抗原抗体反应的特异性与荧光技术的敏感性结合，对抗原定性、定位或定量检测。荧光抗体技术：荧光素标记抗体与抗原反应, 在荧光显微镜下观察呈现特异荧光的抗原抗体复合物,分为直接法、间接法和双标记法等。免疫芯片技术：将较多数量的抗原(或抗体)高密度排列在固相载体上，形成微点阵的免疫芯片，与少量待检样品同时进行特异性免疫反应，可一次获得芯片中所有已知抗原(或抗体)的检测结果。,小 结,返回章目录,THANK YOU FOR YOUR ATTENTION!,返回总目录,
