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1、1,第十一章 化学发光和荧光免疫技术及仪器,2,第一节 化学发光免疫分析技术第二节电化学发光免疫分析第三节时间分辨荧光免疫分析法第四节荧光偏振免疫分析法第五节化学发光免疫分析的临床应用,内容概述:,3,教学目标和要求 掌握化学发光免疫分析技术的基本原理、反应的底物和标记方法以及反应类型。熟悉电化学发光免疫分析的基本原理和标记物，时间分辨荧光免疫分析法的基本原理及其标记物和螯合物。了解荧光偏振免疫分析法的基本原理和技术特点，化学发光免疫分析的临床应用,4,第一节 化学发光免疫分析技术,基本原理反应的底物标记方法反应类型相关仪器,5,一、基本原理,化学发光，是指伴随化学反应过程所产生的发光的发射现
2、象。某些物质在进行化学反应时，吸收了反应过程中所产生的化学能，使反应物分子形成电子激发态，当电子从激发态返回到稳定的基态时，多余的能量就以光子的形式发射出来。这一现象称为化学发光。,A+B C*+D,C*C+h,6,(一)产生化学发光反应的条件和过程,化学发光与荧光的区别:,化学能 光能,化学发光反应的条件:,反应必须提供足够的激发能焓变(H)介于170300 kjmol-1 之间，才能在可见光范围观察到化学发光现象,吸收了化学能后处于激发态的分子或原子，必须以光子形式将能量释放出来，或者将能量转移到另一种物质的分子上并使该分子激发，当被激发的分子回到基态时，也以光子的形式释放能量,7,(二)
3、化学发光效率,化学发光反应的发光效率(Cl)又称为化学发光总能量的产生率,Cl取决于生成激发态产物分子的化学激发效率(CE)和激发态产物分子的发射效率(EM)。,一般化学发光反应，Cl值约为10-6,8,(三)强度与反应物质浓度之间的关系,反应物的浓度,反应速度,化学发光反应所发出的光的强度,9,(四)化学发光的反应类型,直接化学发光 间接化学发光,1直接化学发光,化学反应释放的化学能激发的是反应产物分子,A+B C*+D,C*C+h,10,2间接化学发光(敏化的化学发光),在化学反应中，激发能传递到另一个未参加化学反应的分子上，使该分子达到电子激发态，再由激发态分子返回到基态时发光；或反应首
4、先生成一种高能量的中间体，此中间体再将能量转移给另一个未参加化学反应的分子，使该分子达到电子激发态，再由激发态分子跃迁回到基态时发光的过程。,A+B C*+D,C*+F F*+E,F*F+h,11,二、反应的底物(发光剂或发光底物),在化学发光反应中，参与能量转移并最终以发射光子的形式释放能量的化合物,发光免疫技术中常用的化学发光底物:,氨基苯二酰肼类 主要有鲁米诺(3-氨基苯二甲酰肼，luminol)和异鲁米诺(5-氨基苯二甲酰肼，iso lumino1)及其衍生物。2眯唑类化合物较常用的是2，4，6-三苯基咪唑，即洛粉碱(lophine)。3吖啶酯类典型代表是N，N-二甲基二吖啶硝酸酯，即
5、光泽精(1ucigenin)。4苯酚类化合物其中主要有邻苯三酚，即焦性没食子酸。5芳香草酸酯类主要有双-(2，4，6，-三氯苯基)-草酸酯(TCPO)和双-(2，4-二硝基苯基)-草酸酯(DNPO)。6(金刚烷)-1，2-二氧乙烷及其衍生物,12,13,三、标记方法,化学标记 生物标记,化学标记:,用于化学发光(酶)免疫测定,直接用发光物质(如鲁米诺、吖啶酯类等)标记抗体或抗原以催化剂(如HRP、GOD等)和或协同因子(如ATP、NAD等)标记抗体或抗原,按照标记物的应用:,14,按照被标记物的结构或性质:,对小分子物质(如甾体激素、药物等)的标记对大分子抗原、抗体的标记(如蛋白质、核酸等)以
6、及对某些配基和载体的标记,15,按照标记反应的过程和形成结合物的结构特点:,直接偶联间接偶联,通过偶联反应，使标记物分子中的反应基团直接连接在被标记分子的反应基团上。,在标记物与被标记物之间插入一条链或一个基团，使两种物质通过这种引入的“桥”连结成结合物,碳二亚胺缩合法、过碘酸盐氧化法、重氮盐偶联法和混合酸酐法,琥珀酰亚胺活化法、O-(羧甲基)羟胺法、异硫氰酸酯衍生物和戊二醛法,16,17,常用的标记方法,1碳二亚胺（EDC）缩合法,此法可用于蛋白质分子中的游离羧基或游离氨基的标记。常用的缩合剂有l-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)-碳二亚胺(EDC)和二环己基碳二亚胺(DCC),直接偶联,18
7、,2重氮盐偶联法(又称重氮化法),此法简易、成本低、重复性好，但不适用于脂肪伯胺基发光剂，因其生成的重氮盐不稳定，即使在也会生成氮气。此外，ABEI等伯胺基位于侧链者也不适用此法。,芳香伯胺,直接偶联,19,3过碘酸盐氧化法,标记物可用发光剂或催化剂，适用于芳香伯胺或脂肪伯胺发光剂，标记方法稳定标记物不易脱落，但此法不适用于无糖基的蛋白质和含有糖基但氧化后会影响免疫学活性的蛋白质。,直接偶联,20,4戊二醛法 间接偶联,芳香伯胺基,氨基,由于戊二醛在溶液中以单体和聚合体形式存在，后者占多数，所以在标记反应中双方分子间构成较大的距离，减少了在抗原抗体反应时的空间位阻；但因偶联不易定量控制且缺乏特
8、异性等而未得到广泛应用,双功能偶联剂,21,5琥珀酸酐法(环内酸酐法),间接偶联,此法没有双功能交联剂的不良反应，能实现标记物和蛋白质分子间的单向定量缩合，标记效率高，已有商品化试剂供应。,22,6异硫氰酸酯衍生物法,此法标记温和、稳定，获得的标记物不易脱落，且不损失蛋白质等的生物活性,发光标记物,标记物,间接偶联,23,7 O-(羧甲基)羟胺法,O-羧甲基衍生物,8混合酸酐法,24,四、反应类型,化学发光免疫分析化学发光酶免疫分析微粒子化学发光免疫分析,根据发光免疫分析中发光反应的不同体系和标记方法不同,25,1.化学发光免疫分析,(chemiluminescence immunoassay
9、，CLIA),用化学发光剂直接标记抗原或抗体,免疫反应后生成标记的免疫复合物,通过启动发光试剂(NaOH-H2O2)作用于AE而发光，发光强度依赖于免疫反应物中化学发光剂的浓度。,原理:,常用化学发光剂:,吖啶酯(acridinium ester，AE)类化合物,反应特点:,CLIA检测小分子抗原采用竞争法；大分子抗原则采用夹心法。与大分子的结合不会减小所产生的光量，从而增加灵敏度。,强烈的直接发光在1 s内完成，为快速的闪烁发光。,应用:,26,1)直接化学发光使用吖啶酯(AE)作为标记物，无需附加催化剂。AE氧化直接发光，氧化反应在430 nm处快速发光并在1s内达到峰值。发光强度是I12
10、5在1min内发光强度的十万倍，因此系统该具有高速度、产光强等特点。2)AE有甲基，增加了试剂的稳定性，使试剂的稳定性好，有效期更长。3)AE作为化学发光标记物，对温度及pH等外界环境的变化不敏感，故其具有很高的精密度。4)AE相对分子质量水常小(MW：481)，使其对结合反应的空间位阻作用减少，增加扩散率，提高了灵敏度，可达l0-15molL-1。5)AE是以共价键结合抗体而不影响抗体结合抗原的反应，故不影响发光。6)AE加碱后，发光是在一暗盒中进行，其光量值与浓度有着良好的线性关系，且本底较低。,吖啶酯的特点,27,2化学发光酶免疫分析,(chemiluminescent enzyme i
11、mmnunoassay，CLEIA),采用参与发光效应的酶作为标记物标记抗体或抗原，免疫反应后形成酶标记抗原抗体复合物，利用鲁米诺作为发光底物在酶和启动发光试剂(NaOH-H2O2)的催化下，产生发光反应，发光强度依赖于酶免疫反应物中酶的浓度。,原理:,底物 产物 发光,Ag+Ab*Ag-Ab*,*,28,常用标记物:,辣根过氧化物酶(HRP)或ALP,反应特点:,标记物常标记抗体；标记物作为发光反应的催化剂，本身不发光。,29,3微粒子化学发光免疫分析(microparticle chemiluminescence immunoassay，MLIA),以顺磁性微粒作为载体包被抗体，利用磁性微
12、粒能被磁场吸引，在磁力的作用下发生力学移动的特性，迅速捕捉到被测抗原。加入碱性磷酸酶标记的第二抗体，形成磁性微粒包被抗体-抗原-酶标记抗体复合物 经洗涤去掉未结合的抗体后，加入ALP的发光底物AMPDD，AMPDD被复合物上ALP催化发光,发射光所释放的光子能量被光量子阅读系统记录，通过计算机处理系统将光能量强度在标准曲线上转换为待测抗原的浓度。,原理:,30,AMPDD一侧的芳香基团上的磷酸酯被水解，失去一个磷酸基而生成一个中等稳定的中间体AMPPD(半衰期230min)，此中间体通过内部电子转移而裂解为一分子的金刚烷酮和一分子激发态的间氧苯甲酸甲酯阴离子，当回到基态时发出波长为470 nm
13、的光),31,常用标记物:,A L P,反应特点:,可采用竞争法和夹心法,多采用双抗体夹心法采用磁性微粒作为固相载体，以碱性磷酸酶作为标记物，固相载体的应用扩大了测定的范围,检测水平可茯PgmL-1，重复性好。,32,五、相关仪器介绍,ADVIA CENTAUR全自动免疫分析仪,33,(一)ADVIA CENTAUR检测原理,利用化学发光和磁性微粒子分离技术相结合的测定方法，用高敏感性的吖啶酯作为化学发光标记物，以极细的磁性颗粒(PMP)作为固相载体，提供最大的包被面积。,1液相吖啶酯(AE)。,2固相 氧化铁(Fe2O3)。,包被面积大,减少了扩散时间,增加了捕获效率,34,(二)ADVIA
14、 CENTAUR的反应类型,1双抗体夹心法,35,2竞争法 包括AE标记抗原法和AE标记抗体法。,36,3捕获法 常用来检测样本中的特异性抗体，又称为抗体捕获法。,试剂中使用了一种抗人免疫球蛋白的抗体。抗体捕获法通常使用两次温育和洗涤，第一次温育和洗涤是为了除去样品中过多的干扰物质；第二次温育和洗涤是为了检测样品中的抗体。,37,第二节电化学发光免疫分析,电化学发光(electrochemiluminescence，ECL)是对电极施加一定电压进行的电化学反应，反应的产物之间或体系中某种组分发生化学发光，用普通化学手段测量发光光谱及强度从而对物质进行痕量分析的一种方法。电化学发光免疫分析(el
15、ectrochemiluminescence immunoassay，ECLIA)是将ECL和免疫反应(抗原抗体反应)融为一体的标记免疫分析技术,是一种在电极表面由电化学引发的特异性化学发光反应.,38,一、基本原理,39,技术特点,1ECLIA为非核素方法，可避免核素的放射性污染2为均相免疫测定技术，检测中不需要分离结合相和游离相，操作简便3磁性微珠包被技术的应用使检测的灵敏度更高、线性范围更宽、反应时间更短。4标记物Ru 稳定性好，室温下半衰期大于1年，所标记的蛋白活性在24也可保持1年：以上。5标记物可进行化学修饰，以形成易于和蛋自、半抗原及核酸等分子结合的活性NHS酯或磷酰胺基团，可用
16、于各种分析物的检测。6标记物相对分子质量小，在一个抗体分子上可同时标记许多标记物分子而不影响抗体的免疫学活性，也可用于核酸的标记而不影响探针的杂交活性。7标记物的再循环利用使发光反应的时间更长、发光强度更高，更易于测定。8仪器的没计使操作较为简便，更易于实现自动化。,40,二、标记物,钌的衍生物，分子结构简单、稳定、相对分子质量小、水溶性强、空间位阻小等特点，可与待测物质进行全量反应使得ECLIA的测定具有高效性与稳定性且没有噪声干扰。,三联吡啶钌,41,第三节时间分辨荧光免疫分析法,一、基本原理,抗原抗体反应 荧光物质标记 时间分辨技术,+,+,原理：,42,用三价稀土离子及其螯合剂作为示踪
17、物(代替荧光物质、放射核素或酶)，通过双功能基团的螯合剂与蛋白质、多肽、激素、抗体、核酸探针或生物活性细胞以共轭双键结合进行标记，待反应体系(如抗原抗体免疫反应、生物素亲和素反应、核酸探针杂交反应、靶细胞与效应细胞的杀伤反应等)发生后，三价稀土离子螫合物可以在紫外光激发下，发出强度高(波长为613nm左右)、持续时间长(10l 000s)的荧光，利用延缓测量时间，待样品中蛋白质等背景荧光完全淬灭后，再测量三价稀土离子螯合物的特异荧光，根据荧光强度和相对荧光强度的比值，判断反应体系中分析物的浓度，达到定量分析的目的,43,时间分辨技术消除背景荧光:在检测样品中，含有各种蛋白质和其他化合物，这些物
18、质在较大波长范围内都可产生自发荧光,寿命短.镧系离子荧光寿命很长（10us1.0ms），比背景荧光长34个数量级。所以应用荧光的时间分辨技术在背景荧光已经降到很低时再开始检测稀土鳌合物的荧光，从而消除了非特异性荧光的干扰。,解离-增强原理:,较大的Stocks位移（即激发光波长与发射光波长之差）和较窄的发射峰等都增大了检测的信噪比;,特点：,44,二、标记物和螯合剂,1TRFIA标记物三价镧系稀土元素 常用的为铕(Eu3+)，钐(Sm3+)、铽Tb3+)等,(1)激发光谱带较宽(2)发射光谱带很窄(3)荧光寿命长(4)Stokes位移较大(250350 nm)(5)稀土元素标记物比较稳定,2螯
19、合剂,具有双功能基团的螯合剂，其一侧基团与Eu3+连接，另一侧与抗体或抗原上的自由氨基连接。,香羧酸类螯合剂多氨基多羧基类螯合剂-二酮体类螫合剂聚氨基多羧酸酐与氨基芳香羧酸缩合物,45,三、方法分类1按反应类型分为固相竞争法和非竞争法(双抗体夹心法)。2按是否加入增强液分为两大系统，需要加入增强液的，以瑞典LKB公司的Arcus TRFIA体系为代表；不需要加入增强液的，以加拿大Cyber Fluor TRFIA体系为代表。,46,第四节荧光偏振免疫分析法,FPIA是根据抗原、抗体竞争结合反应的原理，通过测定荧光偏振度定量检测待测抗原的浓度。,FPIA兼具荧光分析的灵敏度和均相免疫法专一、快速的特点，故测定结果重现性好，在免疫测定法中引人注目。在临床检验、毒品分析、农药残留量分析、环境和食品监测等方面,47,第五节化学发光免疫分析的临床应用(一)甲状腺疾病相关免疫检测(二)生殖内分泌激素检测(三)贫血的检测(四)肿瘤标志物的检测(五)心肌蛋白的检测(六)传染病相关项目的检测(七)骨代谢相关标志物(八)自身抗体的检测(九)药物浓度的监测(十)核酸分析,
