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1、第五章 分子发光荧光、磷光和化学发光法,分析化学（仪器分析部分）,你知道下面的发光原理吗？,磷火（鬼火）荧光棒萤火虫,分子发光molecular luminescence,分子荧光分子磷光化学发光生物发光,光致发光：分子吸收了光能而被激发至较高能态，在返回基态时，发射出与吸收光波长相等或不等的辐射，这种现象称为光致发光。,化学发光：化学反应中，产物分子吸收了反应过程中释放的化学能而被激发，在返回基态时发出光辐射。,目 录,5-1 荧光和磷光光谱法5-2 化学发光与生物发光分析法,参考文献：陈国珍，黄贤智，郑本梓，许金钩，王尊本，荧光分析法，科学出版社，北京，1990 Joseph R. Lak
2、owicz, Principle of Fluorescence Spectroscopy, Kluwer Academic/Plenum Publishers, New York, 1999 netLibrary电子图书,目 录,5-1 荧光和磷光光谱法5-1-1 基本原理5-1-2 荧光分析仪器5-1-3 荧光分析方法的特点与应用5-1-4 磷光分析法5-2 化学发光与生物发光分析法,5-1-1 基本原理,5-1-1-1 荧光和磷光的产生5-1-1-2 光谱曲线5-1-1-3 荧光的影响因素 5-1-1-4 荧光强度的定量关系,基态单重态S0 激发态单重态S 激发态三重态T 10-8s 1
3、0-4 - 1s,5-1-1-1 荧光和磷光的产生1单重态和三重态,基态单重态(singlet state)：自旋电子成对,只有一种自旋方向(相反),电子自旋总和是零，光谱项的多重性是1，以S0表示; 当基态电子激发到某高能级时, 将有两种激发态：即受激电子自旋相反与自旋平行: h、h。自旋平行多重性为M=2x1+1=3，称为激受三重态（triplet state）用T表示，自旋相反多重性为1，称为激受单重态，用S表示；,激发单重态S与激发三重态T的不同点：, 激发三重态的能量较激发单重态的能量低 。, 基态单重态到激发单重态的激发为允许跃迁，基态单重态到激发三重态的激发为禁阻跃迁；, tS
4、= 10-8s, tT = 10-41s；, S是抗磁分子，T是顺磁分子；,2分子内的光物理过程,辐射跃迁： 荧光：S1最低振动能级S0磷光：ST非辐射跃迁：(热的形式)振动弛豫内转移外转移系间窜跃,系间窜跃,内转移,荧光的寿命比磷光的寿命短，但是量子产率较高。,非辐射能量传递过程,振动弛豫：同一电子能级内以热能量交换形式由高振动能级至低相邻振动能级间的跃迁。发生振动弛豫的时间10 -12 s。 内转换：相同多重态电子能级中,等能级间的无辐射能级交换。 通过内转换和振动弛豫，高激发单重态的电子跃回第一激发单重态的最低振动能级。 外转换：激发分子与溶剂或其他分子之间产生相互作用而转移能量的非辐射
5、跃迁； 外转换使荧光或磷光减弱或“猝灭”。系间窜跃：不同多重态,有重叠的转动能级间的非辐射跃迁。 改变电子自旋，禁阻跃迁，通过自旋轨道耦合进行。,辐射能量传递过程,荧光发射：电子由第一激发单重态的最低振动能级基态， 多为 S1 S0跃迁，发射波长为 2的荧光； 10-710 -9 s 。 由图可见，发射荧光的能量比分子吸收的能量小，波长长； 2 2 1 ； 磷光发射：电子由第一激发三重态的最低振动能级基态， T1 S0跃迁； 电子由S0进入T1的可能过程：（ S0 T1禁阻跃迁） S0 激发振动弛豫内转移系间跨越振动弛豫 T1 发光速度很慢： 10-4100 s 。 光照停止后，可持续一段时间
6、。,5-1-1-2 光谱曲线,激发光谱 发射光谱 磷光光谱（phosphorescence）特征：（1）Stokes位移（2）激发波长一般不影响发射光谱的形状（3）吸收光谱与发射光谱的镜像关系,激发光谱与发射光谱的关系,a. Stokes位移 激发光谱与发射光谱之间的波长差值。发射光谱的波长比激发光谱的长，振动弛豫消耗了能量。b. 发射光谱的形状与激发波长无关 电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能量(如能级图 2 , 1)，产生不同吸收带，但均回到第一激发单重态的最低振动能级再跃迁回到基态，产生波长一定的荧光(如 2 )。 c. 镜像规则 通常荧光发射光谱与它的吸收光谱（与激发光谱形状一
7、样）成镜像对称关系。,镜像规则的解释,基态上的各振动能级分布与第一激发态上的各振动能级分布类似；,基态上的零振动能级与第一激发态的二振动能级之间的跃迁几率最大，相反跃迁也然。,5-1-1-3 荧光的影响因素 1. 分子产生荧光必须具备的条件（1）具有合适的结构；（2）具有一定的荧光量子产率。量子产率: 荧光物质发射光子数与吸收激发光子数之比（当非辐射跃迁A返回基态的概率很小时，F接近于1，在通常情况下，F总是小于1的）,2荧光与有机化合物的结构,（1）跃迁类型：* 的荧光效率高，系间跨越过程的速率常数小，有利于荧光的产生； * 跃迁是产生荧光的主要类型.（2）共轭效应：提高共轭度有利于增加荧光
8、效率并产生红移易于实现* 跃迁的芳香族化合物容易发出荧光,而脂肪族和脂环族化合物(除少数高度共轭体系化合物以外)极少能发生荧光.,（3）刚性平面结构：可降低分子振动，减少与溶剂的相互作用，故具有很强的荧光。如荧光素和酚酞有相似结构，荧光素有很强的荧光，酚酞却没有。,金属螯合物的荧光：不少有机化合物虽然具有共轭双键，但由于不是刚性结构，分子处于非同一平面，因而不发生荧光。若这些化合物和金属离子形成螯合物，随着分子的刚性增强，平面结构增大，常会发出荧光。,（4）取代基效应：芳环上有给电子基团，使荧光增强。,OH、 CN、 NR2、 OR、 NH2,芳环上有吸电子基团，使荧光减弱甚至猝灭。,CO、N
9、O2、NO、COOH、卤素离子,苯酚、苯、硝基苯、苯甲酸中，产生荧光最强的是_。,3溶剂效应 同一种荧光物质溶于不同溶剂，其荧光光谱的位置和强度可能有明显不同。 一般情况下，随着溶剂的极性的增加，荧光物质的* 跃迁几率增加，荧光强度将增强，荧光波长也发生红移。4 温度的影响 一般说来，大多数荧光物质的溶液随着温度的降低，荧光效率和荧光强度将增加，相反，温度升高荧光效率将下降。 如荧光素的乙醇溶液在0以下每降低10 ，荧光效率增加3%，冷至-80时，荧光效率为100%。,分子碰撞能量转移O2的作用内滤效应自熄灭、自吸收,5荧光熄灭（猝灭）,Fluorescence spectra (-) of
10、TPP and absorption spectra (-) of ETH5294 in plasticized PVC membrane: a. Excitation spectrum of TPP; b. Emission spectrum of TPP; c. Unprotonated ETH5294; d. Protonated ETH5294.,荧光物质分子与溶剂或其它溶质分子相互作用，引起荧光强度降低、消失或荧光强度与浓度不呈现线性关系的现象。,5-1-1-4 荧光强度的定量关系,k 与仪器有关的常数I0 激发光的强度F 荧光量子产率 荧光物质在激发波长处的摩尔吸光系数l 光程长度
11、。,根据Parker方程，荧光强度F与荧光物质的浓度c之间的关系是：,当cl项很小时，括号内第二项及以后的高次项均可忽略不计，Parker方程可简化为：,F = Kc,5-1-2-1 荧光分析仪器框图,光源,激发光单色器,样品池,发射光单色器(荧光单色器),检测器,信号处理,显示,I0 FIt,消除溶液中可能共存的其它光线的干扰,以获得所需要的荧光.,5-1-2 荧光分析仪器,4-2-1 紫外-可见分光光度计的基本组成,光源,单色器,样品室,检测器,显示,可见光区：钨灯作为光源，其辐射波长范围在3202500 nm。 紫外区：氢、氘灯。发射185400 nm的连续光谱。,5-1-2-2 荧光分
12、光光度计部件1光源：氙灯 激发光源应具有稳定性好、强度大、适用波长范围宽等特点。其中稳定性：影响测定的重现性和精密度；强度：影响测定的灵敏度。2单色器：滤光片、光栅 激发单色器和发射单色器3检测器PMT PhotomultiplierCCD Charge Coupled Device CID Charge Injected Device 4信号处理,灵敏度高：比紫外-可见分光光度法高24个数量级； 检测下限：0.10.1ug/cm-3 相对灵敏度：0.05-0.005ppb（0.05M H2SO4)选择性高重现性好取样量少仪器不复杂,5-1-3 荧光分析方法的特点及应用 1特点,2应用,检测：
13、金属离子、有机物、生物分子生物分子相互作用研究疾病诊断,定性分析：依据不同结构的物质所发射的荧光波长不同；定量分析：同种物质的稀溶液，其产生的荧光强度与浓度呈线性关系。,1如何获得较强的磷光,增加试样的刚性固体磷光法分子缔合物的形成重原子效应敏化磷光,5-1-4 磷光分析法,分子的外层电子在辐射能的照射下，吸收能量跃迁至激发态，再以无辐射驰豫转入第一激发三重态的最低振动能级，然后跃回基态的各个振动能级，并产生辐射。这种发光现象称为磷光。,目 录,5-1 荧光和磷光光谱法5-2 化学与生物发光分析法5-2-1 基本原理5-2-2 化学与生物发光分析的应用,5-2-1 基本原理,1. 化学发光反应
14、（chemiluminescence） 在化学反应过程中，某些化合物吸收了反应时产生的化学能而被激发，从激发态返回基态时，发射出一定波长的光。 A +B C * + D C * C + h（1）能够发光的化合物大多为有机化合物，芳香族化合物；（2）化学反应必须能够提供足够的能量，以引起电子激发。化学发光反应多为氧化还原反应，激发能与反应能相当 E=150400 kJ/mol；位于可见光区；（3）发光持续时间较长，反应持续进行； 化学发光反应如果存在于生物体(萤火虫、海洋发光生物)中，称生物发光（bioluminescence ）。,2.化学发光效率,化学效率：,发光效率：,时刻t 的化学发光强
15、度(单位时间发射的光量子数)：,dc/dt 分析物参加反应的速率；,3. 化学发光强度与化学发光分析的依据,在化学发光分析中，被分析物相对于发光试剂少得多，对于一级动力学反应：,dc/dt =Kc； K 为反应速率常数。定性依据：（1）在一定条件下，峰值光强度与被测物浓度成线性；,（2）在一定条件下，曲线下面积为发光总强度(S)，其与被测物浓度成线性：,4.化学发光反应的类型,（1）气相化学发光反应a. 一氧化氮与O3的发光反应(可测定空气中NO2的含量） NO + O3 NO2* NO2* NO2 + h 发射的光谱范围：600875nm，灵敏度1ng/mL；b.氧原子与SO2、NO、CO的
16、发光反应 O3 O2 + O （1000 C石英管中进行） SO2 + O + O SO2* + O2 SO2 * SO2* + h 最大发射波长：200nm；灵敏度1ng/mL；,O3 O2 + O （1000 C石英管中进行） NO + O NO2* NO2 * NO2 + h 发射光谱范围：4001400nm；灵敏度1ng/mL；氧原子与CO的发光反应： CO + O CO2* CO2 * CO2 + h 发射光谱范围：300500nm；灵敏度1ng/mL；,氧原子与NO的发光反应：,c. 乙烯与O3的发光反应,乙烯与O3反应，生成激发态乙醛：,CH2O* CH2O + h 最大发射波长
17、：435nm；对O3的特效反应；线性响应范围1 ng/mL 1g/mL；,（2）液相中的化学发光反应,应用最多的发光试剂：鲁米诺（3-氨基苯二甲酰肼）；,鲁米诺在碱性溶液中与双氧水的反应过程：,最大发射波长：425nm 可检测低至 10-9 mol/L 的H2O2；,鲁米诺- H2O2发光反应速度慢，某些痕量金属离子可催化反应；利用这一现象可间接测定这些金属离子。可测痕量的Cu2+ 、Mn2+、Co2+、V4+、Fe2+、 Fe3+、 Ni2+、Ag+、Au3+、Hg2+等 间接测定某些生物试样,氨基酸 + O2 酮酸 +NH3 + H2O2,氨基酸氧化酶,葡萄糖 + O2 + H2O 葡萄糖
18、酸 + H2O2 通过测定生成的H2O2 ，确定氨基酸、葡萄糖含量。,葡萄糖氧化酶,（3） 生物发光：生物分子的检测（ATP、NADH）萤火虫、细菌,ATP的测定,在pH 78；荧光素酶(E)和Mg2+的存在下，荧光素(LH2)与磷酸三腺苷(ATP) 反应，生成磷酸腺苷(AMP)荧光素和荧光素酸的复合物和镁的焦磷酸盐(ppi)：,ATP + LH2 + E + Mg2+ AMP LH2 E +Mg ppi + 2H+,pH7 - 8,复合物与氧反应，产生化学发光：,AMP LH2 E + O2 氧化荧光素* + AMP+CO2 + H2O氧化荧光素* 氧化荧光素 + h最大发射波长 562nm
19、；可测定10L试样中10-14g的ATP，线性范围达6个数量级。,5. 装置与技术,装置流程：,发光反应可采用静态或流动注射的方式进行： 静态方式：用注射器分别将试剂加入到反应器中混合， 测最大光强度或总发光量；试样量小，重复性差； 流动注射方式：用蠕动泵分别将试剂连续送入混合器，定时通过测量室，连续发光，测定光强度；试样量大；,6. 特点,灵敏度极高 例：荧光素酶和磷酸三腺甙(ATP)的化学发光分析，可测定210-17mol/L的ATP，即可检测出一个细菌中的ATP含量 仪器设备简单 不需要光源、单色器和背景校正； 发射光强度测量无干扰 无背景光、散射光等干扰； 线性范围宽 分析速度快缺点：
20、可供发光用的试剂少；发光反应效率低（大大低于生物体中的发光）；机理研究少。,附录：发 光 原 理,荧光灯发光原理：当高压加在灯管两端后，灯管内少数电子高速撞击电极后产生二次电子发射，开始放电，管内的水银受电子撞击后，激发辐射出253.7nm的紫外光，产生的紫外光激发涂在管内壁上的荧光粉而产生可见光。 （可见光的颜色将依据所选用的荧光粉的不同而不同）,人体里有很多磷，据测定，约有一千克左右。不过，这许多磷既不是白磷，也不是红磷，而是以磷的化合物的形式存在于人体。骨头中含磷最多，因为骨头的主要化学成分便是磷酸钙。在人的脑子里，也有许多磷的化合物磷脂。在人的肌肉。神经中，也含有一些磷。动物骨头的主要
21、成分，也是磷酸钙。在坟地或荒野，有时在夜里会看见绿幽幽或浅蓝色的“鬼火”。原来人、动物的尸体腐烂时，身体内所含的磷分解，变成一种叫做磷化氢的气体冒出；磷化氢有好多种，其中有一种叫“联膦”，它和白磷一样，在空气中能自燃，发出淡绿或浅蓝色的光这就是所谓的“鬼火”。,荧光棒中的化学物质主要由三种物质组成：过氧化物、酯类化合物和荧光染料。简单地说，荧光棒发光的原理就是过氧化物和酯类化合物发生反应，将反应后的能量传递给荧光染料，再由染料发出荧光。目前市场上常见的荧光棒中通常放置了一个玻璃管夹层，夹层内外隔离了过氧化物和酯类化合物，经过揉搓，两种化合物反应使得荧光染料发光。,萤火虫发光的过程与萤火虫体内特殊物质的综合作用有关。它是由生物体内细胞新陈代谢的重要物质腺苷三磷酸（ATP）引起的，这种物质使一种叫作虫荧光素的特殊的发光物质活跃起来。被ATP激活后，虫萤光素又被体内的一种酶（虫荧光素酶）和通过稠密的导管进入体内的空气中的氧所氧化。这种氧化反应导致兴奋状态而发光，然后，光又经多脂肪细胞的下层反射出来。,
