植物组织培养技术在农业中应用课件.ppt

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1、第2章 植物细胞工程,主要内容：第一节 植物组织培养概述第二节 植物胚培养第三节 植物茎尖培养与脱毒快繁第四节 植物组织培养过程中常出现的问题,第一节 植物组织培养概述,一、植物组织培养的一般概念 （广义）又叫离体培养，指从植物体分离出符合需要的组织、器官或细胞，原生质体等，通过无菌操作，在人工控制条件下进行培养以获得再生的完整植株或生产具有经济价值的其他产品的技术。（狭义）组培指用植物组织，如形成层、薄壁组织、叶肉组织、胚乳等进行培养获得再生植株；指在培养过程中从各器官上产生愈伤组织的培养，愈伤组织再经过再分化形成再生植物。,愈伤组织是指一种没有器官分化但能进行活跃分裂的细胞团。,愈伤组织

2、（Callus）,二、组织培养的特点,1、培养条件可以人为控制 组织培养采用的植物材料完全是在人为提供的培养基和小气候环境条件下进行生长,便于稳定地进行周年培养生产。 2、生长周期短，繁殖率高 由于人为控制培养条件，根据不同植物不同部位的不同要求而提供不同的培养条件，因此生长较快。往往20-30d为一个周期。总体来说成本低廉，且能及时提供规格一致的优质种苗或脱病毒种苗。,3、管理方便，利于工厂化生产和自动化控制 植物组织培养是在一定的场所和环境下，人为提供一定的温度、光照、湿度、营养、激素等条件，极利于高度集约化和高密度工厂化生产，也利于自动化控制生产。它是未来农业工厂化育苗的发展方向。它与盆

3、栽、田间栽培等相比省去了中耕除草、浇水施肥、防治病虫等一系列繁杂劳动，可以大大节省人力、物力及田间种植所需要的土地。,三、植物组织培养类型,1、胚胎培养指以从胚珠中分离出来的成熟或未成熟胚为外植体的离体无菌培养。2、器官培养 指以植物的根、茎、叶、花、果等器官为外植体的离体无菌培养，如根的根尖和切段，茎的茎尖、茎节和切段，叶的叶原基、叶片、叶柄、叶鞘和子叶，花器的花瓣、雄蕊（花药、花丝）、胚珠、子房、果实等的离体无菌培养。,3、组织培养 指以分离出植物各部位的组织（如分生组织、形成层、木质部、韧皮部、表皮、皮层、胚乳组织、薄壁组织、髓部等），或已诱导的愈伤组织为外植体的离体无菌培养。这是狭义的

4、植物组织培养。4、细胞培养 指以单个游离细胞（如用果酸酶从组织中分离的体细胞，或花粉细胞，卵细胞）为接种体的离体无菌培养。5、原生质体培养。 指以除去细胞壁的原生质体为外植体的离体无菌培养,四、植物组织培养生产药物的优点,1.周年生产，不受地区、季节及有害生物的影响。2. 占地面积少，便于工厂化生产，可对细胞生长自动控制和代谢过程合理调节。3.便于筛选高产细胞株。4.利于生物转化，寻找新的有效药物成分。植物培养物作为一种生物反应器转化外源化合物，能够产生原植物所没有的，甚至是至今自然界尚未发现的化合物。5.个体差异小，生产周期短，设备简单，能节省人力、物力等。6.利用组织培养过程中出现的芽变或

5、人工诱变，或进行脱毒，培育新品种，提高药用植物品质。7.保存种质资源。,五、植物组织培养的应用,1、快速繁殖稀有或有较大经济价值的植物 名贵植物之所以名贵，是因为繁殖系数低。利用组织培养可以快速繁殖，如兰花等。 经茎尖培养获得的脱毒苗一般数量有限，必须经过大量繁殖，在用于生产。,2、 植物脱毒特别是无性繁殖植物（如马铃薯、草莓、大蒜、康乃馨等）都带有病毒，严重影响植物的产量和品质。由于病毒是通过维管束传导的，因此利用这些植物营养器官繁殖，就会把病毒带到新的植物个体上而发生病害。感病植株并不是每个部位都带有病毒，如茎尖生长点尚未分化成维管束的部分，可能不带病毒。利用组织培养法进行茎尖培养，再生的

6、植株有可能不带病毒，从而获得脱病毒的苗，再用这种苗进行繁殖，则种植的植物就不会或极少发生病毒病。,3、利用培养变异，选择优良突变体，培养新品种 组织培养（包括器官培养、原生质培养等）突变率较高。选择较好的突变体，如早熟、矮秆性、抗旱性、抗寒性等。如日本培育的抗寒水稻，早熟草莓等都是利用培养变异。,4、植物种质资源的保存、挽救珍稀植物保存植物种质的传统方法：用常温、低温、变温、低氧、充惰性气体等，储存果实、种子、块根、块茎、种球、鳞茎。存在问题：代价高，占用间大，保存时间短，易受环境条件的限制。植物组织培养结合超低温保存技术，保存一个细胞就相当与保存一粒种子，但所占的空间仅为原来的几万分之一在-

7、193度的液氮中可以长时间保存，不像种子那样需要年年更新或经常更新。,5、通过单倍体育种缩短育种年限 通过花药和花粉组织培养可以获得单倍体植物，大大缩短了育种时间。使新品种的培育过程大大简化。 6、胚胎培养的应用 在远源杂交中，杂交后形成的胚珠往往在未成熟状态时，就停止生长，不能形成有生活力的种子，因而杂交不孕。用胚培养技术可获得杂种植物，这为在远缘时克服杂交不亲和的障碍提供了一项有用的技术。,7、细胞融合通过原生质体融合，可部分克服有性杂交不亲和性，而获得体细胞杂种，从而创造新种货育成优良品种。 8、用于遗传学、分子生物学、细胞生物学、组织学、胚胎学、基因工、生物工程等 要揭开生命活动的秘密

8、，需要多科学、多技术的相互配合，其中植物组织培养技术是不可缺少的，它为遗传学、分子生物学、细胞生物学、生物工程等提供了一种有效、快速的方法。,9、利用组织培养的材料作为植物生物反应器中草药是宝贵的财富，但很多种中草药资源匮乏，产量不足，甚至濒于灭绝。利用组织和细胞培养的方法在实验室内生产，不再依附于自然环境，不仅可以解决现有困难，而且可以通过筛选高产有效成分的细胞系，来提高其药用价值。如用培养的人参悬浮细胞，来生产人参皂苷，已在日本等国家形成规模。利用培养的植物细胞和组织细胞作为生物反应器，也可以生产某些蛋白质、氨基酸、抗生素、疫苗等，用生食蔬菜生产乙肝疫苗正在实验中。,10、用于其它未知科学

9、的研究 植物组织培养也同样具有许多尚未发掘出的潜力，说不定有一天人们会在三角瓶内种出大南瓜。 总之，现在的植物组织培养仍然处于发展阶段，远远没有达到它的高峰期，很多机理人们还没有搞清楚，它的潜力还远远没有发挥出来。相信在今后的几十年内，组织培养在我国将会有更大的发展，在农业、制药业、加工业等方面将会发挥更大的作用，创造出更大的经济效益。,第二节 植物胚培养,在一般情况下，植物的胚胎是从精卵结合形成合子开始的，合子经过分裂形成胚柄和胚体，胚体进一步分裂，并且分化，逐渐形成具有一定形态结构的胚。当种子发芽时，胚长成植株。胚胎培养是指采用人工方法把胚从种子、子房或胚珠中分离出来，再放在无菌条件下，让

10、其进一步生长发育，一直形成幼苗的过程。,单子叶植物胚,双子叶植物胚,一、胚胎培养的意义,离体胚胎培养可以克服种、属间受精障碍；打破种子休眠，缩短育种周期；克服种子生活力低下和自然不育等。,二、培养类型,胚胎培养的对象包括胚胎发生过程中不同发育时期的胚和具胚结构。 胚的发育对营养的要求有两个阶段： 1. 异养期 处于这一时期的幼小胚完全依赖和吸收周围组织的有机营养物质。 2. 自养期 在此时期胚能吸收培养基中的无机盐和糖，经过自身的代谢作用合成其生长必需的物质。 离体胚的培养分为两种类型： 即成熟胚培养和幼胚培养（指子叶形成之前）。,三、成熟胚的培养,1. 成熟胚培养的概念成熟胚培养：是指子叶已

11、形成的种胚。仅提供一定的温度、湿度就可以发芽生成植物体。如种子的发育。,2培养方法： 将受精（传粉）后的果实或种子（带表皮），经表面灭菌后，在无菌操作台，剥出种胚接种于预先配制好的培养基上，使裸露的胚在人工控制的条件下，发育成一棵完整的植物体。,3玉米成熟胚培养过程,1）外植体消毒 取玉米种子 放在盛有95的酒精中消毒10s，检查果皮是否完整，若有水进入果皮中而呈透明斑块的种粒，应丢弃。保留那些果皮完整、外貌无改变的种子。在无菌条件下，将种子放入75乙醇中消毒15s，用0.1%升汞浸泡1020分钟，用无菌水冲洗3次。2） 外植体预培养 把种子放置到有1张湿润的无菌滤纸的培养皿 ，于25的黑暗条

12、件下培育6h，种子将吸水膨胀，变软。,3）剥胚 种子吸涨后，将胚剥离出来。取一粒种子放在无菌培养皿中，用镊子固定，用另一把镊子轻轻剥去种皮。解剖刀沿着胚胎的边缘小心切除胚乳，暴露出位于其下方的种胚的一部分盾片。分离出胚胎后，用无菌水将每一个胚胎冲洗3次，然后移入装有培养基的三角瓶。培养基为MS培养基0.5mg/l细胞分离素。 4） 培养 25的黑暗环境中培养 5）外植体表现：大约在培养2天后出现胚根，34天后出现胚芽，79天后出生根迅速生长并出现一些不定根，10天后可以长成小苗。,四、 幼胚培养,幼胚培养：一般植物开花后1220天时期：胚龄处于原胚期、球形胚、心型期、早鱼雷期的培养。要求的条件

13、：这几个时期幼胚从生理至形态均未成熟，提供一定温度和湿度均不能发芽，必须提供碳水化合物氮源以及植物激素等营养物质。,(一) 幼胚培养的意义,1、克服远缘杂交不亲和性 在育种工作中，采用远缘杂交的方法将野生种优质基因导入栽培种。但远缘杂交经常得不到有活力的种子，其原因是许多情况下由于受精胚发育不良、或没有胚乳，或不能正常发育等，从而造成幼胚早期败育。如果在幼胚败育之前取出杂种胚进行培养，就可以再生出杂种植株，克服上述困难。,2、用于快速繁殖 幼胚具有较高再生能力，可通过体细胞胚胎发生产生大量的再生植株。3、获得胚性细胞或胚性愈伤组织 为原生质体培养、细胞融合及基因转化提供试验材料。胚性愈伤组织再

14、生能力较强，利用幼胚培养，诱导胚性愈伤组织，分离原生质体进行培养，或进行细胞融合，以及基因转化，能提高其再生频率。4、利用培养变异，选育新品种,（二）幼胚培养的方法,应用于胚拯救的幼胚培养步骤： 1）杂交 2）取材 3）消毒 4）剥取幼胚及接种 5）培养 6）驯化移栽与染色体加倍,1、杂交 根据育种目标，选择亲本，人工授粉（包括：母本去雄、套袋、授粉）。2、取材 在远缘杂种胚败育前，将幼胚由母体上取下，进行培养。各种植物远缘杂交，幼胚败育时间不同3、消毒 分别用75乙醇和 0.1升汞消毒。4、剥取幼胚及接种 在超净工作台内，用解剖针或解剖刀从液体状的胚乳中挑取幼胚，随即接种于培养基上。幼胚太小

15、时，可在解剖镜下操作。,5、培养,如果杂种胚败育较晚，胚发育较大，培养时，往往不进入脱分化，而直接发育长成幼苗。此种情况下，培养基中不加激素也能长成植株。 如果杂种胚败育较早，胚发育较小，培养时，培养基中需要添加激素。根据植物不同和再生途径不同，添加激素种类和浓度不同。如果通过胚状体发生再生植株，可添加2，4-D；如果通过不定芽再分化，可添加生长素和分裂素。,6、驯化移栽与染色体加倍 驯化方法与前述相同。 染色体加倍，如白菜2n=20，甘蓝2n=18，二者杂交杂种为19，不能进行正常减数分裂，所以必须加倍处理。处理方法后述。7、应用 利用胚培养克服远缘杂交不亲和性已在许多植物上成功，如西红柿、

16、茄子、辣椒、油菜、南瓜、大豆、花生、水稻、小麦、大麦、大葱、萝卜等与其近缘野生种，白菜甘蓝，以及百合花等花卉。,(三) 影响幼胚培养的因素,1. 胚龄2. 培养基成分3. 培养条件4. 胚柄等胚附属物,荠菜胚胎不同发育时期对营养的需求,（三）非远缘杂交幼胚培养,用于快速繁殖、诱导胚性愈伤组织及利用培养变异，选育新品种等。1、取材 一般在开花授粉后12-15天取幼胚。过早，幼胚太小，不容易取；过晚，幼胚发育太大，不进入脱分化，不能形成愈伤组织或胚状体，而直接长成幼苗。 取材时间也因植物不同，稍有区别。,2、消毒、剥取幼胚及接种 与上相同3、培养 幼胚培养，一般通过诱导胚性愈伤组织或胚状体再生植株

17、，因为幼胚培养比较容易形成胚性愈伤组织和胚状体。培养基可以用MS培养基，添加适量生长素，一般2，4-D效果较好，浓度因植物不同而不同，一般添加0.22.0 mg/L。一般先形成胚性愈伤组织，然后再形成胚状体，体胚发芽长成植株。,小麦幼胚,小麦幼胚培养形成的胚性愈伤和不定芽,如果为了大量增殖，可在胚状体形成之前，将胚性愈伤组织悬浮培养。即将胚性愈伤组织切碎，在含有同样成分的液体培养基中振荡培养，胚性愈伤组织长大后，在切碎培养，可以达到大量增殖的目的。将增殖的胚性愈伤组织转移到固体培养基上后，形成体胚，再生植株。,五、胚珠培养,胚珠培养是将胚珠从母株上分离下来，放在无菌的人工条件下，让其进一步生长

18、发育，以致形成幼苗的过程。 1. 胚珠培养的目的 1）在远源杂交进行胚拯救时，如果在植物胚胎培养的早期，由于技术上的限制，从母体植株分离幼小的胚较困难，可将胚珠整体分离进行培养。 2） 通过未受精胚珠培养，可获得由大孢子发育的单倍体细胞和无性系。 3）应用于离体受精,2. 胚珠结构,胚珠是种子植物的大孢子囊，是孕育雌配子的产所，也是种子的前身。胚珠包埋在子房里，其主要的部分是珠心，它是由许多细胞构成的。珠心的中央部分为胚囊，胚囊中的卵细胞受精之后发育成胚。,胚囊的结构,3. 胚珠培养类型,根据培养的胚珠是否受精将胚珠培养分为两类，即受精胚珠的培养和未受精的胚珠的培养。 (1)未受精的胚珠的培养

19、，目的是为试管受精提供雌配子体。 (2)受精后胚珠的培养，胚珠内胚的发育处于早期阶段，从两个细胞的原胚开始至球形胚阶段。,4. 胚珠培养的基本过程,1）胚珠的获取 A 培养受精胚珠，在大田或温室摘取授粉的时间合适的子房；如果未受精胚珠，则应在授粉前适当的时间摘取子房。 B 先用70的乙醇表面灭菌30s，再在5次氯酸钠溶液中灭菌10min，然后用无菌水冲洗35次。 C 在无菌条件下进行解剖，用解剖刀沿纵切面切开子房壁，把胚珠取出来，或者将带有胚珠的胚座部分一起取下来接种。,2）胚珠的培养A 一般采用固体培养基，将胚珠接种在已配好的培养基上 B 培养室温度为26，相对湿度5060，连续光照或每天1

20、8h的光照 3）培养基 胚珠培养所用的培养基较多的用White和Ms培养基,5. 培养胚珠的发育,受精胚珠的离体发育有两种情况：发育成种子；脱分化形成愈伤组织。1）胚珠离体发育成种子 离体胚珠所历经的发育过程与在母体植株上的胚珠大体相同。即胚珠进一步发育后，其胚囊发育为成熟的胚，珠被发育成种皮，两者组成完整的种子。,2. 胚珠脱分化形成愈伤组织离体胚珠形成的愈伤组织的起源有多种形式：起源于胚囊细胞 其愈伤组织再分化的植株遗传组成上是杂合的。起源于珠被细胞 其愈伤组织再分化的植株遗传组成是与母本相同。未受精胚珠培养中，则能够诱导大孢子或卵细胞分化为单倍体植株，用于单倍体育种。,六、胚乳的培养,（

21、一） 胚乳在种子发育和萌发中的作用 胚乳是种子贮藏营养物质，在种子萌发时供胚作养料。单子叶植物的水稻、玉米、小麦等具有胚乳，双子叶植物多数是不具胚乳的种子，其营养贮存在子叶里。胚乳中贮藏的物质主要是淀粉、蛋白质和脂肪。,裸子植物 胚乳于受精前即形成，它是配子体的一部分，由大孢子直接发育而来，虽有胚乳的功能，但在起源上，不同于被子植物。被子植物 胚乳是双受精产物之一，它是由一个精核和两个极核融合而成的，通常是三倍体组织。 胚乳培养是指将胚乳从母体上分离出来，放在无菌的人工环境条件下，让其进一步生长发育，以致形成幼苗的过程。,（二） 胚乳培养目的,1. 获得三倍体植株 2. 创造并获得染色体数目变

22、异的遗传材料 3. 理论研究 研究胚和胚乳之间的关系，阐明胚和胚乳在自然情况下的相互作用。由于胚乳是一种均质的薄壁细胞组织，完全没有维管成分的分化，因此对实验形态发生学研究来说，胚乳培养是一个极好的途径。胚乳培养为研究胚乳组织中持有的一些天然产物的生物合成和代谢提供了一个理想的实验系统。,（三）胚乳培养过程,1、胚乳外植体的制备 (1)对于有大块胚乳组织的种子来说，可将种子直接作表面灭菌，无菌水冲洗干净后，在无菌条件下除去种子的外皮即可培养 (2)对于某些植物，胚乳被一些粘性流质层包裹，取出胚乳很不方便，这时可先将整个种子作表面灭菌，然后在无菌条件下拨开种皮，去掉粘性流质层，取出胚乳组织。,（

23、3）对于有果实的种子，取授粉后几天的幼果，用70的酒精表面消毒数秒，再用饱和漂白粉液灭菌1020min，用无菌水冲洗3次。在无菌条件下切开幼果，取出种子，小心分离胚乳，接种在培养基上培养 。,2. 培养 温度：植物胚乳培养的最适温度一般为2528, Straus等曾试验了2036的温度对玉米胚乳生长的影响，发现在30时,生长至少减少了50%, 在25时比在20时生长增长4倍。Johri等试验证明,麻风树和蓖麻胚乳愈伤组织生长的最适温度在2426范围内。光照：玉米胚乳在暗培养时,生长良好，而蓖麻则在1500Lux的连续光照下生长最好。对黑麦草胚乳愈伤组织,光下显示出有明显的影响。,3、培养基 常

24、用Ms 、 White培养基 4、培养条件 （1）植物生长物质：2，4D或与玉米素组合 （2）蔗糖：28 （3）pH：4.56.5 （4）光照：强度1500lx，光照时间1012hd （5）温度：2426,（四）、离体胚乳的发育,（1）愈伤组织的诱导 （2）愈伤组织的再分化 （3）胚乳苗的生根培养,小黑麦胚乳愈伤组织的诱导,胚在枸杞胚乳培养中的作用,七、试管受精,1. 概念：植物试管受精（test-tube fertilization），也称离体受精（fertilization in vitro ），指在无菌条件下将离体子房或胚珠与花粉共同培养，最终完成受精并形成具有生活力的种子过程。试管受精

25、是植物子房和胚珠培养在育种中的应用的一个方面。,植物受精与种子发育,2. 离体受精的主要方法 在未传粉的胚珠或子房构上花粉，放在培养基上生长，在试管个完成花粉萌发、花粉管伸入胚珠以至受精作用的全过程亦可通过把花粉悬浮液注射到于房内，完成子房内授粉。,3. 离体受精研究的历史,离体受精试验最早的是堪塔(K Kanta)。1964年在带胎座的罂粟胚珠上撒上本种的花粉，实现了授粉，并取得成熟的种子，劳奥（P. S. Rao)等于l972年培养授粉的黄花烟草子房，也得到了种子。此外，矮牵牛、石竹、甘篮等几十种植物进行过试验，取得了不同程度的成功，使不亲和性的自交和杂交实现了受精。1977年金金巴赫(B

26、. G. Gegenbach)对玉米离体受精的试验，受精率达46，约5子房发育为正常的颖果。朱瀓等1979年对普通小麦品种的子房授以黑麦的花粉，结实率34，再将杂种胚进行培养后，获得了幼苗。,4. 离体受精应用,应用试管受精有可能为育种工作克服某些自交或杂交不亲和提供有用的技术：为远缘杂交提供方法：一些植物进行属间和科间远缘离体传粉后，可以得到具原胚和胚乳的杂种种子，或在克服某些植物种间不亲和性时，通过离体受精，可以获得Fl开花杂种植物：克服有性生殖中自交不亲和性：应用试管受精方法可以避免花粉在柱头上萌发时受到抑制或花粉管在花住中受阻，为获得成熟的种子创造了条件。诱导单倍体植物：在胚珠上撤上远

27、缘植物的花粉。曾行获得极少数单倍体植株的实验报道。,试管受精的一般方法,1.花粉的收集首先选择将要开花的雌穗或花蕾,经过常规消毒后在无菌条件下使花药开裂，用无菌培养皿或滤纸收集裂开花药撒出来的花粉，用来进行离体授粉。2.子房或胚珠的剥离在开花前1天将雌穗和花蕾取下,经过表面常规消毒后,剥取完整子房或胚珠,也可保留部分附属花器(如内稃、花萼、胎座等)。如用子房进行离体授粉勿使雌蕊受伤。剥离的子房或胚珠及时转入到培养基中。,3. 授粉子房离体授粉可采用两种方式：一是先将子房接入培养基中，后用毛笔粘取刚撒落的新鲜花粉，涂在雌蕊柱头上；另一种方法是在子房剥离后，可用子房的柱头直接粘取花粉，或用毛笔在子

28、房柱头上涂上花粉后再接入培养基中培养。,被子植物的离体受精,离体受精（ In Vitro Fertilization ，IVF） 指在离体环境中完成被子植物的精、卵融合而且利用受精所产生的“离体合子”培养再生植株，做到整个受精与胚胎发育过程完全在离体条件下完成。（90年代）,离体受精的技术基础,1.配子分离 1) 卵细胞的分离 酶学的方法直接解剖法 2) 精细胞的分离渗透压冲击法机械分离法,2. 单对配子融合 微电融合 85%融合率，只有此法融合的产物再生了植株。 高钙低PH介导融合 电融合方法的代替技术。 一般钙条件融合 PEG诱导的融合,培养方法前常采用微室饲养培养 将商品生产的微室置入饲

29、养细胞的小培养皿中;培养物接微室内;通过室底部微孔滤膜吸取周围饲养细胞释放的活性物质，促进其发育。,3. 人工合子的培养,中央细胞和精细胞的融合及发育,第三节 茎尖培养与脱毒快繁,1. 病毒为害的普遍性 （参考p89 表56）多数栽培植物，特别是无性繁殖植物，易受到一种或几种，甚至几十种病毒的侵染。例如，草莓染60多种病毒。并且随着培养时间的推移，侵染病毒的种类越来越多。 2 . 病毒的危害性 受病毒侵染的植物生长缓慢、畸形、产量大幅度下降，品质变劣，甚至完全丧失商品价值。因此说，病毒带来极大的危害。,一、病毒的危害,目前还没有药物能杀灭病毒，只能以防为主利用种子繁殖种子一般不带病毒，种子繁殖

30、植物可以得到无菌植株。茎尖脱毒对于无性繁殖植物，必须采取一种有效的方法，脱去病毒，才能达到提高常量和质量的目的。切断病毒传播途径,3 . 防治病毒的措施,二、病毒侵染的特点,早在40年代，就有科学家（White 等）发现病毒在根上和茎上的分布是不均匀，离根尖和茎尖越近，病毒的密度越低。反之，越高。即病毒在植物体内的分布是不均匀的，分生组织一般无病毒侵染。,分生组织避开病毒侵染的原因：,1、在植物体中，病毒的移动主要靠两条途径：通过维管系统，而分生组织中尚未形成维管系统；通过胞间连丝，但这条途径病毒移动速度非常缓慢，难以追赶上活跃生长的茎尖和根尖。 2、在旺盛分裂的分生组织中，代谢活动很高，使病

31、毒无法进行复制。 3、在茎尖中存在高水平内源激素，可以抑制病毒的增殖。 4、在植物体内可能存在 “病毒钝化系统”，他在分生组织中的活性最高，因而使分生组织不受侵染,Figure. SAMs and Floral Meristems of Arabidopsis(A) Original image. FM, floral meristem.(B) Image colored to show typical SAM zonation. CZ, central zone; PZ, peripheral zone,三、脱毒方法,（一） 热处理脱毒 1. 热处理发的发现及应用1889年印度尼西亚爪畦人发

32、现，患枯萎病的甘蔗（现证明为病毒病），放在5052的热水中保持30分钟，甘蔗就可去病生长良好。以后这个方法得到了广泛的应用，每年在栽种前把大量甘蔗茎段放到大水锅里进行处理。1954年Kassanis用热处理防治马铃薯卷叶病，此后，这一技术即被用于防治许多植物的病毒病。,2. 热处理原理热处理又称温治疗法（theomtherapy)，当植物组织处于高于正常温度的环境中时，组织内部的病毒受热之后部分或全部钝化，但寄主植物的组织很少或不会受到伤害。Kassanis(1954)解释： 感染植物体内病毒的含量，反映了病毒颗粒生成和破坏的程度。在高温下，不能生成或生成病毒很少，而破坏却日趋严重，以致病毒含

33、量不断降低，这样持续一段时间，病毒自行消灭，从而达到脱毒目的。,植物生长区与热处理区关系图解在热处理中BC区是个关键，在寄主的热死点(C)和寄生物热死点(B)之间的距离越大，热疗法成功的机会也就越大。,A,C,B,低温,高温,无损伤,病原菌被清除,无损伤,热处理脱除植物病毒的可能原因：,1）病毒是DNA大分子，病毒进入植物细胞后，随植物细胞DNA一起复制。热处理并不能杀死细胞，只是钝化病毒的活性，使病毒在植物体内增殖减缓或增殖停止，而失去病毒的侵染能力。 2）热处理是一种物理效应，与冷处理一样，他可以加速植物细胞的分裂，使植物细胞在与病毒繁殖的竞争中取胜。,1）温水浸渍处理 适用于休眠器官和剪

34、下的接穗或种植的材料。 方法：在50左右的温水中浸渍10min至数小时，方法简便易行，但易使材料受伤。2）热空气处理 热空气处理对活跃生长的茎尖效果较好，将生长的盆栽植株移入温热治疗室（箱）内，一般在35-40。 处理时间因植物而异，短则几十分钟，长可达数月。,3、热处理方法,热处理并非能脱除所有病毒。例如在马铃薯中，应用这项技术只能消除卷叶病毒。一般来说，对于球状病毒和类似纹状病毒以及类菌质体所导致的病害才有效；对杆状和线状病毒的作用不大。因此，热处理需与其他方法配合应用才可获得良好的效果。,4. 热处理方法主要缺陷,（二）茎尖培养脱毒,感染病毒植株的体内病毒的分布并不均匀；病毒的数量随植株

35、部位及年龄而异，越靠近茎顶端区域的病毒的感染深度越低；生长点（约0.11mm区域）则几乎不含或含病毒很少。,1、茎尖培养脱毒原理,在迅速分裂的植物细胞中，正常核蛋白合成占优势，而在植物细胞伸长期间，是病毒蛋白合成占优势，因为生长点、分生组织细胞是活跃分裂的细胞，其分裂能力比病毒DNA复制速度快，故采用旺盛分裂的生长锥（顶端分生组织）离体培养，就有可能脱除植物病毒。分生区域内无维管束，病毒只能通过胞间连丝传递，赶不上细胞不断分裂和活跃的生长速度。切取茎尖时越小越好，但太小则不易成活，过大又不能保证完全出去病毒。,2、培养基培养基类型：一般以White、Morel和MS培养基作为基本培养基，尤其是

36、提高钾盐和铵盐的含量会有利于茎尖的生长。培养基成分：在MS培养基对某些植物的茎尖培养时，其中有些离子浓度过高应稀释。植物激素的种类与浓度对茎尖生长和发育具有重要的作用，在双子叶植物中，激素大概是在第2对最年幼的叶原基中合成，所以茎尖的圆锥组织生长激素不能自给，必须提高适当浓度的生长素（0.1-0.5毫克/升）与细胞分裂素。,激素类型：在生长素中应避免使用易促进愈伤组织化的2，4-D，宜换用稳定性较好的NAA或IBA；细胞分裂素可用KT或BA；GA3对某些植物茎尖培养是有用的；有时茎尖培养添加活性炭培养基形态：在茎尖培养中，由于方便操作，一般都使用琼脂培养基。不过，在琼脂培养基能诱导外植体愈伤组

37、织化的情况下，最好还是用液体培养基。在进行液体培养时，须制作一个滤纸桥，把桥的两臂浸入试管内的培养基中，桥面悬于培养基上，外植体放在桥面上。,3. 茎尖培养脱毒的一般过程,1、诊断：首先了解供试材料感染病毒的种类 2、茎尖培养脱毒 3、鉴定 4、繁殖 5、驯化移植,4. 材料的选择要点,脱毒的目的是为了提高植物的产量和质量，恢复其原有的高产优质的种性。因此，材料的选择应注意以下几点： 1）、品种要可靠； 2）、要选择经当地栽培确认的高产优质的品种来作为脱毒材料 ；3）、名贵的植物良种 ；4）、植物生长旺盛期，再生率高，脱毒效果好 。,5. 茎尖的培养方法1）操作基本要求：进行脱毒培养时，由于微

38、小的茎尖组织很难靠肉眼操作，因而需要一台带有适当光源的简单解剖镜（8-40倍）。剥离茎尖时，应尽快接种，茎尖暴露的时间应当越短越好，以防茎尖变干。在一个衬有无菌湿滤纸的培养皿内进行操作，有助于防止茎尖变干。,2）外植体处理：一般来说，茎尖分生组织由于有彼此重叠的叶原基的严密保护，只要仔细解剖，无须表面消毒就可以得到无菌的外植体。有时消毒处理还会增加培养物的污染率，所以选取茎尖前，可把供试植株种在无菌的盆土中，放在温室中进行栽培。浇水时要直接浇在土壤中而不要浇在叶片上。,另外，最好还要给植株定期喷施内吸杀菌剂，可用0.55多菌灵和抗生素（如0.1%链霉素）。对于某些田间种植的材料，可以切取插条放

39、入Knop溶液中使其长大，由这些插条的腋芽长成的枝条，要比由田间植株上直接取来的枝条污染小的多。,Knop溶液：,成分： 硝酸钾 1克 ，硫酸镁 1克 ，磷酸二氢钾 1克，硝酸钙 3克。配制： 先把硝酸钾、硫酸镁、磷酸二氢钾用少量蒸馏水溶解，加蒸馏水到980毫升。随后取硝酸钙，用20毫升蒸馏水溶解，加入到上述溶液内。溶液灰形成白色沉淀，在使用是必须摇动。,为了保险起见，在切取外植体之前一般仍须对茎芽进行表面消毒。叶片包被严紧的芽（如菊花、兰花），只须75%酒精中浸蘸一下；叶片包被松散的芽（如香石竹、蒜和马铃薯等），要用0.1%次氯酸钠表面消毒10分钟。对于这些消毒方法，在工作中应灵活运用，如在

40、大蒜茎尖培养时，可将小鳞茎在75%酒精中浸蘸一下，再用灯火烧掉酒精，然后解剖出无菌茎芽。,3）剥取茎尖：把茎芽置于解剖镜下，一只手用镊子将其按住，另一只手用解剖针将叶片和叶原基剥掉，解剖针要常常蘸入90%酒精，并用火焰灼烧以进行消毒。但要注意解剖针的冷却，可蘸入无菌水进行冷却。当一个闪亮半圆球的顶端分生组织充分暴露出来之后，用解剖刀片将分生组织（0.20.5mm）切下来，为了提高成活率，可带1-2枚幼叶（原基），然后将其接到培养基上。接种时确保微茎尖不与其他物体接触，只用解剖针接种即可。,4）茎尖培养：将接种好的茎尖置于22左右的温度下。每天以16小时 2000-3000lx的光照条件下培养。

41、在低温和短日照下，茎尖有可能进入休眠，所以较高的温度和充足的日照时间必须保证。微茎尖需数月才能成功。茎尖培养的继代培养和生根培养和一般器官的培养相同。,4. 病毒检测,病毒检测是茎尖脱毒不可缺少的步骤常用鉴别寄主，即指示植物或血清学方法进行检测。及时淘汰血清学阳性反应或在指示植物上有症状的茎尖苗；无任何反应的茎尖苗即脱毒苗用作繁殖。,通常签订方法有四种：,1. 外观判断法： 带病毒株往往叶片发黄，凹凸不平，畸形，可根据这些表现来判断。但有些病毒表现不明显，仅靠这一方法还不够。2. 嫁接法： 利用指示植物（实生苗）作为砧木，被检测植物作为接穗，进行嫁接。若带病毒则枯死；不带病毒则成活。,3. 指

42、示植物法：,此方法适合鉴定靠汁液传染的病毒。将被检测植物 的植物汁液涂抹在指示植物（实生苗）的叶片上，根据发病情况，判断脱毒植物是否还带有病毒及其浓度 。指示植物对病毒的反应敏感，容易接种，通常不同病毒应选用不同的植物。常用指示植物有千日红、曼陀罗、豇豆、心叶烟、辣椒等。,4. 抗血清鉴定法（抗原抗体反应）,抗血清鉴定法是最常用的方法之一。原理：病毒是由蛋白质和核酸组成的，是一种较好的抗原。将病毒给动物注射后，会产生抗体。这种抗原和抗体的结合，即为血清反应。抗原：病毒。抗体：是指生物体在外来抗原的刺激下产生的一种免疫球蛋白，主要存在于血清中。 含抗体的血清称为抗血清。各种病毒都有各自的特异性，

43、可以用抑制病毒的血清来测定未知的病毒种类具体测定方法有沉淀反应，凝聚反应。,5. 电子显微镜检查法,用电子显微镜直接观察，检查有无病毒存在，并根据病毒的大小、形状和结构等来判断病毒种类。此法鉴定程序简单，方法先进，但需要设备和技术。,植物茎尖培养示意图,(1) 外植体大小和叶原基在最适培养条件下，外植体的大小决定茎尖的存活率，外植体越大，产生再生植株的机会也就越多；并且外植体越小脱毒效果越好。叶原基的存在影响分生组织形成植株的能力一般认为，叶原基能向分生组织提供生长和分化所必需的生长素和细胞分裂素。在含有必要的生长调节物质的培养基中，离体顶端分生组织能在组织重建过程中迅速形成双极性两端。因此，

44、带不带叶原基，与物种和培养基有关。,5. 影响微茎尖培养的因素,（2）培养条件在茎尖培养中，光下培养的效果通常比暗培养效果好，如马铃薯茎尖培养时，当茎已长到1cm高时，光照强度便增加到4000lx。,（3） 外植体的生理状态,茎尖最好要由活跃生长的芽上切取，在香石竹和菊花中，培养顶芽茎尖比培养腋芽茎尖效果好。但在草莓中，二者没什么差别。取芽的时间也很重要，一般选作萌动期较好。否则采用某种适当的处理，打破休眠才能进行。,（四）其它脱毒方式,1. 愈伤组织培养脱毒通过植物的器官和组织的培养去分化诱导产生愈伤组织，然后从愈伤组织再分化产生芽，长成小植株，可以得到无病毒苗。理论依据：愈伤组织细胞带病原

45、菌不均一，部分细胞不带病毒，由这些细胞再生的植株是无病毒的。多次几代的愈伤组织中病毒钝化，甚至检测不出病毒。,愈伤组织细胞不带病毒理由是：,1）病毒的复制速度赶不上细胞的增殖速度； 2）有些细胞通过突变获得了抗病毒的抗性。对病毒侵袭具有抗性的细胞可能与敏感的细胞共同存在于母体组织之中。采用它们存在部位的组织离体培养，所获再生植株中有较高比例的无毒株。 此方法缺点：植株遗传性不稳定，可能会产生变异植株，并且一些作物的愈伤组织尚不能产生再生植株。,2. 茎尖微体嫁接,木本植物茎尖培养难以生根成植株。将实生苗砧木在人工培养基上种植培育，再从成年无病树枝上切取0.41mm茎尖，在砧木上进行试管微体嫁接

46、，以获得无病毒幼苗。这在桃、柑橘、苹果等果树上已获得成功，并且有的已在生产上应用。,3. 化学疗法脱毒,许多化学药品（包括嘌呤、嘧啶类似物、氨基酸、抗菌素等）对离体组织和原生质体具有脱毒效果。常用的药品有8-氮鸟嘌呤、2-硫脲嘧啶、杀稻瘟抗菌素、放线菌素D、庆大霉素等。例如，将100微克2-硫脲嘧啶加入培养基可除去烟草愈伤组织中的PVY（马铃薯Y病毒）。,四、植物快速繁殖,通过无菌方边进行的无性繁殖，通称为“微繁”，或无性快繁，其优点是：可以用较短的时间和较少的空间，由一个个体开始产生大量的植株。从茎尖培养得到的脱毒植物数量不多，无法直接用于生产，利用微繁殖技术，可快速扩大繁殖系数。,（一）植

47、物快速繁殖的类型与方式,植物快速繁殖的类型与方式（续）,（二）繁殖方法,1）、在试管里扩繁 可利用茎段快繁或诱导不定芽。诱导丛生芽、诱导胚状体及利用鳞茎等途径进行快繁。根据植物不同，采用不同方法：甘薯可以利用蔓节段扦插于培养基，进行扩繁；兰花可以利用鳞茎切断扩繁；海堂利用无毒苗叶片、叶柄外植体诱导丛生芽扩繁。,2）、土壤中繁殖,无毒苗经驯化后，移栽到土壤中进行扩繁。如甘薯、草莓、等利用蔓，马铃薯、姜、蒜等利用地下部分繁殖。为了预防病毒再感染，扩繁应在培育温室或防虫罩内，因为昆虫传播病毒。 两种方法相结合，试管内扩繁，移栽后再扩繁。,马铃薯脱毒试管苗,马铃薯人工种子,魔芋试管苗,（三）诱导生根方

48、法,将新梢基部浸入50或10010-6（ppm）IBA溶液中处理48h； 在含有生长素的培养基中培养4-6d； 直接移入含有生长素的生根培养基中。 上述三种方法均能诱导新梢生根，但前二种方法对新生根的生长发育则更为有利。而第三种对幼根的生长有抑制作用。其原因是当根原基形成后较高浓度生长素的继续存在，则不利于幼根的生长发育。,另外也可采用下列方法就可生根：,延长在增殖培养基中的培养时间； 有意降低一些增殖系数，减少细胞分裂素的用量(即将增殖与生根合并为一步)； 切割粗壮的嫩枝在营养钵中直接生根，此方法则没有生根阶段。可以省去一次培养基制作，切割下的插穗可用生长素溶液浸蘸处理，但这种方法只适于一些

49、容易生根的作物。,另外少数植物生根比较困难时，则需要在培养基中放置滤纸桥，使其略高于液面，靠滤纸的吸水性供应水和营养，从而诱发生根。,从胚状体发育成的小苗，常常有原先已分化的根，这种根可以不经诱导生根阶段而生长。因经胚状体途径发育的苗数特别多，并且个体较小，所以也常需要一个低浓度或没有植物激素的培养基培养的阶段，以便壮苗生根。,（四）试管苗驯化,“温室的花朵不经风霜”，试管苗更弱，不能直接移栽，必须经过锻炼驯化 。首先试管盖打开少许，逐渐全部打开，因为试管内湿度大。试管内驯化47天后移栽。,通常不同植物的适宜驯化温度不同。如菊花，以1820为宜。植物生长的温度过高，不但增强蒸腾作用，而且还易滋

50、生杂菌。温度过低使幼苗生长迟缓，或不易成活。,（五）试管苗移栽及其管理,1.移栽基质 移栽基质可以是蛭石、草炭土、珍珠岩等，或者以一定的比例混合使用。如蛭石：草炭土1：1比例。在移栽前，应将基质灭菌。移栽后保持湿度。成活后再移栽于土壤。,从试管中取出发根的小苗，用自来水洗掉根部粘着的培养基，要全部除去，以防残留培养基滋生杂菌。要轻轻除去，应避免造成伤根。栽植时用一个筷子粗的竹签在基质中插一小孔，然后将小苗插入，注意幼苗较嫩，防止弄伤，栽后把苗周围基质压实，栽前基质要浇透水。栽后轻浇薄水。再将苗移入高湿度的环境中。保证空气湿度达90%以上。,2. 移栽方法,3. 移栽后管理,(1)保持小苗的水分