生物饵料培养教案.doc

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1、生物饵料培养学 备课讲义绪论一、基本概念：饲料：特指饲养陆生动物（家畜、家禽等）的食物。饵料指鱼、虾、蟹、贝等水产动物的食物，水产上应用的所谓配合饲料严格称为配合饵料或人工饵料。饵料生物和生物饵料饵料生物（prey food ）是指生活在海洋、江河、湖泊等水域中，可供水产动物食用的各种水生微生物、动、植物，如：细菌、酵母、单细胞藻类，轮虫，卤虫、等。生物饵料（living food）特指经过人工筛选的、可进行人工培养的、适合养殖对象食用的优质的饵料生物。生物饵料可分为植物性生物饵料（光合细菌及单细胞藻类）和动物性生物饵料（轮虫、卤虫、枝角类等）两类。生物饵料培养学（live food cult

2、ivatology）:主要研究生物饵料的筛选、培养及其营养价值评价的一门应用学科。主要内容和任务：1）生物饵料的筛选；2）生物饵料规模化或大量培养技术研究；3）生物饵料的营养价值评价。二、优良生物饵料所应具备的条件1、 优良生物饵料所应具备的条件饵料生物要成为优良的生物饵料，必须具备以下条件：1、 生物饵料的个体大小必须适合养殖对象的摄食。不同的动物及动物的不同发育阶段，其口径的大小不一样，所要求的饵料的大小也不一样，饵料过大，养殖对象不能吞咽；饵料过小，养殖对象不摄食或摄食效率低，从而引起养殖对象生长停滞或死亡。如，暗纹东方豚开口饵料为轮虫（大小150250微米），用卤虫无节幼体（500微米

3、左右）或单细胞藻类皆不适口。2、 生物饵料在水中的运动速度与在水层中的分布情况，应便与养殖动物的摄食。3、 生物饵料的营养价值高，容易被养殖对象消化吸收。4、 生物饵料及其代谢产物无毒或毒性小，不危及养殖对象的健康。5、 生物饵料的生命周期短，生长繁殖迅速。6、 生物饵料对环境的适应能力强，易于大量培养。三、生物饵料的优点及水产上的地位生物饵料作为养殖水产动物（主要是苗种培育阶段）的饵料，与人工配合饵料相比，具有如下优点：1、 对水环境的影响：使用生物饵料，对养殖水体的水质影响较小。微生物及植物性生物饵料，同时有改善水质的作用，动物性的生物饵料是活的生物，一般不会影响到养殖水体的水质，而使用人

4、工配合饵料对水质的影响则不同。2、 营养组成：生物饵料的营养丰富，能满足水产动物的营养需求。生物饵料大多含未知的生物活性物质，对养殖对象的生长有利；可筛选特定的生物饵料，满足特定培养对象的营养需求；可通过改变培养条件来改善或强化生物饵料的营养价值。3、 规格：生物饵料的大小可满足养殖对象的需求，不同生物饵料可组合成系列饵料，满足养殖对象不同生长阶段的具体需求。而人工微粒子配合饵料（小于300微米）的研究还有待提高。4、 可消化性：大多数水产动物喜食生物饵料，而且容易消化。自身含消化酶，可弥补幼体消化能力的不足。5、 可获得性：大多数水产动物能方便的摄食生物饵料，可针对养殖对象的运动和栖息习性，

5、选择运动能力和分布水层都适合培养对象的种类。鉴于生物饵料具有以上优点，其对水产动物养殖（尤其在苗种培育阶段）的重要性是不言而喻的。在许多水产动物的苗种生产中，都离不开生物饵料。近十几年，尽管微粒子配合饵料的生产有很大的发展，但是，85%以上的水产动物的苗种生产都需要卤虫无节幼体。生物饵料的培养情况，生物饵料的供应量，很大程度上决定着苗种生产的成败及经济效益。因此，一个水产动物育苗技术员的技术水平的高低，很大程度上取决与该技术员在生物饵料的生产上的水平。四、生物饵料培养未来发展方向（一）、生物饵料培养的中长期目标随着水产养殖的发展，在今后相当长一段时间，生物饵料规模化、稳定性培养技术，饵料的营养

6、强化，新型生物饵料的筛选(主要通过生物技术手段，筛选优良品系)仍然是生物饵料培养学的主要研究方向。藻类是自然界中能合成HUFA的主要生物，且其合成的HUFA与鱼油相比，氧化稳定性好，没有腥臭味。因此，今后在微藻培养方面，通过研究藻类中脂肪酸的组成及合成机制，最终选择富含HUFA的藻种和藻种品系，以满足经济动物幼体发育和饵料营养强化所需，被公认是替代鱼油生产EPA和DHA的最有效途径。在生物饵料培养过程中，由于是高密度培养，其水环境无疑会存在大量的细菌（水质条件比水产动物幼体培育水质差），这些细菌极易被生物饵料摄取，如Minkoff & Broadhurst (1994) 发现培养轮虫的水体中，

7、细菌含量通常在为11041107 CFU (colony-forming units)/ml，而轮虫体内的好氧性细菌一般在110711010 CFU/g, 在单个轮虫的肠道中积聚的细菌可达1105 CFU。这些细菌绝大部分不会造成生物饵料病害，但有些细菌可能对水产经济动物幼体是有害的或就是其病原菌，在生物饵料培养过程中，也同样会被生物饵料摄取和携带，如Makridis et al(2000)将轮虫和卤虫培养于从水产动物体中分离出病原微生物悬液中，这些病原微生物群落很快被摄取并可在这些生物饵料中存活424 h，这些致病菌通过食物链，传递给培育的水产动物幼体，必将造成病害（Dhert 1996,2

8、001）。对此问题当前还没有很好的解决办法，很多人尝试用消毒的方法或通过冲洗方法，来减少生物饵料携带的细菌数量，但实际的效果都不好。Gatesoupe(1991)用抗生素处理培养轮虫，然后投喂海水鱼幼体，可显著提高幼体的成活率。但抗生素的应用也存在争议，如携带抗生素的饵料生物会引起水产动物幼体正常肠道微生物群落的紊乱，产生其它环境问题等。微生态制剂在生物饵料培养的应用可能会成为解决生物饵料培养卫生性问题的关键途径，它不仅可以提高生物饵料的生长和繁殖，而且能抑制有害细菌的繁育，降低水质污染（Lee et al,1997），更重要的是生物饵料可以作为微生态制剂的载体生物，当被培育的水产动物幼体摄取

9、后，不仅作为饵料消化吸收，而且能够提高幼体的抗病能力和成活率。今后要加强相关方面的研究。生物饵料培养学的另一动向也应引起注意，就是生物饵料在自然条件下（主要在池塘）的人工培养和增殖。其实我国在育苗培育过程中，很早就注意和利用了这种方法，即向池塘施放有机肥料，以繁殖适量的饵料生物（轮虫，枝角类），待生物饵料高峰期再下塘育苗的方法。目前我国科技工作者，在鱼虾蟹的人工繁殖中，特别在蟹的育苗过程中，因地制宜选择池塘进行人工生态育苗，同时相应促进了池塘生物饵料的规模化培养。比如轮虫的池塘规模化培养，这方面还需进行一些基础研究，以便稳定和提高池塘人工生物饵料培养的产量。其他有关生物饵料的研究展望如下：1.

10、 优质、低廉的光生物反应器的研制。2. 单胞藻螯合微量元素（碘、硒、锗等）技术及其在保健制剂中的应用3. 高浓度硅藻抑制桡足类繁殖的生理机制4. 营养强化（HUFA）技术与营养需求的生理生化机制5. 休眠（卵）在生物饵料培养生产中的作用6. 低等甲壳动物生殖量及其影响因子的研究7. 产业化的生物饵料精养系统的建立8. 养殖动物对饵料生物利用的行为生态研究9. 低温冷藏生物饵料的研究（二）、生物饵料培养的终极目标：微粒饲料的完全取代水产动物苗种生产过程中的饵料环节是关键因素之一，由于苗种幼小、摄食能力低、食料范围窄、营养要求高、生长快、变态周期短、对外界环境变化和敌害侵袭的应付能力差等原因, 对

11、苗种生物饵料的生产和培养提出了很高的要求。在传统的人工繁育苗种领域内，一般采用天然饵料(如微藻、轮虫、卤虫无节幼体等)和一些代用饵料(如鸡蛋黄、豆浆等)。此外，通过池塘施肥所培育的生物饵料有时带有病原微生物或在营养上不全价，常引起苗种大量死亡或生长畸形。随着水产养殖业的发展和育苗规模的扩大，生产中生物饵料时常出现供不应求的局面，而代用饵料也由于养分流失多、浪费甚大和易污染水质等弊端，不宜大量使用。所以苗种的饵料问题已成为水产苗种规模化和产业化的一个主要制约因素。因此，对幼体阶段营养需求进行研究，最终配制出适应于幼体营养需求的全价微粒饲料，以替代目前育苗生产上主要依靠生物饵料的现状，是扩大经济鱼

12、虾类养殖的最终途径。近年来, 科研人员对鱼虾幼体的营养需求进行了较为广泛和深入研究，并不断地探索配制适应于幼体营养需求的全价饲料（微粒或微囊饲料 见下），以替代育苗生产上主要依靠的活饵料。商业性的微囊饲料在虾蟹和淡水鱼育苗阶段应用，从20世纪80年代开始，在国内外都有取得明显的成功的例子（Stottup & McEvoy， 2003），但在海水鱼幼体培育阶段，虽然这种努力已进行了20多年，但直到现在，人们仍然认为，在海水鱼幼体培育过程中，用微囊饲料完全替代生物饵料，似乎是不可能的。现市场上微粒饲料的营养物质组成，根据不同幼鱼的营养需求和代谢特点而有所不同，但由于目前的资料所限，所以饲料的蛋白源

13、常选用一些高营养价值的蛋白质，如鱼靡、鱿鱼靡、软体动物匀浆液、鳕鱼卵匀浆液、鸡蛋、牛奶、酪蛋白和动物明胶等。其他营养成分常添加磷脂如卵磷脂，n3HUFA, 维生素和矿物质等。虽然微粒饲料现尚不能完全替代生物饵料，但很多研究证实，微粒饲料可替代部分生物饵料，而且采用微粒饲料与生物饵料混饲，比单纯用活饵料或微粒子饵料的效果要好, 比如，Trandler et al（1991）用混饲方法培育10日龄的金头鲷，获得80的成活率。Kolkovski et al（1997）用同位素标记证实混饲（卤虫）极大地增加了鲈鱼对MD的消化吸收（与单纯用MD相比）。而且用这些微粒饲料，对于海水鱼幼体，已能完全替代海水

14、鱼幼体孵化后发育几周后的幼体的生物饵料。但早期的发育仍不能脱离生物饵料。不过，随着海水鱼营养研究的深入和微粒饲料营养成分的改进，替代海水鱼幼体发育的生物饵料的时间在逐步向早期阶段发展。如通常微粒饲料替代欧洲舌齿鲈的生物饵料是从孵化后的第55天开始，Person 等（1993 ）用MD将此时间提早到第40天。1997年，Zambonino 等又将此时间提早到第20天。Cahu 等(1998 )报道单纯用微粒饲料投喂欧洲舌齿鲈，35的幼体可存活到第28天，而正常情况下不投喂饵料的幼体最多存活到第15天。金头鲷(Fernandez-Diaz et al,1997)和真鲷(Takeuchi et al

15、，2001)幼体的开口阶段仅投喂MD也能有部分幼体成活。所以说，生物饵料最终被微粒饲料替代虽然还需漫长的时间，但它只是时间问题。即使微粒饲料能完全替代生物饵料，但它并不能终极生物饵料的培养，这是因为生物饵料培养的目的不仅仅是为了鱼虾蟹贝的育苗生产，而各地鱼虾蟹贝育苗的生产也不可能采用一种程式（生物饵料或微粒饲料），单纯用微粒饲料，或单纯用生物饵料或两者兼而有之的模式在水产动物鱼虾蟹贝育苗生产中会长期依存。第一章 光合细菌的培养光合细菌（Photo Synthetic Bacteria，PSB）是地球上最早出现的具有原始光能合成体系的原核生物，在不同的自然环境下，具有多种异养功能（固氮、脱氮、固

16、碳、硫化物氧化等），与自然界中的物质循环（氮、磷、硫）有密切关系，在自然净化过程中，起重要作用，是一大类在厌氧条件下进行不放氧光合作用的细菌的总称。其最本质的特点是能在厌氧和光照条件下进行不产氧的光合作用。第一节 光合细菌的生物学一、 生态分布广泛分布与地球生物圈的各处，在所有光能可供利用的地方皆可生存，在水环境中最为丰富。从南极冰封海岸到90度的温泉，从淡水到盐度为300的盐湖，从高山到2000米的海沟。二、 分类1、旧的分类系统广义光合细菌分产氧（蓝细菌）和不产氧（狭义光合细菌）两类。狭义光合细菌分紫细菌和绿细菌两类及两个独立的属：日光杆菌属和红色杆菌属。紫细菌包括红螺菌科、着色菌科和外硫

17、红螺菌科三个科共16属，49种。绿细菌包括绿菌科和绿色丝状菌科两个科共9属，17种。2、最新分类系统狭义光合细菌分产氧光合细菌 蓝细菌门 （产氧光养细菌）光合细菌 绿曲挠菌门：绿曲挠菌纲 绿菌门不产氧光合细菌 厚壁菌门： 螺旋杆菌科（不产氧光养细菌） 着色菌着色菌科 紫色硫细菌 变形菌门 外硫红螺菌科（紫色细菌） 好氧不产氧光养细菌紫色非硫细菌水产用途的光合细菌最好是红螺菌科的菌种。三、 培养物颜色及细胞形态大小不同的光合细菌培养物（菌落）的颜色不一样。主要是由菌体内的色素种类及含量的多少决定。类胡萝卜素含量高的菌种，颜色多为橙黄色或紫色，而细菌叶绿素含量高的种类一般为绿色。每种光合细菌的颜色

18、在固定的培养条件下是一定的，但是在培养条件变化时，颜色也会改变。如：红螺菌科的R. Oapsulata，在厌气条件下为褐色，在半好气条件下为深红或紫红色。光合细菌的形态多样，不同的菌种有不同的形态，同种的不同培养条件及不同生长阶段形态也不同，有球形、杆形、弧形、螺旋形等。光合细菌的大小也随种类而有较大的变异。一般讲，红螺菌科的细胞大小为0.6-0.7 X 1-10微米，着色菌科细胞大小为1-3 X 2-15微米，绿杆菌科细胞大小为0.7-1 X 1-2微米，绿色丝状菌科的细胞可达300微米。四、 光合细菌的色素及光合作用的器官光合细菌的色素主要有菌绿素a，b，c，d，e及类胡萝卜素。在不同的菌

19、种内含量不同。菌绿素是光合细菌进行光合磷酸化，将光能转变成化学能的媒介，而类胡萝卜素的主要作用是捕获光能（天线色素）及起光氧化的保护剂作用（防止菌绿素受光氧化损伤）。光合细菌的色素主要存在细胞内的载色体或绿色包囊中，载色体或绿色包囊是光合细菌进行光合磷酸化的部位（细胞器）。载色体存于与红螺菌科和着色菌科，由细胞膜陷入细胞质内而形成，并与细胞膜相连。绿色包囊存在于绿杆菌科和绿色丝状菌科，分散附着于细胞膜下面，是一个独立的球形细胞器。五、 光合细菌的生长及营养素根据光合细菌进行光合作用时供氢体的不同，光合反应可分为三类：1） 以硫化氢为供氢体，还原二氧化碳，如着色菌科和绿杆菌科；2） 以硫代硫酸盐

20、为供氢体，还原二氧化碳；3） 以有机物为供氢体，如红螺菌科和绿色丝状菌科。光合细菌获得代谢所需的能量的形式有三种：1） 光照厌气条件下，通过光合作用获得能量，2） 黑暗厌气条件下，通过脱氮或发酵获得能量，3） 黑暗有氧条件下，通过呼吸作用获得能量。大多数光合细菌的繁殖以二分裂的方式进行，少数种类以出芽分裂方式或极性伸长分裂方式进行繁殖。光合细菌生长所需的营养素有碳源（二氧化碳或有机物）、氮源（铵盐、氨基氮、氮气）及生长因子（主要为某些B族维生素，B1、B5、B7等）。第二节 光合细菌在水产上的应用一、 光合细菌在水产上的应用1、 作为养殖水体的水质净化剂光合细菌能降解小分子有机物，降低水体中的

21、COD，氨氮，从而改善水质，提高养殖产量。大连水院，对虾养殖，增产23.1%。2、 作为人工配合饵料的添加剂光合细菌菌体富含营养物质，粗蛋白含量（65.45%）超过大豆，同时含有丰富的B族维生素。富含生物体内重要的生理活性物质辅酶Q及大量的维生素K。东海所，中国对虾，饵料添加1.2%，增产16.2%。3、 作为鱼、虾、贝幼体的促生长因子。促进幼体生长、变态，提高成活率。原因：改善水质，提高营养。日本东京大学，黄盖鲽仔鱼，120ppm，50天，增长24%，增重73%。东海所，脊尾白虾育苗，10001400ppm，成活率提高9.519.3%。河北水校，海湾扇贝育苗，成活率提高24.3%，生长45.

22、9%。4、 作为动物性生物饵料的饵料用于培养轮虫、卤虫、枝角类等动物性生物饵料。5、 病害的防治作用防治鲤鱼烂鳃病、瞎眼病，金鱼的水霉病，黑鲷的烂尾病，鳗鱼的水霉病和赤鳍病。二、 光合细菌在应用中存在的问题1、 菌种的特异性问题 不同菌种使用效果不同2、 培养方法和生产工艺 生产出的菌液质量问题3、 使用范围及使用方法4、 使用剂量5、 提高养殖对象免疫机能的机理研究6、 光合细菌红色色素的综合利用三、 光合细菌在其他领域中的应用1、光合细菌在禽畜饲养中的应用光合细菌的营养价值极高，消化率好，作为禽畜饲料的营养添加剂，使用后可提高饲料效率，提高养殖效益。在肉鸡的饲养中使用光合细菌，可提高成活率

23、5%7%，肉鸡增重15%17%，料肉比降低33%左右，经济效益可提高50%以上。在蛋鸡养殖中，应用光合细菌可提高产蛋率12.7%，降低料蛋比12.2%，并且蛋黄中类胡萝卜素和维生素A的含量提高20%左右，同时淡季的换羽期、产蛋期延长。在猪饲料中添加光合细菌，可提高增重率13%，降低发病率25%，同时提高瘦肉率。在鹌鹑饲养试验中，添加光合细菌同样获得了高增重率。2、光合细菌在种植业中的应用光合细菌被证明是一种优质的有机肥料，又能增强植物的抗病力，可作为底肥或以拌种和叶面喷施等方式应用。光合细菌可提高土壤肥力。光合细菌能有效固定大气中的氮气，从而提高土壤的氮素水平。另外，光合细菌能有效降解或氧化土

24、壤中的残留农药，硫化氢和胺类等有毒化合物，对土壤起一定解毒作用。光合细菌还能提高植物的抗病能力。，作为瓜果的保鲜剂，能延长瓜果的存放期。3、光合细菌在有机废水处理中的应用光合细菌可把废水中的有机物转化为简单的无机物，降低化学耗氧量和生物耗氧量，减少水体污染，改善水质。用光合细菌处理豆制品废水（COD高达52800mg/L），12小时后COD的去除率达92.7%；用光合细菌处理淀粉废水（COD高达3864mg/L），72小时后COD的去除率达99.5%。目前，应用于高浓度有机废水处理的光合细菌主要是红假单胞菌属和红螺菌属的菌株。4、光合细菌在食品、化妆品、医药保健业中的应用光合细菌富含色素。有报

25、道光合细菌中细菌叶绿素含量达64.5mg/g，类胡萝卜素含量达34.8mg/g。来源于光合细菌的类胡萝卜素作为一种天然色素，在食品、化妆品等工业中，作为着色剂有广泛的应用前景。5、光合细菌在开发新能源中的应用氢作为一种理想而无污染的未来能源日益受到人们的关注。生物制氢是开发新能源的一个方向，欧美、日本等均在研究和开发生物制氢技术。光合细菌中许多种类，如红螺菌属、红假单胞菌属、荚硫菌属、硫螺旋菌属等的光合细菌在代谢过程中都能放出氢气。目前研究较多的是深红红螺菌（R. rubrum），它分解有机物进行光合产氢，产氢量高达65ml/（hL）（培养液），比蓝细菌产氢量高一倍多。第三节 光合细菌的分离、

26、培养及保藏一、 光合细菌的分离方法光合细菌菌种的分离是开展光合细菌培养和应用研究的前提。分离的步骤主要有：1）采样。根据光合细菌生长所需的条件，有选择的采集含光合细菌的水样和土样。一般在有机物污染严重，缺氧的环境中采样。2）富集培养。光合细菌分离成功的关键，在于选择适宜的富集和分离的培养基，提供符合光合细菌生长需要的厌氧环境，适宜的温度（25-35），一定的光照（500010000lx）。一般采用液体富集培养基，重复多次富集培养。3）分离纯种。将富集后的菌液进行固体培养基涂布或划线培养，挑取单菌落，重复多次分离，可得纯培养（仅有一个微生物种生长在培养基中的培养）。二、 光合细菌的培养1、 培养

27、的主要种类水产上应用价值大的红螺菌科的红假单胞菌属（Rhodopseudomonas）2、 培养方式1） 全封闭式厌气光照培养 主要用于小规模培养2） 开放式微气光照培养 可用于生产性大规模培养3、 培养设施及培养基1） 常规培养仪器！灭菌器（烘箱、高压蒸汽锅、） ！无菌箱、无菌室和超净工作台 ！恒温光照培养箱 ！玻璃器皿（试管、培养皿、移液管、锥形瓶、等） ！冰箱或冰柜 ！显微镜和接种环 ！离心机 ！真空泵 ！分析天平 ！摇床或震荡器 ！分光光度计等。2） 培养基！富集用基础培养基 ！Sawad培养基（分离用）！酵母膏、蛋白胨培养基（一般富集、分离和培养）！RCVBN培养基（富集、分离和菌种

28、保存）！矢木修身培养基 ！Van Neil培养基（用于富集培养）4、 培养方法及管理1） 容器和工具的消毒（同藻类培养）2） 培养基的配制！选择培养基-！配制培养基-！培养基的灭菌和消毒3） 接种接种比例：菌种母液：新培养液=1：41：1。4） 培养管理日常管理和测试！搅拌和充气 要求：保持菌体悬浮，并有机会接受光照，同时溶氧小于1mg/l 。！调节光照强度 要求：一般20005000lx，高密度500010000lx。！温度调节 要求：23-39！酸度测定和调节 ：随菌液的繁殖，pH会升高，从而抑制菌体的进一步繁殖。必须用酸调节PH，使之界于7-8。！测定光密度（O.D.） 了解生长情况。生

29、长情况的观察检查！菌液的颜色变化 ！O.D.值问题的分析和处理三、 光合细菌的保种菌种保藏的目的就是把菌株的原始性状和优良性状保存下来，防止死亡、退化或杂菌污染。菌种保藏方法很多，现介绍几种：（一） 低温保藏法固体斜面培养或液体培养的菌种用4 左右低温冰箱保存，时间在3060 d，也可在棉塞上浸蜡，一般可达34个月，至半年之久。（二） 低温定期移植保存法这是一种经典的简易保存法，即菌种接种于所要求的斜面培养基上，置最适温度下培养，至菌落形成后，置于低温、干燥处保存，每隔36个月移植培养一次。（三） 液体石蜡法选用优质纯净的液体石蜡，经121 高压灭菌2 h，然后用170 干热处理12 h，以除

30、水分。冷却后加到斜面上，覆盖以超过斜面为宜，菌种用的试管用橡皮塞，并用蜡封上，放阴凉室温即可。（四） 冷冻干燥法这是菌种保存比较理想的一种方法，它具有变异少，保藏时间长，输送储存方便等优点。具体操作方法如下：1 先将内径8 mm、长度100 mm以上的安瓿管消毒（2N HCl浸泡、水洗、烘干）干净，打印标签装入安瓿管，塞好棉塞，高压灭菌。2 将脱脂牛奶分装试管，高压灭菌、冷却。3 培养的菌种培养物分装到脱脂牛奶试管，制备菌悬液（108109 cell/ml）。4 用灭菌过的长的毛细滴管吸菌悬液（108109 cell/ml），滴入安瓿管0.2 ml。5 安瓿管预冷冻（-30 -40 、0.31

31、 h）。6 真空干燥（26.6 Pa，真空度：1.5 %3 %含水量）。7 安瓿管高温下拉成细径，抽真空、封管，检查真空度，低温（4 ）保藏。（五） 氮超低温保藏这是一种保藏菌种的好方法，国内外已广泛使用。具体方法是：将欲保藏的菌种悬液或菌块（常用保护剂为10 %甘油或5 %10 %二甲基亚砜）密封于安瓿瓶内，先控制致冷速度，预冻后，储藏于-150-196 液态冰箱中保存，保存期间需注意及时补充液氮。需恢复培养时，取出安瓿瓶急速放入3540 温水中，使其迅速融化后，打开，移种。第二章 单细胞藻类的培养单细胞藻类，通常指只有单个细胞组成的藻类个体，简称单胞藻或微藻。某些单胞藻，如骨条藻，角毛藻，

32、在生活状态下，通常会有多个细胞聚集在一起生长。单胞藻在水产养殖上不仅具有营养功能，而且还具有调节改善水质，促进水体形成稳定的藻菌微生态系，抑制致病菌的滋生等功能。在这一章中，主要介绍我国当前水产苗种生产中常用的单细胞藻类的培养生态和应用，单细胞藻类的生长特点和培养条件，重点介绍单细胞藻类的培养方法。第一节 常用单细胞藻类在我国，水产养殖上常用的单细胞藻类主要有绿藻门、硅藻门、金藻门和蓝藻门的种类。下面介绍我国水产养殖中常用的单胞藻的培养生态和应用情况。1、小球藻适宜培养条件：温度：1035；盐度：可驯化；最适光强：10000lx；最适pH： 68应用：培养动物性生物饵料，水色及水质的调控。2微

33、绿球藻 （眼点拟微球藻）适宜培养条件：温度：2530 ；盐度： 436；最适光强：10000lx；最适pH： 7.58.5应用：贝类育苗，河蟹幼体及动物性生物饵料，水色及水质的调控。3、亚心形扁藻 适宜培养条件：温度：2028 ；盐度： 3040；光强：500010000 lx；最适pH： 7.58.5应用：贝类育苗，轮虫培养4、三角褐指藻 适宜培养条件：温度：1015 ；盐度： 2532；光强：30005000 lx；最适pH： 7.58.5应用：甲壳类、贝类及棘皮动物的幼体饵料5、小新月菱形藻 适宜培养条件：温度1520 ；盐度： 2532；光强：30008000 lx；最适pH ：7.5

34、8.5应用：甲壳类、贝类及棘皮动物的幼体饵料6、牟氏角毛藻适宜培养条件：最适温度：30 ；盐度： 1015；光强：1000015000 lx；最适pH：8.08.9应用：斑节对虾、泥蚶育苗7、中肋骨条藻 适宜培养条件：温度：2030 ；盐度：1530；光强：5000 lx；最适pH： 7.58.5应用：斑节对虾、河蟹育苗8、等鞭金藻3011 适宜培养条件：最适温度：2030 ；盐度：1030；光强：70009000 lx；最适pH： 7.58.5应用：贝类及棘皮动物的育苗9、湛江等鞭金藻 适宜培养条件：最适温度：2532；盐度：22.735.8；光强：500011000lx；最适pH：7.58

35、.5应用：贝类及棘皮动物的育苗10、钝顶螺旋藻 适宜培养条件：最适温度：3037 ；盐度：可驯化；光强：3000035000lx；最适pH：8.69.5应用：观赏鱼配合饵料、贝类和甲壳类育苗第二节 单细胞藻类的培养方式和培养设施一、 细胞藻类的培养方式从不同的角度，单细胞藻类的培养方式可有多种分法。从培养的纯度看，有纯培养、单种培养和混合培养之分。纯培养：即无菌培养，是指排除了包括细菌在内的一切生物的条件下进行的培养。纯培养的要求最为严格。生产性培养中很难做到。单种培养指可有细菌存在但无其他藻类存在的培养。水产上室内水泥池培养一般多为单种培养。混合培养，也称多种培养，是指一培养体系中同时存在两

36、种以上的微藻细胞，各种微藻细胞同时生长。在室外土池施肥培养单细胞藻类是一典型的混合培养。按培养体系的密闭性，则可分开放式培养和封闭式培养。开放式培养指藻液直接与外界空气相通的一种培养方式，是目前水产用途单胞藻培养的主要形式，培养设备简单，培养体系可大可小，但培养过程中易受敌害生物的污染。封闭式培养指在一相对封闭的体系中培养单胞藻，这种培养方式主要用于保种，有时也用于生产性培养中藻种级培养。按采收的方式，则有一次性培养、半连续培养和连续培养之分。按培养的目的和规模，则可分藻种培养（一级培养）、中继培养（二级培养）和生产性培养（三级培养）。藻种培养（一级培养），指以保存藻种为目的藻类培养，多采用封

37、闭式不充气培养方式培养。中继培养（二级培养），指为生产性培养提供大量藻种为目的藻类培养，可采用封闭式或开放式培养方式。生产性培养（三级培养）是以大量生产藻细胞为目的培养，多采用开放式（封闭式）充气培养。二、单细胞藻类的培养设施完整的单细胞藻类培养设施一般包括如下几部分：1、藻种室：藻种室是进行藻种的分离、培养及保存的场所。也是开展藻类生长情况微观检查的场所。面积一般不超过10平方米，保温性能良好，一般要求内墙面及台面铺设白色瓷砖，易清洁消毒，防污染能力强，应配有恒温光照培养箱、显微镜、酒精灯、接种针、人工光源、操作平台等设备，以及三角烧瓶等玻璃器皿和各种营养盐及试剂。2、清洗消毒室：是进行培养

38、器皿和工具清洗及消毒的场所。面积一般在1015平方米。应配备有清洗水池、消毒池等设施和烘箱、高压蒸汽灭菌锅、炉灶等设备。3、培养室：进行藻类的中继培养和生产性培养的场所。装配有培养容器、培养架和培养池等设施。设计上要求采光好，屋顶一般用透光的玻璃钢波纹板覆盖，最好东西走向。配备有人工光源，最好可调温。4、培养容器：主要有各种规格的三角烧瓶、广口玻璃缸、细口玻璃瓶、透明塑料袋等。主要用于小型培养和中继培养。5、培养池：用于生产性培养用，一般池深80厘米，面积在210平方米。池内壁贴白色瓷砖。6、水处理系统：单细胞藻类培养比苗种培养对用水的要求更严格。在单胞藻培养用水处理系统中通常需配备过滤装置和

39、消毒池。最常用的过滤装置为沙滤池。7、充气系统：在生产性培养中，为了促进藻类生长，常需往培养池中充气，可利用育苗池的充气系统。但为了预防敌害生物通过空气污染藻液，空气在注入藻液之前最好经过空气过滤器或洗气装置。第三节 单细胞藻类的繁殖特性及影响藻类繁殖的因子一、一次性培养中单细胞藻类生长繁殖特性在一次性培养中，藻类的生长繁殖表现出一特定的模式曲线（图1），自接种后，藻类的生长繁殖可依次分成五个时期，依次为延缓期，指数生长期，相对生长下降期，静止期和死亡期。（一）、延缓期延缓期藻类的生长特点：接种后的短时间内藻类繁殖缓慢，细胞数无明显改变。为什么会出现延缓期，推测原因有三个：1、藻种质量问题。接

40、种的藻种来自不良环境或藻种“老化”，其新陈代谢慢，部分藻细胞酶活力低下，不能分裂繁殖，表现为群体细胞数目增加不明显。2、藻种数量问题。接种的藻种数量偏少，培养液中缺乏一定数量的由生活藻细胞自身产生的能够促生长繁殖的生物活性物质。3、新旧培养液成分的差异。藻类细胞由旧的环境转移到新环境中，所处的环境条件变化过大，此时藻细胞必须重建某些酶成分，以适应新的生长环境。（二）、指数生长期指数生长期藻类的生长特点：细胞迅速生长繁殖，藻细胞数量随培养时间的延长呈几何级数递增。其生长繁殖效率可用相对生长常数K表示。K=( ln NlnN0)/T影响藻类生长繁殖效率有：1、 培养条件。对于特定的藻类，在最适宜的

41、培养条件下，藻类具有最高的生长繁殖效率。2、 藻的品种。同一个品系的藻，在相同的培养条件下有基本恒定的K值。而不同的藻类或同一种藻的不同品系，在相同的培养条件下一般有不同的K值。图1 一次性培养中，单胞藻生长模式图1：延缓期；2：指数生长期；3：相对生长下降期；4：静止期；5：死亡期（三）、相对生长下降期相对生长下降期藻类的生长特点：藻细胞繁殖趋缓，细胞数量增加速度减慢。相对生长下降期产生的原因是随着培养时间的延长，培养液中产生了藻类生长限制因子，主要有以下几个方面：1、营养盐耗净。培养液中剩余的营养盐已不足以支持藻细胞继续快速生长繁殖。2、 二氧化碳供应不足。由于藻类的生长是通过光合作用利用

42、二氧化碳和水进行的，经过指数生长期之后，藻细胞密度增高，光合作用强，而二氧化碳的供应不足，限制了光合反应的进行，最终导致了藻细胞生长速度的下降。3、培养液酸碱度改变。由于藻类的生长需要利用水体中的二氧化碳才能有效进行光合作用，而藻细胞的呼吸作用是释放二氧化碳。二氧化碳在水体中还起到缓冲培养液酸碱度的作用。在藻细胞密度高的情况下，藻类呼吸作用和光合作用引起的pH的变化很明显，往往超出了藻细胞能够正常生长的耐受范围，最终使藻细胞的生长速度降慢。另外，由于培养液中某些特殊的营养盐成分被优先吸收，也会使培养液的pH发生变化，超出藻细胞正常的生长范围而影响藻的生长。如，当培养液中只添加硝酸钠作为氮源，藻

43、细胞大量吸收利用硝酸根，会使培养液的pH上升。相反，当只使用硫酸铵为氮源，藻细胞吸收利用铵根，使培养液的pH下降。4、藻类细胞浓度过密，光照不足。致使藻液内部的藻细胞不能获取足够的光照进行繁殖。导致整体增长速度减慢。5、藻类代谢废物的自体抑制。藻类生长过程中分泌的某些代谢产物在培养液中积累到一定浓度，对藻自身生长繁殖有抑制作用。在单细胞藻类的一次性培养过程中，由于上述限制因子的产生是必然的，因此指数生长期不能无限持续，藻类细胞的增长必然会进入相对生长下降期。（四）、静止期在相对生长下降期内，由于限制因子的作用不断增加，藻类生长逐渐下降，最终生长停止，进入静止期。在静止期，新生的藻细胞数和死亡的

44、藻细胞数趋于平衡，藻液中藻细胞数保持相对恒定。（五）、死亡期在死亡期内，藻细胞大量老化死亡，细胞数量迅速减少。不同的藻类及不同的培养条件，死亡期出现的时间有很大的差异。有些藻类（如小球藻）的静止期可持续几星期甚至几月，而另一些藻类（如有鞭毛金藻）在进入相对生长下降期后不久，即出现大量死亡。二、单细胞藻类生长繁殖特性在培养生产中的应用单细胞藻类一次性培养的生长特点，可用于指导实际的藻类培养工作。为了能够在有限的时间内培养出最大的藻细胞数量，如何缩短甚至消除藻类接种后出现延缓期，如何增加藻类在指数生长期的生长效率，如何延长指数生长期，推迟相对生长下降期的出现，是成功进行藻类培养必需面对的问题。（一

45、）、如何缩短或消除延缓期的出现1、缩短延缓期在藻类培养上的重要性单细胞藻类接种后延缓期的长短，很大程度上决定着随后培养的成败。接种后延缓期越短，接种培养成功的可能性越大。反之，若接种后藻细胞迟迟不能进入指数生长期，则培养失败的风险也越大。因此，生产上必需采取有效措施，来缩短甚至消除单胞藻接种后出现的延缓期。2、缩短或消除藻类接种后出现延缓期的措施，主要有三条：1） 选择处于新陈代谢快，生长旺盛（处于指数生长期）的藻细胞作藻种。2） 接种时保证藻种的浓度达到一定的数量，选择偏高浓度接种。3）选择合适的培养液（包括配方组成及营养盐浓度），减少新旧培养液之间的营养盐差异。（二）、如何增加指数生长期的

46、生长效率指数生长期藻类的生长效率，与藻的种类、品系和培养条件有关。因此，对于一特定的培养种类，要选择生长性能优良的品系，同时提供其生长的最佳环境和营养水平。（三）、如何延长指数生长期，推迟相对生长下降期出现根据培养中藻类相对生长下降期产生的原因，推迟相对生长下降期出现（即延长指数生长期）的措施可有：1、适时添加营养盐，保证培养液中充足的营养。2、人工充二氧化碳，保证藻液中二氧化碳不成为生长的限制因子。在生产中可间歇充含1%5%二氧化碳的混合空气，以达到补充二氧化碳的目的。3、定期检测并调整培养液的pH，使之处于藻类生长的适宜范围。4、增强光照强度，保证充足的光照。5、改变培养方式，变一次性培养为半连续培养，及时稀释培养液中的有自体抑制作用的代谢废物。三、影响单细胞藻类生长的环境因子单细胞藻类和其他生物一样，与生活环境有密切关系。影响培养单细胞藻类生长的外界环境因子主要有以下几个。（一）、光照单细胞藻类同所有绿色植物一样，只有在光照的条件下才能进行光合作用。光照是影响单胞藻生长繁殖最重要的因子之一。光照对单细胞藻类的影响通过光源、光质（光的波长）、光量（光照强度）、光周期和供光方式等途径来实现。（二）、温度在一定的温度范围内，某种单细胞藻类的生长繁殖等生命活动才能正常进行，这一温