卫生毒理学外源化学物质突变作用课件.ppt

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1、第七章 外源化学物质突变作用,卫生毒理学教研室2004.5,2,遗传毒理学,第一节 基本概念第二节 化学毒物致突变的类型第三节 致突变作用机制和后果第四节 机体对致突变作用的影响第五节 观察化学毒物致突变作用 的基本方法,3,基本概念,遗传毒理学(Genetic Toxicology)是毒理学的一个分支，研究外源化学物及其他环境因素对生物体遗传机构的损害作用及其规律。其主要目的是检测那些能引起DNA损伤的环境因素，研究其遗传毒作用的特点及对人类的潜在危害。,4,基本概念,突变(mutation) 遗传结构本身的变化及其引起的变异称为突变，突变实际上是遗传物质的一种可遗传的变异。 自发突变(sp

2、ontaneous mutation) 由于自然界中诱变剂的作用或由于偶然的自制、 转录、修复时的碱基配对错误所产生的突变。 诱发突变(induced mutation) 诱变剂诱发的突变。,5,致突变作用或诱变作用(mutagenesis) 广义概念是外来因素，特别是化学因子引起细胞核中的遗传物质发生改变的能力，而且此种改变可随同细胞分裂过程而传递。简单地说，突变的发生及其过程即为致突变作用。 化学诱变剂(chemical mutagen)基因突变(gene mutation) 一个或几个DNA碱基对的改变 染色体畸变(chromosome aberration) 染色体的结构及数目改变,基

3、本概念,6,DNA与基因: 基因(gene) 基因组(genosome) 染色质(chromatin)与染色体(chromosome) 体细胞(somatic cell)和生殖细胞(germ cell) 基因型(genotype)与表型(pheotype)细胞周期(cell cycle)、有丝分裂(mitosis)与减数分裂(meiosis),基本概念,7,基本概念,8,基本概念,9,基本概念,10,基本概念,11,基因突变（gene mutation）染色体畸变（chromosome aberration）非整倍体和多倍体 (aneuploidy and polyloid),化学毒物致突变的

4、类型,12,化学毒物致突变的类型,一、基因突变(gene mutation) 1碱基置换(basepair substitution) 指某一碱基配对性能改变或脱落所致的突变。 转换(transition) 颠换(transvertion) 2移码突变 (frameshift mutation) 指发生一对或几对（三对除外）的碱基减少或增加，以致从受损点开始碱基序列完全改变，形成错误的密码，并转译成为不正常的氨基酸。,13,一、基因突变(gene mutation),化学毒物致突变的类型,14,化学毒物致突变的类型,一、基因突变(gene mutation),15,二、染色体畸变(chromo

5、some aberration) 指染色体的结构改变 染色单体型畸变(chromatid-type aberration)染色体型畸变(chromosome aberration),化学毒物致突变的类型,16,染色体缺失及环状染色体的形成图,染色体插入和重复示意图,17,染色体的臂间倒位,染色体相互易位示意图,18,二、染色体畸变(chromosome aberration),化学毒物致突变的类型,19,三、基因组突变 1非整倍体 非整倍体(aneuploid)指细胞丢失或增加一条或几条染色体。缺失一条染色体时称为单体(monosome)，增加一条染色体时称为三体(trisome)。染色体数目

6、的改变会导致基因平衡的失调，可能影响细胞的生存或造成形态及功能上的异常。如21三体导致先天愚型(Down氏综合征)。2整倍体 整倍体(euploid)指染色体数目的异常是以染色体组为单位的增减，如形成三倍体(triploid)、四倍体(tetroploid)等。在人体，3n为69条染色体，4n为92条染色体。在肿瘤细胞及人类自然流产的胎儿细胞中可有三倍体细胞的存在。发生于生殖细胞的整倍体改变，几乎都是致死性的。,化学毒物致突变的类型,20,致突变作用的机制,一、DNA损伤与突变(一)碱基损伤1. 碱基错配2. 嵌入DNA链3. 碱基类似物的取代4. 碱基的化学结构改变或破坏,21,一、DNA损

7、伤与突变（二）DNA链受损 1. 二聚体的形成 2. DNA加合物（DNA adducts）形成 3. DNA-蛋白质交联物(DNA-Protein crosslinks，DPC)形成 二、引起突变的细胞分裂过程的改变三、其他的改变 对DNA合成和修复有关的酶系统作用可间接导致 DNA损伤，诱发基因突变或染色体畸变。,致突变作用的机制,22,突变的不良后果,23,一、机体修复DNA损伤的机制可分为两大类： 1.损伤耐受机制：指DNA遗传可绕过那些阻止DNA 复制的DNA损伤。 2. 修复机制：,DNA修复,直接修复,切除修复,O6甲基鸟嘌呤修复,光修复,错配碱基修复,碱基切除修复,核苷酸切除修

8、复,机体对致突变作用的影响,复制后修复,呼救性修复,24,机体对致突变作用的影响,二、遗传因素对致突变作用的影响： (一)代谢酶遗传多态性 (二)修复功能的个体差异,25,观察化学毒物致突变作用的基本方法,一、观察项目的选择 1观察的效应终点类型基因突变和染色体畸变的检测可直接反映化学毒物的致突变性，是评价化学毒物致突变性唯一可靠的方法。还有许多试验所观察到的现象并不反映基因突变、染色体畸变和染色体分离异常，而仅反映致突变过程中发生的其他事件。因此，将试验观察到的现象所反映的各种事件统称为遗传学终点(genetic endpoint)。,26,观察化学毒物致突变作用的基本方法,一、观察项目的选

9、择遗传学终点分为5类：DNA完整性的改变(形成加合物，断裂，交联)；DNA重排或交换；DNA碱基序列改变；染色体完整性改变；染色体分离改变。其中实际上指基因突变，指染色体畸变。,27,观察化学毒物致突变作用的基本方法,2成套的观察项目遗传毒理学评价程序通常为一组体内、外遗传毒理学试验。因为：化学毒物的种类和结构多种多样，其致突变的机制不尽相同，作用的靶细胞也不一样，有的是体细胞，或生殖细胞，或两者兼而有之，故在成套观察项目中既要用体细胞检测又要用生殖细胞；除了从分子水平还要从细胞水平来检测化学毒物的遗传毒性。致突变物中仅少数具有直接致突变作用，大多数为间接致突变作用，即需要在体内代谢活化后，才

10、具有致突变作用。体内试验具有完整的活化系统，而体外试验则通过加入模拟代谢系统，如S9来弥补缺乏活化系统的不足。这是体内与体外试验的主要差别。化学毒物的致突变性有强，也有弱；有的在某一检测系统中是强致突变物，而在另一系统中可能是弱的致突变物。对于弱致突变物在某些系统中比较容易漏检，即出现假阴性。,28,2成套的观察项目关于遗传毒理学成套观察项目中那些试验可入选的原则有：选择的遗传毒性试验应包括5种类型的遗传学终点。通常的实验材料有病毒、细菌、真菌、培养的哺乳细胞、植物、昆虫及哺乳动物等。体内试验与体外试验配合。应包括生殖细胞和体细胞。通常，对于一种受试物应当先用原核细胞或体细胞的体外试验按遗传学

11、终点合理配套进行试验，并对有阳性结果的遗传学终点验证其在体内的真实性，再行选用生殖细胞致突变试验进行遗传危害的评价。,观察化学毒物致突变作用的基本方法,29,二、常用的致突变试验 (一)细菌回复突变试验(Ames试验),鼠伤寒沙门氏菌原养型(his+),组氨酸营养缺陷型突变株。(his-),正向突变,回复突变,代谢活化系统,受试物,观察化学毒物致突变作用的基本方法,30,二、常用的致突变试验(二)微核试验 微核(Micronucleus)的产生与染色体损伤有关，是染色体或染色单体的无着丝点断片或纺锤丝受损伤而丢失的整个染色体，在细胞分裂后期遗留在细胞质中，末期之后，单独形成一个或几个规则的次核

12、，包含在子细胞的胞质内，因比主核小，故称微核。在细胞质中微核来源有二：断片或无着丝粒染色体在细胞分裂后期不能定向移动，而遗留在细胞质中；有丝分裂毒物的作用使个别染色体或带苔丝粒的染色体环和断片在细胞分裂后期被留在细胞质中。微核试验(Micronucleus test，MNT)是观察受试物能否产生微核的试验。其主要可检出DNA断裂剂和非整倍体诱变剂。,观察化学毒物致突变作用的基本方法,31,观察化学毒物致突变作用的基本方法,(二)微核试验,32,MN,NCE,观察化学毒物致突变作用的基本方法,33,二、常用的致突变试验(三)染色体畸变分析 (四)姐妹染色单体交换试验（SCE）,观察化学毒物致突变

13、作用的基本方法,34,二、常用的致突变试验(五)果蝇伴性隐性致死试验(六)显性致死试验(七)程序外DNA台成试验 (八)转基因动物致突变试验(九)哺乳动物细胞基因突变试验,观察化学毒物致突变作用的基本方法,35,三、致突变试验中的一些问题 (一)阴性和阳性对照的设立 1阴性对照 它是空白对照，即不加任何处理。或者是溶剂对照。阴性对照除了无处理因素外，与实验组完全相同。其目的是获得实验的基础数据。例如，Ames试验的阴性对照可了解所用的细菌的自发回复突变率；证实除处理因素外无任何使回复突变率增加或减少的因素。 2阳性对照 是用某种已知能产生阳性反应的物质作为对照。其目的是通过对阳性物质的试验证明

14、实验方法的可靠；验证实验者在本实验条件下，完成技术和鉴定致突变物的能力；证实经一段时间后，本实验的重复性。例如，Ames试验中阳性对照未出现阳性结果，应考虑突变菌株可能发生问题，另一种可能是代谢活化能力不足。所以，当阳性对照结果未呈阳性，其实验组的实验数据可靠性亦大大降低。,观察化学毒物致突变作用的基本方法,36,三、致突变试验中的一些问题(二)体外试验的活化系统 1哺乳动物细胞介导 使用完整的细胞，特别是大鼠肝原代细胞，与测试细菌或细胞一起培养。这也是一种活化系统。它有完整的细胞结构和各种酶及内源性辅助因子，代谢能力优于无细胞系统如S9，但不如体内活化系统。 2S9 S9指经酶诱导剂处理后制

15、备的肝匀浆，再经9000g离心分离所得上清液，加上适当的缓冲液和辅助因子。它主要含有混合功能氧化酶(MFO)，是国内常规应用于体外致突变试验的代谢活化系统，其缺点是S9随实验动物种属或器官不同而有差异；S9含有的大量亲核物质有可能影响试验的敏感性。 3纯化酶和基因工程 应用纯化细胞色素P-450、谷胱苷肽转移酶及过氧化物水解酶，可严格控制代谢产物诱发突变的条件，但技术难度大。利用基因工程，将人的细胞色素P-450基因，插入组合细胞内，用上述细胞进行致突变试验，使细胞具有代谢活化系统。,观察化学毒物致突变作用的基本方法,37,三、致突变试验中的一些问题(三)致突变试验与致癌试验的关系 已知大多数

16、化学致癌物具有致突变作用，遗传学改变在原癌基因激活和抑癌基因失活上起主要作用，致癌物诱致关键靶基因遗传改变的直接作用等在哺乳动物实验中证实。发现人类接触致癌物与DNA加合物，同其肿瘤中癌基因和抑癌基因的特异碱基对突变之间具有相关性。传统的长期致癌试验，花费大，周期长，不能适应化学物质快速增长的需要。此外，致癌试验所用动物数量有限，难以检出弱的致癌物。需要发展多种体内和体外短期试验，用于对化学物质致癌性进行筛检。,观察化学毒物致突变作用的基本方法,38,三、致突变试验中的一些问题(四)试验结果在毒理学安全性评价中的作用 阴性结果判定条件：最高剂量应包括受试物溶解度许可或灌胃量许可的最大剂量。如该

17、剂量毒性很大，则体内试验和细菌试验应为最大耐受量。使用哺乳动物细胞进行体外试验，常选LD50或LD80为最大剂量。溶解度大、毒性低的化学物，在细菌试验中可以5000g皿作为最高剂量。各剂量组的组间差距不应过大，以防漏检仅在非常狭窄范围内才有突变能力的某些化学毒物。满足上述条件，仍为阴性，才慎重下结论。,观察化学毒物致突变作用的基本方法,39,三、致突变试验中的一些问题(四)试验结果在毒理学安全性评价中的作用阳性结果应具有剂量反应关系，即随剂量增加，致突变作用增加；和在一组或多组的观察值与阴性对照比较有显著性差异。阳性结论，即表明受试物具有致突变性，而不同致突变试验的遗传学终点不同，其所表示的含

18、义不一。如基因突变是具有导致遗传性疾病的突变，DNA修复的实际后果尚不明确。,观察化学毒物致突变作用的基本方法,40,致突变试验举例,美国EPA毒物处(1936)提出了一个三阶段的试验方案，把遗传毒性检测和生殖细胞致突变性验证分阶段进行。第一阶段测试化学物的遗传毒性，包括Ames试验、体外哺乳动物细胞基因突变试验、体内骨髓染色体损伤试验(微核试验或染色体畸变试验)；第二阶段测试对生殖细胞的致突变作用；第三阶段为哺乳动物生殖细胞致突变性标准试验。在遗传危害性评价时，在体外基因突变试验中呈阳性的化学物应进行与哺乳类性腺DNA相互作用的试验，包括睾丸细胞的SCE、UDS、染色体畸变及碱性洗脱试验等，

19、也可进行显性致死试验，在第二阶段中出现阳性反应，需进行小鼠特异座位试验，可观察形态改变或生化改变；在体内骨髓细胞染色体畸变试验或微核试验中呈阳性的化学物需进行显性致死试验，在第二阶段中出现阳性反应，再进行小鼠可遗传易位试验。,41,致突变试验举例,国际协调组织(1CH)(1997)对于药品的遗传毒性评价建议的检测试验组合为细菌基因突变试验；体外哺乳动物细胞染色体畸变试验或体外小鼠淋巴瘤细胞比试验；体内啮齿类造血细胞染色体损伤试验(骨髓细胞染色体畸变试验或骨髓或外周血多染红细胞微核试验)。在对经标准试验组合得到的致突变作用结果进行进一步研究时，其他试验如DNA加合物测定、DNA链断裂检测、DNA

20、修复和重组试验等都可作为供选择的试验。对于在三项标准试验中为阴性的化学物，通常可认为其无遗传毒性作用。但对于构效关系显示有可能具致癌性或致突变性，但在三项标准试验中为阴性的化学物，还需要改进试验方法或再增加试验项目。对于在三项标准试验中为阴性，但致癌试验显示有致癌效应，又无明确的证据说明该化学物是通过非遗传毒性机制发挥作用时，为了了解其作用方式，可再进行改变代谢活化系统的体外试验或应用肿瘤发生的靶器官进行遗传损伤试验(如肝脏UDS试验、DNA加合物检测、转基因突变检测、肿瘤相关基因的遗传改变检测)。,42,致突变试验举例,我国卫生部在食品安全性毒理学评价程序(1994)中对遗传毒理学试验的要求

21、是：根据受试物的化学结构、理化性质以及对遗传物质作用终点的不同，并兼顾体外和体内试验 以及体细胞和生殖细胞的原则，在Ames路试验、小鼠骨髓微核试验或骨髓细胞染色体畸变试验、小鼠精子畸形试验和睾丸染色体畸变试验中选择四项，如其中一项试验为阳性，还应在其他备选试验(V79细胞HGPRT基因突变试验，显性致死试验，果蝇伴性隐性致死试验，UDS试验)中再选择两项试验进行。我国农药安全性毒理学评价程序(1991)中对遗传毒理学试验的要求则为：Ames试验和大肠杆菌回复突变试验，骨髓细胞微核试验或骨髓细胞染色体畸变试验，睾丸细胞染色体畸变试验或显性致死试验为必做项目，若有一项出现阳性，还需从精子畸形试验

22、、体外培养细胞染色体畸变试验、UDS、果蝇伴性隐性致死试验等试验中再选择两项进行。,第八章 外源化学物致癌作用chemical carcinogenesis,卫生毒理学教研室2004.5,44,1775年英国Pott 阴囊癌1895年德国Rehn 职业性膀胱癌1915年日本山极和市川 试验性皮肤癌1922年英国Kennway 动物皮肤癌1945年英国Case 职业性膀胱癌,45,肿瘤指有分裂潜能的细胞受致癌因素的作用后发生恶性转化和克隆性增生所形成的新生物，在人体任何部位、任何组织都可以发生肿瘤。化学致癌作用(chemical carcinogenesis)是指化学物质引起正常细胞发生恶性转化

23、并发展成肿瘤的过程。化学致癌物(chemical carcinogen)是指具有化学致癌作用的化学物质。,46,第一节 化学致癌机制第二节 化学致癌物的分类 第三节 观察化学毒物致癌作用的基本方法,47,第一节 化学致癌机制,一、化学致癌作用多因素、多基因参与的多阶段过程致癌过程有多个与癌肿有关的基因参与不同器官来源、不同组织类型、临床阶段以至同一种肿瘤在不同地区所见的遗传变化是不同的多种环境致癌物、致癌因子或条件可协同作用个体的不同遗传背景对肿瘤的发生发展有重要影响,48,二、与致癌作用有关的代谢活化与灭活： 前致癌物 近致癌物 终致癌物 Precarcinogens proximate c

24、arcinogens ultimate carcinogens,第一节 化学致癌机制,49,三、化学致癌作用的分子机制：（一）DNA加合物：（二）DNA修复与致癌过程：（三）癌基因、原癌基因和抑癌基因： 1、癌基因（oncogene）和原癌基因（proto-oncogene）： 2、抑癌基因（anti-oncogene）（四）基因表达调控异常与肿瘤的发生：,第一节 化学致癌机制,50,四、化学致癌过程：引发阶段 促长阶段 进展阶段（initiation） （promotion）（progression）,第一节 化学致癌机制,51,第一节 化学致癌机制,52,第二节 化学致癌物的分类,IARC

25、将化学物对人类致癌性资料(流行病学调查和病例报告)和对实验动物致癌性资料分为四级（2002，878）：组1，对人类是致癌物。对人类致癌性证据充分者属于本组。87组2，对人类是很可能或可能致癌物。又分为两组，即组2A和组2B。 组2A，对人类很可能(probably)是致癌物，指对人类致癌性证据有限，对实验动物致癌性证据充分。63 组2B，对人类是可能(possible)致癌物，指对人类致癌性证据有限，对实验动物致癌性证据并不充分；或指对人类致癌性证据不足，对实验动物致癌性证据充分。234组3，现有的证据不能对人类致癌性进行分类。493组4，对人类可能是非致癌物。1,53,根据致癌机制分类 1.

26、genotoxic carcinogens直接致癌物间接致癌物无机致癌物2.non- genotoxic carcinogens促长剂 激素调控剂细胞毒剂 过氧化物酶体增殖剂免疫抑制剂 固态物质3.未分类：美舍吡伦,第二节 化学致癌物的分类,54,一、用于致癌物筛选的短期试验（一）致突变试验：基因突变试验：鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验(Ames试验);染色体畸变试验：体外细胞系细胞遗传学分析，小鼠骨髓微核试验，大鼠骨髓染色体畸变试验;原发性DNA损伤：DNA加合物，链断裂，DNA修复诱导(细菌SOS反应，大鼠肝UDS诱导)，SCE试验；体外细胞转化：叙利亚地鼠胚胎细胞，Balb/c 3T3细胞。

27、,第三节 观察化学毒物致癌作用的基本方法,55,一、用于致癌物筛选的短期试验：（二）哺乳动物短期致癌试验： 哺乳动物短期致癌试验又称为有限体内试验，指时间有限(数月)，靶器官有限。较受重视的短期致癌试验有下列四种：1小鼠皮肤肿瘤诱发试验：于小鼠皮肤局部连续涂抹受试物，以观察皮肤乳头瘤和癌的发生，一般20周可结束实验，较敏感的小鼠为SENCAR小鼠。此试验也可设计为检测受试物的引发活性或促长活性。典型的引发剂为致癌性多环芳烃，促长剂为佛波醇酯(TPA)。2小鼠肺瘤诱发试验：染毒途径常用腹腔注射，也可灌胃或吸入，一般30周可结束实验，观察肺肿瘤的发生。较敏感的小鼠为A系小鼠。此试验也可设计)b检测

28、受试物的引发活性或促长活性。典型的引发剂为乌拉坦，促长剂为二丁基经基甲苯(BHT)。,第三节 观察化学毒物致癌作用的基本方法,56,3大鼠肝转化灶诱发试验。对大鼠进行肝大部切除术后，给以受试物，一般可在814周结束实验，观察肝转化灶生成。肝转化灶是癌前病变，有-谷氨酰转肽酶活性升高，G6P酶和ATP酶活性降低，以及铁摄取能力降低。转化灶可用组织化学或免疫化学方法鉴定。此试验也可设计为检测受试物的引发活性或促长活性。典型的引发剂为二乙基亚硝胺(DEN)，促长剂为苯巴比妥(PB)。4雌性大鼠乳腺癌诱发试验，一般可用SD大鼠(或Wistar大鼠)，实验周期为6个月。 此四个试验不是成组试验，应根据受

29、试物的特点选择使用。此四个试验任一试验得到阳性结果的意义与长期动物致癌试验相似，但阴性结果并不能排除受试物的致癌性。,第三节 观察化学毒物致癌作用的基本方法,57,一、用于致癌物筛选的短期试验：（二）哺乳动物短期致癌试验：何时应考虑进行致癌性评价：人体可能长期暴露于该化学物；该化学物或其代谢物的化学结构与已知致癌物相似；反复染毒毒性试验提示该化学物可能产生癌前病变。如在3种遗传毒理学短期试验均得到阳性结果，可预测为遗传毒性致癌物；如在3种遗传毒理学短期试验均得到阴性结果，可预测为非遗传毒性非致癌物；如经5种遗传毒理学短期试验仍不能预测其致癌性的化学品，应优先进行哺乳动物致癌试验。,第三节 观察

30、化学毒物致癌作用的基本方法,58,ICH(1995)根据已知的危险因素、拟定的适应症和用药时间，提出下列进行新药致癌性研究的范围，避免不必要的试验。临床上连续应用6个月以上的药品；对慢性或复发性疾病需间断性长期反复治疗的药品；造成长期暴露的给药系统。已知属于对人具有潜在致癌性的同类化合物；构效关系提示具有致癌危险性的物质3长期毒性试验发现癌前病变3原型或代谢产物在组织内长期蓄积，引起局部组织反应或其他病理生理反应的物质。具有遗传毒性的物质往往具有致癌性，如拟长期使用，应进行慢性毒性试验(1年)，检测早期致癌反应。拟用于病人预期寿命少于3年的药品不必进行致癌试验，如肿瘤治疗药等。,第三节 观察化

31、学毒物致癌作用的基本方法,59,局部使用吸收很差的药物不必进行经口致癌试验。 已具有致癌性资料的药物的各种酸、碱、盐应提供其在药物动力学、药效学或安全性方面没有明显改变的证据，对于酯和复杂的衍生物在确定是否需要进行致癌试验时也应有类似的资料，并应个案讨论。 基本作为替代治疗的内源性物质不需要进行致癌试验。但对生物技术制品，下列情况可考虑进行致癌试验：生物学作用明显不同于天然相应物质的制品；结构明显不同于天然相应物质的制品；在人体引起局部或全身浓度明显增加的制品。,第三节 观察化学毒物致癌作用的基本方法,60,第三节 观察化学毒物致癌作用的基本方法,二、哺乳动物长期致癌试验：（一）试验动物 物种

32、和品系：要求用两种实验动物，常规选用大鼠和小鼠，也可用仓鼠。啮齿类动物对多数致癌物易感性较高，寿命相对较短，费用也较低，生理和病理学资料较完备，因此使用最广泛。在选择品系时应选择较敏感、自发肿瘤率低、生活力强及寿命较长的品系。 性别：为接近人类情况，应使用同等数量的雌雄两种性别的动物。年龄：使用刚断乳的动物，以保证有足够长的染毒和发生癌症的时间，而且幼年动物解毒酶及免疫系统尚未完善，对致癌作用比较敏感。,61,（二）剂量选择和动物数量 致癌试验一般设三个试验组。美国NCI推荐以最大耐受剂量(MTD)为高剂量。最大耐受剂量是由90天毒性试验来确定的，此剂量应使动物体重减轻不超过对照组的10，并且

33、不引起死亡及导致缩短寿命的中毒症状或病理损伤。ICH(1995)提出，高剂量选择可以根据：毒性终点，即最大耐受剂量(MTD);药代动力学终点，啮齿动物血浆AUC(时量曲线下面积)为人的25倍；选择吸收饱和剂量;药效学终点，不应产生生理学和内稳态紊乱;最大可行剂量，受试物在饲料中最高含量为5。限制剂量为1500mg(kg体重d)。,第三节 观察化学毒物致癌作用的基本方法,62,（二）剂量选择和动物数量中及低剂量组则按等比级数下推，如分别为上一个剂量水平的1/2或1/3。低剂量组应不影响动物的正常生长、发育和寿命，即不产生任何毒性效应。但低剂量组应高于人的接触剂量，一般不低于高剂量的10。中剂量组

34、介于高、低剂量之间，如有可能按受试物的毒物动力学性质来确定。对照组除不给受试物外，其他条件均与试验组相同。同时应设阴性(溶剂或赋形剂)对照组。必要时可设阳性对照组，阳性致癌物最好与受试物的化学结构相近。动物数量：每组至少有雌雄各50只动物，希望在出现第一个肿瘤时，每组还有不少于25只动物。,第三节 观察化学毒物致癌作用的基本方法,63,第三节 观察化学毒物致癌作用的基本方法,64,（三）染毒途径 经口染毒是将受试物给予实验动物的常用途径，一般把受试物掺人饲料或饮水中连续给予动物(57天/周)。若掺入后的适口性不良，可用灌胃法。掺入浓度要定期监测，观察其均匀性和稳定性，掺入的浓度一般不超过5。经

35、皮染毒，涂敷受试物的面积一般不少于动物体表总面积的10。必须保证受试物与皮肤良好接触，并防止动物舔食。每天涂抹一次，每周37次。吸入染毒，每天染毒4小时，每周57天。染毒柜内受试物浓度应定期或连续监测，其分布应均匀、恒定。其他注射途径可根据需要采用。,第三节 观察化学毒物致癌作用的基本方法,65,（四）试验期限 ICH(1997)建议参考下面几条准则：(1)一般情况下，试验期限小鼠和仓鼠应为18个月，大鼠为24个月；然而对于某些生命期较长或自发肿瘤率低的动物品系，小鼠和仓鼠可持续24个月，大鼠可持续30个月。(2)当最低剂量组或对照组存活的动物只有25时，也可以结束试验，对于有明显性别差异的试

36、验，则试验结束的时间对不同的性别应有所不同，在某种情况下因明显的毒性作用，只造成高剂量组动物过早死亡，此时不应结束试验。 一个合格的阴性对照试验应符合下列标准：因自溶、同类自食，或因管理问题所造成的动物损失在任何一组都不能高于10。小鼠和仓鼠在18个月，大鼠在24个月时各组存活的动物不能少于50。,第三节 观察化学毒物致癌作用的基本方法,66,（五）观察和结果分析 1一般观察 每天观察受试动物一次，主要观察其外表、活动、摄食情况等。在实验最初三个月每周称体重一次，以后每两周称体重一次。经饲料或饮水给以受试物时，应记录食物消耗量或饮水量，以计算受试物的摄入量。观察时要注意有无肿瘤出现、肿瘤出现时

37、间及死亡时间。老年动物多病易死，应加强巡视，防止动物死亡后未及时刻验，发生尸体组织自溶。 2病理检查 动物自然死亡或处死后必须及时进行病理检查，包括肉眼和组织切片检查。组织切片检查应包括已出现肿瘤或可疑肿瘤的器官和肉眼检查有明显病变的器官，应注意观察癌前病变。通过病理检查确定肿瘤的性质和靶器官。,第三节 观察化学毒物致癌作用的基本方法,67,（五）观察和结果分析3结果分析 统计各种肿瘤的数量(包括良性和恶性肿瘤)及任何少见的肿瘤、患肿瘤的动物数、每只动物的肿瘤数及肿瘤潜伏期。肿瘤发生率()(实验结束时患肿瘤动物总数/有效动物总数)100 式中，有效动物总数指最早发现肿瘤时存活动物总数。肿瘤潜伏

38、期即从摄入受试物起到发现肿瘤的时间，因为内脏肿瘤不易觉察，通常将肿瘤引起该动物死亡的时间定为发生肿瘤的时间。应对试验结果进行仔细的统计学分析，并研究剂量反应关系。,第三节 观察化学毒物致癌作用的基本方法,68,致癌试验阳性的判定标准WHO(1969)：(1)对于对照组也出现的一种或数种肿瘤，试验组肿瘤发生率增加；(2)试验组发生对照组没有的肿瘤类型；(3)试验组肿瘤发生早于对照组；(4)与对照组比较，试验组每个动物的平均肿瘤数增加。 在进行试验的两个物种两种性别动物中，有一种结果为阳性，即认为该受试物有致癌性。两个物种两种性别动物试验结果均为阴性时，方能认为未观察到致癌作用。,第三节 观察化学

39、毒物致癌作用的基本方法,69,第三节 观察化学毒物致癌作用的基本方法,结果报告：应着重报告发现肿瘤的部位、数量、性质、癌前病变，以及其他毒性效应；应报告剂量反应关系及统计学分析结果。如在动物组织中观察到良性和恶性肿瘤，并有良性肿瘤向恶性化进展的证据，在进行统计学分析之前将良性和恶性肿瘤合并是适宜的，但仍希望分别对良性和恶性肿瘤分别进行统计学处理。评价该试验不同剂量良性肿瘤和恶性肿瘤的相对数量可有助于确定该受试动物对受试物的剂量反应关系。另一方面，如果仅观察到良性肿瘤，并无恶性化进展的证据，则将此受试物认为是致癌物是不适宜的，此仅提示在该试验条件下需要进一步研究。,70,三、人群流行病学观察：（

40、一）接触标记 （二）生物效应标记 （三）敏感性标记,第三节 观察化学毒物致癌作用的基本方法,71,第三节 观察化学毒物致癌作用的基本方法,四、转基因小鼠在致癌作用的研究 1转癌基因小鼠。与转录启动子连接的癌基因转入后可直接在某些特定的组织中高效表达，使该组织细胞处于引发状态，这类转基因动物是研究化学物致癌作用的敏感体系。携带癌基因的转基因动物可用于致癌试验，试验周期仅3个月左右，有希望发展成代替长期动物致癌试验的试验系统。这些携带有癌基因的转基因动物，可用来研究外源化学物与肿瘤相关基因的作用及外源化学物在致癌不同阶段中的作用机制。以各种组织特异性的促长剂处理转入不同癌基因的小鼠，可为致癌过程的

41、研究提供新线索。,72,四、转基因小鼠在致癌作用的研究：2肿瘤抑制基因敲除小鼠。在P53-/-小鼠，肿瘤(特别是淋巴肉瘤)的发生比正常小鼠(P53+/+)增加而且提前。由于P53-/-小鼠的肿瘤发生具有组织特异性，进一步研究这些肿瘤的遗传学基础有助于鉴定P53基因的功能。而半合子小鼠(P53+/-)在出生后6个月内自发癌发生率低，但在之后发生淋巴瘤和软组织肉瘤，其中大部分丢失P53野生型等位基因。这种小鼠对遗传毒性致癌物敏感性并不增加。这种半合子小鼠也可用于鉴定致癌过程中的协作基因。而且缺P53小鼠加速形成恶性肿瘤，提示此基因主要在进展阶段起作用。P53在肿瘤发生中的作用有待进一步研究。,第三节 观察化学毒物致癌作用的基本方法,73,四、转基因小鼠在致癌作用的研究：3转穿梭质粒的转基因动物小鼠：转入带有报告基因的穿梭载体，是研究体内基因突变的转基因动物模型。常用的靶基因如lacI、lacZ可通过噬菌体体外包装等方法，从小鼠基因组内回收，再在大肠杆菌内检测靶基因突变，可为研究不同器官基因的自发突变和诱发突变的分子机制提供有效的方法 。,第三节 观察化学毒物致癌作用的基本方法,