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1、植物病原细菌研究方法,植物保护学研究方法系列专题,内容提纲：,细菌的基本形态特征常规细菌生理生化检测方法细菌种类鉴定方法植物病原细菌检测和细菌病害诊断方法有益细菌的利用研究,细菌的基本形态特征,细菌（bacteria）是单细胞原核微生物，个体微小，形态简单，以二等分裂方式繁殖。在自然界中，细菌分布最广、数量最多。,细菌的形态和大小细菌的细胞结构细菌的繁殖与群体形态,（一）细菌的大小,细菌大小的测定：(1)测量： 测微尺(2)长度单位：微米(m)(3)表示： 球菌：直径 杆菌： 宽长 螺菌： 宽、长、螺距,通常球菌直径：0.2 1.5 m， 杆菌:长1 5 m, 宽0.5 1 m。例如：大肠杆菌
2、：平均长度：2 m ； 宽度0.5m 1500个大肠杆菌头尾相接等于3mm; 109个大肠杆菌重1 mg. 由于菌种不同，细菌的大小存在很大的差异；对于同一个菌种，细胞的大小也常随着菌龄变化。另外，对于同一个菌种染色前后其细胞大小都有所不同。所以，有关细菌大小的记载，常是平均值或代表性数值。,细菌细胞的大小,（二）、 细菌的形态,不同细菌的形态可以说是千差万别，丰富多彩，但就单个有机体而言，其基本形态可分为球状、杆状与螺旋状三种. 除了球菌、杆菌、蛆旋菌三种基本形态外，还有许多具其他形态的细菌。例如柄杆菌细胞上有柄、菌丝、附器等细胞质伸出物，细胞呈杆状或梭状，并有特征性的细柄；球衣菌能形成衣峭
3、，杆状的细胞呈链状排列在衣鞘内而成为丝状,而支原体由于只有细胞膜，没有纫胞壁，故细胞柔软，形态多变，具有高度多形性。另外，人们还发现了细胞呈星形和方形的细菌。,球状、杆状和螺旋状,细菌的三种基本形态:,1. 球 菌,单球菌,双球菌,链球菌,四联球菌,八叠球菌,葡萄球菌,2.杆菌 杆菌是细菌中种类最多的类型,因菌种不同,菌体细胞的长短、粗细等都有所差异。 杆菌的形态：短杆状、长杆状、棒杆状、梭状、梭杆状、月亮状、分枝状、竹节状等；按杆菌细胞的排列方式则有链状、栅状、“八”字状以及有鞘衣的丝状等。,2.杆 菌,短杆菌,长杆菌,梭状芽孢杆菌,链状杆菌,单杆菌,2.杆 菌,杆菌细胞两端的形态特征,2.
4、杆 菌,3、螺旋菌螺旋状的细菌称为螺旋菌。根据其弯曲情况分为：弧菌：螺旋不满一圈，菌体呈弧形或逗号形 例：霍乱弧菌、逗号弧菌螺旋菌：螺旋满26环，螺旋状 例：干酪螺菌 螺旋体：旋转周数在6环以上，菌体柔软。 例：梅毒密螺旋体,螺旋菌,弧菌,螺旋体,3、螺旋菌,细菌的特殊形态： 柄细菌、肾形菌、臂微菌、网格硫细 菌、贝日阿托氏菌(丝状)、具有子实体的粘细菌、三角形、方形等特殊形态的细菌。,细菌的特殊形态,二、细菌的细胞结构,基本结构包括：细胞壁、细胞膜、细胞质、核区、间体、核糖体、气泡和储藏物。 特殊结构包括：荚膜、鞭毛、纤毛、芽孢。,细菌细胞结构,1.固体斜面培养 2. 液体培养基 3. 半固
5、体培养,植物病原细菌概述 绝大多数为好气性细菌；生长温度大多为25-28，少数可以20或在35中（如青枯菌）生长。 植物病原细菌都不产生芽孢，因此对高温比较敏感，一般在50左右的热水中处理10分钟即失活，适宜的pH为6-7。,植物病原细菌的革兰氏染色（细菌的革兰氏染色反应是细菌分类鉴定的一个重要特征）,常规细菌生理生化检测方法,细菌细胞壁的结构,革兰氏阳性菌细胞壁：由肽聚糖和磷壁酸组成,磷壁酸：占40%。G+菌所特有,其主链由数十个磷酸甘油或磷酸核糖醇组成,有的还有由DAla和还原糖组成的侧链。,肽聚糖:占3070% ,不同菌种中肽聚糖(肽链)组分不同。,革兰氏阴性菌细胞壁：分内壁层和外壁层。
6、,内壁层：紧贴胞膜,仅由12层肽聚糖分子构成,占细胞壁干重5-10%,无磷壁酸。,外壁层：位于肽聚糖层的外部。 脂多糖; 脂蛋白、 包括: 蛋白质层: 基质蛋白、 外壁蛋白; 磷脂.,革兰氏染色的原理,革兰氏染色原理：第一步：结晶紫使菌体着上紫色；第二步：碘和结晶紫形成大分子复合物，分子大，能被细胞壁阻留在细胞内；第三步：酒精脱色，细胞壁成分和构造不同，出现不同的反应；G+ 菌：细胞壁厚，肽聚糖含量高，交联度大，当乙醇脱色时，肽聚糖因脱水而孔径缩小，故结晶紫-碘复合物被阻留在细胞内，细胞不能被酒精脱色，仍呈紫色；G菌：肽聚糖层薄，交联松散，乙醇脱色不能使其结构收缩，因其含脂量高,乙醇将脂溶解，
7、缝隙加大，结晶紫-碘复合物溶出细胞壁，酒精将细胞脱色，细胞无色，沙黄复染后呈红色。,革兰氏染色法是细菌细胞的复合染色法，由丹麦医生Hans Christian Gram于1884年创立。基本步骤： 涂片固定 结晶紫初染1min 碘液媒染1min95%乙醇脱色0.5min 番红复染min 结果: 革兰氏阳性菌紫色； 革兰氏阴性菌红色。,革兰氏染色法：,实验材料 待测细菌 枯草芽孢杆菌（G+） 甘蓝黑腐病菌（G-） 染液：结晶紫草酸铵染剂、鲁戈尔碘液、复染剂（番红O） 用具：移植饵、清洁无脂载玻片,清洁无脂载玻片,阳性对照菌（紫色或蓝黑色）,待 测 菌,阴性对照菌（红色）,示范图,对照菌呈现正确颜
8、色，实验才为成功,涂片,干燥,固定,染色1min,水洗、吸干,镜检,简单染色,制备涂片标本染色,阳性菌,阴性菌,革兰氏染色法,革兰氏染色阴性大肠杆菌,革兰氏染色阳性枯草芽孢杆菌,注： （1）、实验细菌为活跃生长期的培养物； （2）、菌液不能太浓，涂片不宜过厚，造成假阳性； （3）、火焰固定涂片，以载玻片不烫手为宜； （4）、脱色时间把握好，过长，假阴性；过短，假阳性。,鞭毛：某些细菌表面由细胞内生出的细长、波曲、毛发状的结构。鞭毛具有运动功能，一般认为鞭毛靠鞭毛丝旋转而动，它们是细菌的“运动器官”。鞭毛的长度：一般为1520 m，最长可达70 m 。鞭毛的直径：为0.010.02 m. 不同细
9、菌的鞭毛数目和着生位置不同，鞭毛数目一般一至数十条。,细菌鞭毛染色,鞭毛的着生方式：,周生,鞭毛的化学组成： 主要由鞭毛蛋白构成，还含有少量的多糖、脂类和核酸等。鞭毛起源于细胞质膜内侧的基粒。 细胞质区内有一个颗粒状小体，此小体为基粒，鞭毛自基粒长出穿过细胞壁延伸到细胞外部。,鞭毛的结构： 鞭毛丝鞭毛 鞭毛钩 基体,鞭毛的观察：电镜特殊鞭毛染色，在光学显微镜下观察半固体穿刺培养从固体培养基上的菌落形态判断一般情况下： 菌落形状大，薄且不规则，边缘极不平整，可能有鞭毛。菌落十分圆滑，边缘平整且相对较厚，可能没有鞭毛。,实验菌种及药品 1菌种：枯草芽孢杆菌 2染液 染液A： 单宁酸 5.0g 氯化
10、铁（Fecl36H2O） 1.5g 福尔马林（15） 2.0ml （15%福尔马林：40%甲醛4ml+蒸馏水6ml） NaOH(1%) 1.0ml 蒸馏水 100ml 染液B： 硝酸银 2g 蒸馏水 100ml,三、染色方法： 银盐染色法,硝酸银溶于蒸馏水中。取10ml作回滴用，向其余90ml硝酸银溶液中逐滴加浓氢氧化铵，先形成很浓的沉淀，再继续滴加浓氢氧化铵至沉淀消失为止。然后慢慢滴入备用的硝酸银溶液则出现少量雾状沉淀，但轻轻摇动后，沉淀又消失，再滴入硝酸银溶液，直到摇动后雾状沉淀不再消失为止。此液不耐保存，4小时内染色效果最佳。,四、鞭毛染色步骤：,（1）将菌株在NA斜面上于30恒温箱中培
11、养17-20小时，取出，沿壁管轻轻加入3-5ml的灭菌水掩盖斜面菌苔。斜放静置10分钟，使细菌自然游出，勿摇动，备用。 （2）用移植环取菌悬液于无划痕的无脂玻片上，倾斜玻片，使之成带状，将玻片在空气中自然风干。 （3）滴加染液A于干燥的涂片上，覆盖涂片，染色10-13分钟，倾去染液，用蒸馏水充分洗去染液；风干后，再滴加染液B覆盖涂片染色30秒至1分钟，立即用蒸馏水冲洗，放于空气中干燥，在高倍镜或油镜下镜检。 （4）在金色背景下，细菌鞭毛深褐色到黑色，菌体浅褐色。,菌体,鞭毛,菌体,鞭毛,菌体,鞭毛,芽孢 概念：某些菌生长到一定阶段，细胞内形成一个圆形、椭圆形或卵圆形的内生孢子，是对不良环境有较
12、强抵抗力的休眠体。,芽孢,能形成芽孢的细菌种类： 在杆菌中能形成芽孢的种类较多，在球菌和螺旋菌中只有少数菌种可形成芽孢。产生芽孢的几个属：芽孢杆菌属梭状芽孢杆菌属芽孢乳杆菌属生孢八叠球菌属（其中的一个种）,芽孢的形态及其在细胞中的位置：,A 近中央,B 末端,C 中央,细菌芽孢的各种类型,芽孢的组成和结构 芽孢有多层结构，主要包括孢外壁、芽孢衣、皮层和核心.,芽孢的结构,芽孢的外壁层厚而致密，主要成分为脂蛋白，通透性差,不易着色。核心含有大量的DNA、RNA、蛋白质酶等物质，还含有2,6吡啶二羧酸（DPA）,DPA是芽孢特有的成分。一般以 DPACa的形式存在。皮层主要含芽孢肽聚糖、 DPAC
13、a，皮层体积大，比较致密。芽孢平均含水量低,约40%.,芽孢的特性:具有很强的抗热、抗干燥、抗辐射、抗化学药物能力。 含水量低、壁厚而致密，通透性差,不易着色。新陈代谢几乎停止，处于休眠状态。一个芽孢萌发产生一个个体。芽孢的抗热机制： 目前尚不清楚，但可能与以下因素有关，如含水量低、壁厚而致密，芽孢中的酶分子量小，比较耐热。,芽孢染色（孔雀绿藏红染色） 染剂 孔雀绿水溶液 5 染剂 藏红水溶液 0.5 或 碱性品红水溶液 0.05染色方法： 1、涂片固定； 2、加染剂在酒精灯火焰上加热染色1min，勿使染液沸腾和干燥； 3、水洗； 4、染剂染色15s； 5、水洗，风干后镜检。菌体染成红色，芽孢
14、染成绿色。,芽孢,菌体,常规鉴定方法全自动微生物鉴定仪-Biolog,植物病原细菌的鉴定方法,菌落特征比较,常规细菌鉴定方法,参考：东秀珠等，常见细菌系统鉴定手册，科学出版社，2001,全自动微生物鉴定仪-Biolog,鉴定原理 Biolog公司独创的碳源利用方法，利用微生物对不同碳源代谢率的差异，针对每一类微生物筛选95种不同碳源，配合四唑类显色物质（如TTC、TV），固定于96孔板上（A1孔为阴性对照），接种菌悬液后培养一定时间，通过检测微生物细胞利用不同碳源进行新陈代谢过程中产生的氧化还原酶与显色物质发生反应而导致的颜色变化（吸光度）以及由于微生物生长造成的浊度差异（浊度），与标准菌株数
15、据库进行比对，即可得出最终鉴定结果。,主要特点 快速读取结果 鉴定板由读数仪自动读取吸光值，软件将该吸光值与数据库对比，就可在瞬时给出鉴定结果。试验结果可由系统进行自动分析、记录和打印。 强大的数据库 Biolog微生物鉴定数据库容量是目前世界上最大的，可鉴定包括细菌、酵母和丝状真菌在内总计1973种微生物，几乎涵盖了所有的人类、动物、植物病原菌以及食品和环境微生物。,BIOLOG在植物病原菌鉴定方面 可鉴定常见的假单胞菌(Pseudomonas,77种)、伯克霍尔德菌(Burkholderia)、黄单孢菌属(Xanthomonas)、果胶杆菌属(Pectobacterium)、食酸菌属(Ac
16、idovorax)、根瘤菌属(Rhizobium)等近200种植物致病菌，特别适合各农业大学、研究所及相关机构进行植物病理分析和研究用。,BIOLOG在食品工业应用及研究领域提供大量的数据库，包括70多种乳酸菌、30多种双歧杆菌及各类常见的食品必检的致病菌数据库，包括沙门氏菌、李斯特菌、大肠杆菌(含阪崎肠杆菌)、葡萄球菌、弯曲菌、假单胞菌、弧菌、梭菌、志贺氏菌等，用于食品、药品及化妆品行业用于致病微生物鉴定、工业应用微生物研究、质量控制及产品研发等。,BIOLOG专门分开提供一个DP(危险微生物)数据库，包含鼠疫耶尔森氏菌、炭疽芽胞杆菌、马尔他布鲁氏菌、土拉弗朗西斯菌、鼻疽伯克霍尔德氏菌(鼻疽
17、假单孢菌)、类鼻疽伯克霍尔德氏菌、苏云金芽孢杆菌、假结核耶尔森氏菌、蜡样芽胞杆菌等12种强致病微生物，适用于国家疾病控制中心、国家安全机构及军事机构用于生物武器检测及防治研究。目前广泛用于美国军方进行生物恐怖检测及预防研究。,鉴定初始首先按常规微生物操作方法分离出纯种。,鉴定步骤如下：第一步用Biolog专用培养基将纯种扩大培养。第二步按要求配制一定浊度(细胞浓度)的菌悬液。第三步将菌悬液接种至微孔鉴定板(Microplate)，培养一定时间。第四步将培养后的鉴定板放入读数仪中读数，软件自动给出鉴定结果。,植物病原细菌检测和细菌病害诊断方法,一、症状特征,十字花科软腐病,瓜萎蔫病,肿瘤,由细菌
18、侵染所致病害的病部，无论是维管束系统受害的，还是薄壁组织受害的，都可以在徒手切片中看到有大量细菌从病部喷出，这种现象称为菌溢现象(bacteria exudation，BE)。菌溢现象为细菌病害特有，是区分细菌病害或真菌、病毒病害的最简便的手段之一。,二、显微镜检查 （菌溢现象）,菌溢现象操作方法,细菌病害的病组织，内含有大量菌体，可通过菌溢现象或诊断，具体方法：取病健组织交界部位一小块，置于截玻片上。加一滴无菌水后，加盖玻片。低倍镜下，暗光，观察。可看到病斑切口处有大量细菌云雾状涌出。,菌溢现象,1、凝集反应 颗粒性抗原如细菌与其特异性抗体在电解质影响下，很快结合成可见的凝集块。 载玻片凝集
19、反应是最快速的测定方法：在清洁载玻片上加两滴生理盐水配的菌悬液，用移植环取少量抗血清与其中一滴菌悬液混合，另一滴不加血清作为对照。经35分钟，可以看到原来均匀悬浮的细菌凝集成团，对照则不发生这种变化。 另一种常用方法是试管凝集反应，虽然没有玻片凝集反应快捷，但能测定血清效价和作定量研究。,分子生物学检测技术,2、酶联免疫吸附法 （Enzyme linked immune sorbent assay, ELISA）,该方法是将微量的酶与测定的抗原或抗体结合，大大的提高抗原和抗体反应的灵敏度。 抗体夹心ELISA法通常比其他ELISA方法敏感25倍。 先用抗体包被聚苯乙烯微量滴定板孔，然后加测定抗
20、原样本，抗原被抗体吸附，然后将酶联抗体加在被吸附的抗原上。最后再加酶的底物，酶催化底物而显色，用分光光度计检测。,4、核酸杂交及PCR诊断技术,利用核酸链间碱基配对核酸杂交来识别特定核酸顺序的方法。 将一个预先分离纯化或合成的已知核酸序列片段，加以标记，就成为核酸探针(probe)。 用核酸探针可以探测待查标本核酸中与探针具有互补的碱基顺序。 如果两者有互补顺序则杂交成功, 结果阳性; 若待查标本核酸与探针顺序无关则杂交失败, 结果呈阴性。由于大多数植物病毒的核酸是RNA, 其探针为互补DNA (complementary DNA, cDNA)，称为cDNA探针。,4.1 核酸杂交,核酸杂交,
21、4.2 PCR诊断技术,聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction, PCR）是一种体外扩增特异性DNA的技术，在短时间内可以大量扩增核酸。整个扩增包括3个重复的步骤：（1）DNA热变性，双链变单链；（2）引物退火，当温度降低时，两个引物分别结合到靶DNA的两条链的3末端，（3）引物延伸，在DNA聚合酶的催化下，引物由53扩增延长。分别和相对的DNA链互补。,Real-time fluorescent PCRREP-PCRImmuno-PCRRAPD-PCRNested-PCR,在植物病原细菌检测和鉴定中应用的PCR技术,三、分离培养与致病性测定 培养基稀释法或划线法培
22、养。观察单个菌落特点。 将分离的细菌接种于寄主植物或过敏性发应植物，观察所得症状，从而完成柯赫氏法则的诊断程序。,四、链霉素防治,植物病原细菌对链霉素敏感，可用于防治细菌病害。,三、植物病原细菌的主要类群及分类地位,五界生物分类系统，细菌属于原核生物界。 参考：伯杰氏系统细菌手册,四、主要属,长期以来，植物病原细菌仅限于5个属： 土壤杆菌属（Agrobacterium）欧氏杆菌属（Erwinia） 假单胞杆菌属（Pseudomonas） 黄单胞杆菌属（Xanthomonas） 棒形杆菌属（Clavibacter）,五属细菌分类检索表,A.革兰氏染色阳性，一般不能游动棒形杆菌属（Clavibac
23、ter）AA.革兰氏染色阴性，能游动。 B.鞭毛极生 C.鞭毛一般多条，在培养基上产生水溶性黄绿色或蓝绿色色素假单胞杆菌属（Pseudomonas） CC.鞭毛一般单条，在培养基上产生非水溶性色素黄假胞杆菌属（Xanthomonas） BB.鞭毛周生 C.鞭毛14条，引起肿瘤土壤杆菌属（Agrobacterium） CC.鞭毛多条，引致腐烂或萎蔫欧氏杆菌属（Erwinia）,供试菌株,革兰氏反应阳性,杆菌或球菌,形成丝状细胞,Streptomyces（链霉菌属）,形成芽孢,36生长，在7NaCl中生长,Curtobacterium短小杆菌属,尿酶,Rhodococcus红球菌属,Claviba
24、cter棒形杆菌属,革兰氏反应阴性,不形成芽孢,Bacillus芽孢杆菌属；Clostridium梭状芽孢杆菌属,+,-,植物病原细菌主要属简要检查方法,好氧性或不活泼性,滑行运动，在琼脂平板上铺开生长，短或长杆形弯曲、氧化酶阳性,以鞭毛游动,在KingsB培养基上产生荧光色素,发酵性,Cytophaga噬胞菌属；Flexibacter屈桡杆菌属,革兰氏反应阴性,不运动，菌落光滑短杆状、氧化酶阴性,Flavobacterium黄杆菌属,溶果胶活性,Erwinia（软腐组群）,Erwinia（不溶果胶组群）,Pseudomonas（无荧光组群）,在1葡萄糖营养琼脂上为白色菌落，周鞭，致瘤,Agr
25、obacterium土壤杆菌属,Xanthomonas黄单胞菌属,在1葡萄糖营养琼脂上为黄色菌落，单极鞭,Pseudomonas（荧光组群）,有益细菌的利用研究,生物防治 利用其他对植物无害的生物来影响或抑制病原物的生存和活动，从而降低病害的发生率或严重度。（1）抗菌作用(antibiosis)（2）溶菌作用(lysis)（3）竞争作用(competition)（4）重寄生作用(hyperparasitism)（5）捕食作用（predation）（6）交互保护作用(cross protection),Sir Alexander Fleming discovered the antibiotic
26、 penicillin. He had the insight to recognize the significance of the inhibition of bacterial growth in the vicinity of a fungal contaminant when most other scientists probably would have simply discarded the contaminated plates.,Alexander Fleming (1881-1955),亚历山大弗莱明英国细菌学家,葡萄球菌,青霉菌,1928年的一天，弗莱明在他的一间简
27、陋的实验室里研究导致人体发热的葡萄球菌。由于盖子没有盖好，他发觉培养细菌用的琼脂上附了一层青霉菌。这是从楼上的一位研究青霉菌的学者的窗口飘落进来的。使弗莱明感到惊讶的是，在青霉菌的近旁，葡萄球菌忽然不见了。这个偶然的发现深深吸引了他，他设法培养这种霉菌进行多次试验，证明青霉素可以在几小时内将葡萄球菌全部杀死。弗莱明据此发明了葡萄球菌的克星青霉素。 由于青霉素的发现和大量生产，拯救了千百万肺炎、脑膜炎、脓肿、败血症患者的生命，及时抢救了许多的伤病员。青霉素的出现，当时曾轰动世界。 为了表彰这一造福人类的贡献，弗莱明、钱恩、弗罗里于1945年共同获得诺贝尔医学和生理学奖。,青霉素的发现者英国细菌学家弗莱明,图中央是青霉菌，周围是致病细菌。距青霉素最远的细菌个大、色浓，活力十足；距青霉菌较近的细菌个较小、色较浅，活力较差；而最接近青霉菌的细菌个最小、色发白，显然已经死亡,葡萄球菌这些形如珍珠的东西就是危害人体健康的葡萄菌，青霉素能消灭它们。,与弗莱明共同获得1945年诺贝尔生理学和医学奖。,1940提纯出青霉素,澳大利亚病理学家霍华德.弗罗里,植物病害的生物防治中的应用,拮抗菌对病原菌的抑制作用,正常菌丝,畸形菌丝,
