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1、色谱分离基本原理,“两相分配，相似相溶”,1,色谱柱结构,色谱柱有方向性，主要与装填技术有关。筛板的内部孔形态会影响柱效,2,规格,内径长度粒径碳载量孔径比表面积材质封端,表观规格：柱管材质，填料分类，尺寸，粒径隐藏信息：碳载量，平均孔径，比表面积，封端，键合类型，pH范围，最大耐压，筛板孔径等,Waters XBridge Shield RP 18 4.6*250mm 5um,柱效拖尾载样量（体积）载样量（浓度）分离度回收率,你能正确连接它们吗？,3,填料,硅胶 等载体 （正相色谱）硅胶+键合相 （反相色谱）聚合物+键合相 （离子交换，手性色谱柱等）整体柱 （空间排阻色谱等）,4,反相色谱C
2、18填料,5,硅胶,注意：硅胶 颗粒大小分布金属残留内部孔径实心核颗粒,6,四乙氧基硅烷(TEOS),硅甲基嵌入型聚乙氧基硅烷 (MPEOS),甲基三乙氧基硅烷(MTEOS),改性硅胶,7,硅胶快速溶解 严重的柱失效 柱寿命短暂,因嵌入硅甲基的阻挡, 颗粒表面溶解速度明显减缓 柱寿命大大延长pH范围可达111,普通硅胶柱,waters改性硅胶柱,碱性条件下硅胶溶解,8,单、双、三官能团键合,三官能团键合,二官能团键合,单官能团键合,键合,碳载量影响残留硅羟基比率 键合相流失率,键合密度,9,常见键合相,10,空间位阻：异丙基硅氧烷，异丁基硅氧烷增加pH范围，但有限，一般19,空间位阻,Agil
3、entPhenomenex,11,空间位阻,抗水解,Agilent XDB,12,极性嵌入,Waters “Shield”,13,内嵌极性基团固定相：水表面层可能机理,水 “屏蔽”层,改善与水的浸润性100%水溶液兼容降低了碱性化合物的保留降低了拖尾现象,屏蔽了带负电的硅羟基,极性基团增加了表面层水的浓度,14,与键合相的疏水性作用,双重保留机理:1). 与键合相的的疏水性作用; 2). 与残余硅醇基间的离子交换作用,O-,Si,O-,Si,O,-,O-,Si,O-,Si,O,-,O-,Si,O,-,O-,Si,O-,Si,O-,Si,O,-,O-,Si,O-,Si,O-,Si,O-,Si,O
4、H,O-,Si,O-,Si,OH,O-,Si,OH,O-,Si,O-,Si,O-,Si,OH,O-,Si,O-,Si,当流动相pH值小于3时, 硅醇基呈中性(未解离),Base,Base,对碱性化合物的保留及严重拖尾,两实验使用相同的传统C8硅胶柱,离子交换作用,碱性分析物在硅胶柱上的拖尾机理,当流动相为 pH6-8时, 硅醇基带负电性(大部解离),15,既然pH 3时硅醇基离解受抑制，为何不在所有情况下采用酸性条件进行分离?,低pH可导致分离选择性的丧失!-碱性基团离子化，极性增加,16,常用封尾end-capped ：三甲基硅氧烷,极性封尾，增加极性保留,由于空间位阻的存在，键合反应最多只
5、能覆盖50%的硅羟基，超过一半硅羟基是活性硅羟基，与碱性基团会发生离子交换作用，增加了保留，导致峰形拖尾，用短链氯硅烷（如三甲基氯硅烷）键合活性的硅羟基，可以减小这种影响，这种操作被称为封尾，封端，封口。,封端,17,封端,18,封口残余硅羟基减少不可逆吸附或拖尾增加碳含量（0.1% -1%）,封端,19,现代色谱柱三大技术平台,亲水AQ柱ECOSIL ODS-AQAtlantis Dc18, T3Synergi Hydro-RPHILIC柱Zic-HILICHypersil GOLD HILICAtlantis HILIC 柱目的：提高极性化合物保留,宽pH色谱柱ECOSIL ODS-Ext
6、endXbridge/Xterra C18/C8Gemini C18Zorbax Extend目的：提高色谱柱pH使用范围,纯硅胶柱ECOSIL ODS-SHPurospher STAR RP18eSymmetry C18极性嵌入柱ECOSIL ODS-EPSZorbax-Bonus RP18Symmetry shield RP18目的：改善峰形,20,未湿润的孔,湿润的孔,注意：保留时间与填料表面积与配体有关。然而，如果硅胶表面未湿润，那么有效的色谱表面积会减少95%，因此，减少被分析物的保留时间即等于“疏水塌陷”，记住：几乎所有的表面积都在孔内！,低比例有机溶剂或纯水溶液流动相,C18 硅
7、胶,什么是“疏水塌陷”？,疏水塌陷,21,分,流动相：0.1% 醋酸水溶液,阿莫西林,Vo：被分析物没有保留,“湿润时”,“去湿后”,疏水塌陷,此时色谱柱并没有“坏”，如何复原：低比例有机相低流速冲洗过渡，然后高比例低流速。,22,停流速后 (孔去湿: 3%),流动相：0.1% 醋酸水溶液,极性嵌入色谱柱：无疏水塌陷现象发生,内嵌极性基团键合相：使用高比例水溶液流动相时色谱性能稳定,疏水塌陷,23,极性保留机理：离子交换+疏水作用,1、极性封尾2、极性嵌入3、低碳载量4、保留硅羟基5、增加极性嵌入键合相,AQ 柱,对极性与非极性化合物的优异保留特性在100水溶液流动相中运行保持色谱性能稳定峰形
8、优异超低键合相流失，质谱兼容酸性条件下稳定性良好在高水相、低pH条件下具有较长的色谱柱寿命极佳的色谱柱间重现性碳载量低，不适合分离复杂组份和强碱性化合物,突破硅胶柱应用禁区的有力手段,优点,缺点,无机基质 (C18 硅胶),机械强度高 柱效高 保留稳定,有限的pH应用范围 对碱性分析物拖尾 化学不稳定性,有机基质(高聚物),很宽的pH应用范围 无离子型作用化学稳定性好,机械强度不佳 柱效低 保留行为难以预测,宽pH值色谱柱,宽pH 柱,25,H对填料稳定性的影响,高pH实验pH 8时,许多C18硅胶基质过早地丧失柱效由于填料颗粒溶解,色谱柱内产生空隙随着键合相覆盖率的增加，色谱柱寿命延长低pH
9、实验pH 2时,许多C18硅胶基质过早地丧失柱效由于键合相之水解作用,被测物丧失保留行为使用三官能团键合相可获得最佳的稳定性,宽pH 柱,26,宽pH值色谱柱的几种类型,Agilent 双齿键合,宽pH 柱,Waters 杂化颗粒,27,基质溶解度 (ppm),1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 12,240-220-200-180-160-140-120-100- 80- 60- 40- 20- 0-,pH,基质溶解度曲线,传统硅胶柱适用范围pH 2-7,各种基质的液相柱在高pH中溶解速率的比较,液相柱基体材料的溶解导致柱前端形成空腔，由此而造成色谱峰畸形、分叉。,现代超纯硅胶柱适用范
10、围pH 2-8,宽pH值色谱柱适用范围pH 1-12,28,柱效下降，柱压升高的原因,键合相流失 保留时间的急剧下降是因为疏水塌陷 硅胶溶解坍塌 死吸附，硅胶内孔堵塞 筛板堵塞 稀释剂与流动相差异大或流动相急剧变化导致的柱内析晶 压力波动大致柱床松动，涡流效应增大,Q,29,我的色谱柱寿命为何不长?,您是否有恰当的样品前处理手段? 样品前处理 (净化和富集)的好坏不仅影响分析结果的灵敏度和可靠性，而且直接影响色谱柱的寿命 您的色谱柱是否有适当的保护措施? 在线过滤器 保护柱 您的色谱柱是否曾暴露在过于剧烈的分离条件? 使用某些对填料基体有腐蚀性的高浓度缓冲盐 (如在中性或碱性pH区域使用高浓度
11、缓冲盐的磷酸盐或硼酸盐) 柱温过高 将色谱柱暴露在极端pH的流动相中,Q,30,选择性与pH,影响带离子型官能团的待测物如：胺，羧酸及酚类等pH不影响不能发生电离的中性物质的保留大多数药物含有一个或多个离子型官能团pH变化引起的选择性变化最大,Q,化合物从离子化状态变化到非离子化状态其保留因子变化10 到 30倍上述变化相当于有机溶剂的比例变化20% pH带来最显著的选择性变化pH是方法开发最强有力的选择性调节工具,31,重要的方法开发为何要从新色谱柱开始？,随使用条件和样品洁净度的不同，多数色谱柱在使用过程中可发生化学污染、表面状态改变、基体材料部分溶解等等潜在变化。此类改变可导致柱内填料的
12、活化或钝化，使其对某些化合物的分离选择性加强或变劣。此类特殊分离选择性常常是无法重复的。在此类旧色谱柱建立起来的方法将无法在新柱和其他旧色谱柱上得以重现，造成未来可能需要重新开发方法或进行大量针对仪器系统、色谱柱和流动相的不必要的诊断工作。,Q,32,反相色谱柱的选择小结:,常规应用 现代高纯硅胶色谱柱：优点：峰形好，重现性高，寿命长限制：pH 2-8流动相中含有大量水溶液采用AQ技术：优点：在含有大量水溶液（100水溶液）流动相中 性能稳定：峰形好,Q,使用宽pH值或高温条件 如生物碱分离宽pH值色谱柱：pH1-12优点：pH范围宽，高温条件下填料稳定性好，色谱峰 形好，寿命长 快速分离或采用质谱检测器: 窄内径/小颗粒/短柱,33,
