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1、课题1 微生物的实验室培养,专题2 微生物的培养与应用,1.提供营养和条件,2.防止污染,1,一.培养基：,微生物生存的环境和营养物质,1.基本成分：,思考：微生物“吃”什么？,碳源、氮源、水、无机盐,碳源,无机碳源：,有机碳源：,CO2、CO32-、HCO3-,牛肉膏、蛋白胨等,自养微生物,异养微生物,氮源,无机氮源：,有机氮源：,NH4、NO3-,牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、尿素等,注：含CHON的有机物是异养型微生物的碳源、氮源、能源,2,(1)pH值如:培养霉菌需酸性、培养细菌需中性或微碱性(2)特殊营养物质-维生素、碱基等（牛肉膏、酵母膏、蛋白胨中含有） 如：培养乳酸杆菌需要在培养基中添
2、加维生素(3)氧气的含量如:培养厌氧微生物时需要提供无氧的条件,2.培养基内所需的其他条件,生长因子,3,3.种类：,固体培养基,液体培养基,有无 凝固剂琼脂,物理性质：,菌落,4,单个或少数菌体,特征：,大小、形状、光泽度、颜色、透明度等。,功能：,定义：,菌落,鉴定菌种的重要依据,固体培养基上,大量繁殖,子细胞群体,5,形态各异的菌落,6,其它分类：,根据化学成分分 合成培养基成分明确 天然培养基成分不明确,根据用途分 选择培养基 鉴别培养基,7,选择培养基,加入青霉素的培养基 分离酵母菌、霉菌等真菌加入高浓度食盐的培养基 分离金黄色葡萄球菌不加氮源的无氮培养基 分离固氮菌不加含碳有机物的
3、无碳培养基 分离自养型微生物加入青霉素等抗生素的培养基 分离导入了目的基因的受体细胞,8,牛肉膏蛋白胨培养基 是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基。,分析营养构成？,9,练习1（多项选择）,1、下列细菌中，能利用含碳无机物作碳源的是A 光合细菌 B 根瘤菌 C 硝化细菌 D 乳酸菌2、培养大肠杆菌的培养基中，必需含有的碳源和氮源是A 糖、有机酸等 B 二氧化碳、碳酸盐C 蛋白质 D 无机氮化物3、下列叙述不正确的是A 培养基是为微生物的生长繁殖提供营养的基质B 液体培养基和固体培养基所含的最基本物质不相同C 微生物在固体培养基上生长时，可以形成肉眼可见的单个细菌,A.C,A.C,B.C.,
4、10,1.无菌范围：,实验操作空间消毒,操作者的手、衣着消毒,实验用具、培养基灭菌,实验操作过程,酒精灯旁操作,超净工作台,二.无菌技术：,防止外来杂菌的污染,11,耐高温需保持干燥的 物品，160170 12小时,接种环、接种针等 金属用具,7075、30min 80、15min,100、56min,较为温和理化方法，,杀死部分有害菌体,（不包括芽孢、孢子）,强烈的理化方法，,杀死所有微生物,（包括芽孢、孢子）,煮沸消毒法,巴氏消毒法,化学药剂,紫外线,灼烧灭菌,干热灭菌,酒精、氯气、石炭酸等,高压蒸汽灭菌,培养基，100KPa、121、1530min,二.无菌技术：,防止外来杂菌的污染,2
5、.消毒与灭菌：,12,思考:,1)无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么目的？ 2)消毒和灭菌有何不同？3)为什么消毒牛奶要用巴氏消毒法?4)请你判断以下材料或用具是否需要消毒或灭菌。如果需要，请选择合适的方法。培养细菌用的培养基与培养皿玻棒、试管、烧瓶和吸管实验操作者的双手,无菌技术还能有效避免操作者自身被微生物感染。,灭菌,灭菌,消毒,营养成分不被破坏,13,培养基,培养皿,空 气,接种环,双 手,牛 奶,巴氏消毒,化学消毒,紫外线消毒,高压蒸气灭菌,灼烧灭菌,干热灭菌,常用的消毒方法和灭菌方法,14,三.大肠杆菌的纯化培养：,制备牛肉膏蛋白胨固体培养基,1.计
6、算：,培养基用量,依配方计算各成分的用量,2.称量：,3.溶化：,牛肉膏黏稠，用称量纸称取,牛肉膏、蛋白胨易吸潮，要快、加盖,牛肉膏、称量纸 、少量水加热溶解,取纸,蛋白胨、NaCl,琼脂,补水定容,4.调pH、分装、封口：,5.灭菌：,6.倒平板：,培养基、培养皿,分散成单个细胞,形成单个菌落,冷却至50，在酒精灯火焰附近,15,倒平板,16,?,思考1,溶化时为什么要将牛肉膏连同称量纸一起加热? 答:加琼脂的目的是什么?答:,可保证粘附在称量纸上的牛肉膏也能溶于水中,减少误差,作为凝固剂,17,思考2,在灭菌前, 用牛皮纸、旧报纸包紧盛有 培养基的锥形瓶的目的是什么？答: 培养皿能否用高压
7、蒸汽灭菌？答:,?,在灭菌时能避免水蒸汽凝结时浸湿棉塞,在取出培养基锥形瓶时也起到隔绝空气中杂菌污染的作用,不能,因为培养皿要保持干燥,应该用干热灭菌.,18,讨论:,(1).培养基灭菌后，需要冷却到50 左右时，才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？(2).为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？(3).平板冷凝后，为什么要将平板倒置？(4).在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？,提示：可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了。,答：通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。,答
8、：平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。,答：空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生，因此最好不要用这个平板培养微生物。,19,纯化大肠杆菌：,平板划线法：,菌种,划3个平板,1个不划线,1.接种：,接种环,防止划破培养基,（重复实验）,（空白对照）,平板划线法：稀释涂布平板法,20,问题讨论,1.为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？,答：操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物
9、；每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。划线结束后灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。,21,2.在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？,答：以免接种环温度太高，杀死菌种。,3.在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？,答：划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的
10、菌落。,22,6支试管，分别加入9ml无菌水,101,102,103,104,105,106,稀释涂布平板法：,a.梯度稀释菌液：,菌液,微量 移液器,23,稀释涂布平板法：,a.梯度稀释菌液：,b.涂布平板：,不超过0.1ml,各梯度分别涂布3个平板,1个不涂布作空白对照,滴,灼,试,涂,24,涂布平板操作,讨论:涂布平板的所有操作都应在火焰附近进行。结合平板划线与系列稀释的无菌操作要求，想一想，第2步应如何进行无菌操作？,答：应从操作的各个细节保证“无菌”。例如，酒精灯与培养皿的距离要合适、吸管头不要接触任何其他物体、吸管要在酒精灯火焰周围；等等。,25,2.培养：,将接种后的培养基和一个
11、未接种的培养基,放入37恒温箱中培养12h24h后，,观察并记录,26,1.未接种的培养基表面是否有菌落生长？如果有菌落生长，说明了什么？无菌落生长，说明培养基的制备是成功的，否则，说明培养基有杂菌，需要重新制备。,2.在接种大肠杆菌的培养基上，能否观察到独立的菌落？它们的大小、形状、颜色相似？ 如果接种成功的话，在培养基的表面可观察到大小、形状、颜色相似的菌落。,四.结果分析与评价,27,3.培养12h和24h后，观察到的实验结果相同吗？如果不同，请分析产生差异的原因？ 培养12h与24h后的大肠杆菌菌落的大小会有明显不同。随着时间的延长、菌落的不断生长，使菌落不断增大。,4.如果在培养基上
12、观察到不同形态的菌落，请分析其可能的原因。 无菌操作未达到要求：可能是培养基灭菌不彻底；可能是接种时发生了污染；也可能是在培养的过程中受到了污染。,28,五.菌种的保藏：,1.临时保藏：,试管固体斜面培养基上,4,2.长期保存：,菌种易被污染、变异,甘油管藏,1ml甘油1ml菌液,20,29,练习：1、培养细菌需要根据某种细菌的_配制特定的_.其中_培养基应用广泛.2、为使培养基呈固体状态，需要在配制好的各营养成分的液体加入_,溶化冷却即可.3、调节培养基的pH值,用浓度为1mol/L的_或_溶液进行调节.,营养需要,培养基,牛肉膏蛋白胨,琼脂,HCl,NaOH,30,4、对培养基进行灭菌就是
13、要利用高温杀死_.5、搁置斜面时培养基温度不能_否则培养基会变成_应趁热将试管放置成斜面形,培养基中的一切微生物,太低,固体,6、微生物接种时各项操作必须在_条件下进行.因此必须在_上操作.接种环境在_上用灼烧去灭菌,双手用_%的酒精消毒.,无菌,超净工作台,酒精灯,75,31,（11年新课标卷）39.【生物 选修1：生物技术实践】（15分）有些细菌可分解原油，从而消除由原油泄漏造成的土壤污染。某同学欲从污染的土壤中筛选出高效降解原油的菌株。回答问题：在筛选过程中，应将土壤样品稀释液接种于以 为唯一碳源的固体培养基上，从功能上讲，该培养基属于培养基。纯化菌种时，为了得到单菌落，常采用的接种方法
14、有两种，即 和 。 为了筛选出高效菌株，可比较单菌落周围分解圈的大小，分解圈大说明该菌株的降解能力 。通常情况下，在微生物培养过程中实验室常用的灭菌方法有灼烧灭菌、 和 。无菌技术要求试验操作应在酒精灯 附近进行，以避免周围环境中微生物的污染。,32,原油 选择平板划线法 稀释涂布平板法强。干热灭菌法 高压蒸汽灭菌法 火焰,33,讨论1在高压蒸汽灭菌开始以前，为什 么要将灭菌锅内的冷空气排尽？,在高压蒸汽灭菌以前，如果高压蒸汽灭菌锅内的冷空气没有排尽，当压力上升到 100 kPa时，锅内的温度就不会上升到应有的高度，导致灭菌不彻底。,34,2灭菌完毕以后，如果压力未降到0就打开排气阀，会出现什么现象？为什么？,如果压力未降到零就打开排气阀，试管内的培养基就会冲出管口。这是因为高压蒸汽灭菌锅内外压力不平衡的缘故,35,3接种操作为什么一定要在火焰 旁边进行？,空气中存在有大量的微生物，而接种灯的火焰旁能形成一个无菌区域，在这里操作，可以避免杂菌污染,36,
