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1、本文叙述了一种用于甲基化分析的探针法定量PCR的引物和探针设计方法，目前用于甲基化检测的引物探针设计工具非常多，都有使用成功的案例，经过初步多方尝试，本文中叙述的为本人认为较为靠谱的方法。Oligo7的优势在于专业，参数详尽且可自由设置，模块化设计，学会后使用便利。专业的活就是要专业的用专业的工具干。首先是进行序列转换，有较多的在线工具和联机软件都可实现，这里使用.urogene.org/methprimer/ ，较为简单直观。直接将目标序列放入如上图的编辑框中，此也可直接用于相关引物的设计，不过本人没使用过，因为不能设计探针。submit后就有转化后的序列信息，如下图：以上详细标记了CpG位
2、置和非CpG位置的C，可直接复制到Word标注使用，下面就可以使用Oligo7利用上边的序列设计引物和探针了，如果是设计非甲基化引物探针，则使用原始序列。关于引物和探针的一些主要参数，主要参考invtrogen的建议：Primer设计的基本原则：a) 引物长度一般在18-35mer。 b) G-C含量控制在40-60%左右。 c) 避免近3端有酶切位点或发夹结构。 d) 如果可能避免在3端最后5个碱基有2个以上的G或C。 e) 如果可能避免在3端最后1个碱基为A。 f) 避免连续相同碱基的出现，特别是要避免GGGG或更多G出现。 g) 退火温度Tm控制在 58-60C左右。 h) 如果是设计点
3、突变引物，突变点应尽可能在引物的中间。TaqMan 探针设计的基本原则：a) TaqMan 探针位置尽可能靠近扩增引物（扩增产物50-150bp），但不能与引物重叠。 b) 长度一般为18-40mer 。 c) G-C含量控制在40-80%左右。 d) 避免连续相同碱基的出现，特别是要避免GGGG或更多G出现。 e) 在引物的5端避免使用G。 f) 选用比较多的碱基C。 g) 退火温度Tm控制在 68-70左右。 另：目标变异碱基最好在3末端或3末端-1位置，保证扩增特异性，对于甲基化，则最好是C。打开软件，有以上几种方式可以建立新的序列文件，建立好的文件可保存，下次继续处理，此处直接复制转化
4、后的序列。建立好的用来设计引物和探针的序列。如果选择自动搜索，选择如下菜单，选择后弹出相应的设置项。Search for Primer& Probes的主要设置项目在Parameters和Ranges两个子项中。以上根据优化后的PCR反应体系调整，这里主要是反应体系中各离子浓度。对于甲基化PCR影响较大的应该是镁离子浓度，如果需要可以重点优化一下。Constraints是各约束条件设置，每个设置项在帮助文件中有详细解释，我在这里只设置Primer Length和Tm值相关的选项，前边的锁形标记表示强制要求和建议要求。对于甲基化PCR，有一种理论认为增加引物长度（30mer左右）减小产物长度（小
5、于150mer）能增加PCR反应的敏感性，即更容易得到扩增，经过尝试，有一定效果。Search Ranges选项，做一些序列位置和产物长度的限定。除以上提到的设置条件，其他条件可根据项目含义调整，如果不了解则使用默认设置即可。以上条件都设置后，可能会出现Search Filed的情况，是因为设置的条件无法满足，此时需要修改为更宽松的条件，另外如果序列太长Search时间可能会较长。Seacrh完成后，如下图，这里同时调出Current Oligo和Selected Oligos的Key Info，如下图：这里最重要的信息是Score，基本上大于700points的，据我测试都能成功，可见此处的
6、算法比较合理。本人还做个一个实验，用不同软件对同一段序列设计引物探针，相互评估，就算完全一样的序列各自计算出的不管是Tm值还是其他分数都差距不小，所以只能选择一个软件设计的合成后测试了，Oligo7是目前设计使用成功率较高的一个，差别的原因是各家算法不同，部分软件会给出详细的计算公式，如果感兴趣可以查看了解。虽然指定了大致设计位置，但以上设计的引物探针位置不一定是我们需要的位置，特别是我们需要指定某几个CpG被包含的情况，这就需要用到软件的评估功能了。打开Edit菜单下的对话框，其中用Upper Oligo或Lower Oligo表示Probe，分别为正链和反链互补序列。打开编辑框后，根据自身
7、需求调整引物和探针的长度及位置，输入下图中的编辑框后确认，这里主要需要关注如下图红色框中的信息，原则有几点：a) Edit Foward Primer输入正向序列，Edit Foward Primer输入反向互补序列，Edit Upper/Lower Primer输入正向/反向互补序列，每项编辑后点击确认小勾，相应的参数会列出，这里重点调出Analyze下的Key Info和Composition& Tm两个选项，对应每个引物或探针的信息。b) 修改后得到的Score是根据前述Search中设置的参数得来，所以这里需要设置的相关参数也是在前述相同的Search选项下修改，其中的诸如Primer
8、 Length，Primer Tm Range等参数的设置同样会影响最后的Score，详见Search Parameters下的Scores选项卡，所以如果有相关不适宜的设定，可能会降低Score值。c) 关于Tm值，此软件列出了3中不同算法的Tm值，对于引物，3种算法的Tm值会相近，如果不能满足，以nearest neighbor method算法的Tm值为准，此处的探针法的引物以接近60为优。对于探针，以nearest neighbor method算法的Tm值为准，另外两种算法会偏高，以接近70为优。d) 关于Score，如果Length和Tm以及其他辅助项，如G+C含量等，基本符合要求后，Score只要大于700即为优秀，越高越好，这里主要考量了除目标参数外，还有二级结构，错配等各方面，分数越高则排除的越多。以上，即为探针法甲基化特异性PCR的设计方法，对于其他PCR，原理相同，设计完后就可以合成了，至于如何判断设计的引物探针是有效的，那，就只能PCR后看结果了。VECTOR2015.9
