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1、Taqman法荧光PCR引物探针设计,实时荧光定量PCR TaqMan法,TaqMan-水解型杂交探针,5端标记有报告基团(Reporter,R)，如FAM、VIC等 3端标记有荧光淬灭基团(Quencher,Q)探针完整，R所发射的荧光能量被Q基团吸收，无荧光，R与Q分开，发荧光 Taq酶有 53外切核酸酶活性，可水解探针,TaqMan法工作原理,每扩增一条DNA分子，释放一个荧光信号，可以在循环过程中任一点检测荧光,TaqMan 法 PCR反应的建立,1、引物、探针的设计：探针Tm为68-70，2030 bp,5不能有G，G可能会淬灭荧光素，引物尽量靠近探针，扩增片段400 bp，引物Tm
2、为58-60 2、反应参数的确定：一般为：94，10-20S 60，30-60S（Taq酶53外切核酸酶活性在60 最高）也可通过温度梯度优化退火温度 72，45 S，3、优化引物和探针浓度：获得最小Ct值，最大信号/背景比值 引物浓度：50-900nM 探针浓度：50-250nM4、其他与常规PCR相同,总体原则,查阅参考文献，以选取 待检病原体的靶基因。目的基因序列大量查找，利用DNAstar等软件完成目的DNA或者RNA比对，确定种内高保守，种间高特异的区域为设计引物探针的靶序列先选择好探针，然后设计引物使其尽可能的靠近探针。所选序列应该高度特异，尽量选择具有最小二级结构的扩增片段这是因
3、为二级结构会影响反应效率，而且还会阻碍酶的扩增。建议先进行二级结构检测，如果不能避免二级结构，那么就要相应提高退火温度。扩增长度应不超过400bp，理想的最好能在100-150bp内，扩增片段越短，有效的扩增反应就越容易获得。较短的扩增片段也容易保证分析的一致性。保持GC含量在20和80之间，GC富含区容易产生非特异反应，从而会导致扩增效率的降低，以及出现在荧光染料分析中非特异信号。为了保证效率和重复性，应避免重复的核苷酸序列，尤其是G（不能有4个连续的G）将引物和探针互相进行配对检测，以避免二聚体和发卡结构的形成。,探针设计原则,探针位置尽可能地靠近上游引物 探针长度应在15-45bp（最好
4、是20-30bp)，以保证结合特异性 检测探针的DNA折叠和二级结构 Tm值在65-70，通常比引物TM值高5-10（至少要5），GC含量在40%70%探针的5端应避免使用G鸟嘌呤因为5G会有淬灭作用，而且即使是被切割下来还会存在淬灭作用。整条探针中，碱基C的含量要明显高于G的含量G含量高会降低反应效率，这时就应选择配对的另一条链作为探针。为确保引物探针的特异性，最好将设计好的序列在blast中核实一次，如果发现有非特异性互补区，建议重新设计引物探针。,引物设计原则,序列选取应在基因的保守区段 避免引物自身或与引物之间形成4个或4个以上连续配对，避免引物自身形成环状发卡结构 典型的引物18到2
5、4个核苷长。引物需要足够长，保证序列独特性，并降低序列存在于非目的序列位点的可能性。但是长度大于24核苷的引物并不意味着更高的特异性。较长的序列可能会与错误配对序列杂交，降低了特异性，而且比短序列杂交慢，从而降低了产量。Tm值在5565（因为60核酸外切酶活性最高），GC含量在40%60%引物之间的TM相差避免超过2 引物的3端避免使用碱基A，引物的3端避免出现3个或3个以上连续相同的碱基 为避免基因组的扩增，引物设计最好能跨两个外显子。Taqman探针技术要求片段长度在50bp150bp 引物末端（最后5个核苷酸）不能有超过2个的G和C。,TaqMan法优缺点,TMA检测技术示意图,TMA扩
6、增反应原理图,技术原理,同一温度下，首先通过M-MLV反转录酶产生靶标核酸（RNA）的一个双链DNA拷贝，然后利用T7 RNA多聚酶从该DNA拷贝上产生多个（1001000个）RNA拷贝；每一个RNA拷贝再从反转录开始进入下一个扩增循环；同时，带有荧光标记的探针和这些RNA拷贝特异结合，产生荧光。该荧光信号可由荧光检测仪器实时捕获，实时反映扩增循环情况。,分子信标探针,结构自由能控制在 35之间,Non-T7引物,CTATGCATTGCTGAGATTGGAACTT,T7引物,TAATACGACTCACTATAGGGAGA acctatcctatttgtacatccattca,TMA 检测技术的
7、优势,领先的 RNA 检测技术 TMA 技术检测病原体 RNA。一个病原体细胞内含有多达 个 RNA 拷贝，大大提高了检测灵敏度。先进的恒温扩增技术 核酸扩增在一个温度下进行（42），不需要热循环。更高的检测灵敏度和准确性TMA 技术的扩增效率极高，1530分钟即可将模板扩增 倍，检测灵敏度和准确性远高于其他核酸检测技术。有效的解决了核酸检测的污染问题污染是核酸检测的最大问题。TMA 技术的扩增产物为RNA，环境中自然降解，污染少，更进一步提高检测结果的可靠性。高效率的自动化检测TMA技术采用实时荧光检测，仪器自动化程度较高，解放了操作人员，并且能够得到标准、稳定的结果。,TMA VS REA
8、L-TIME PCR,都采用实时荧光检测技术TMA与PCR检测相比较灵敏度更高；特别是加入内标后，PCR检测灵敏度下降很大TMA检测产生的放大终产物是RNA，而PCR产生的是DNA；RNA很容易自然降解，而DNA则较为稳定，即TMA检测在污染控制方面更为容易TMA操作不需要复杂的热循环仪，普通水溶即可；而PCR检测需要热循环仪TMA放大效率高达1000拷贝/循环，而PCR仅为2拷贝/循环,全球诊断技术发展的四个阶段,灵敏度低导致漏检误检等缺陷检测周期过长由于成本低，在发展中国家仍广泛使用,灵敏度落后于最新的核酸恒温扩增技术过渡性技术，在血筛领域正逐步被第四代技术取代,最新诊断技术，具有高灵敏度、高特异性优势，极大降低漏检误检率相对成本较高，但在血筛等市场已成为主流技术,由于成本低，在发展中国家仍广泛使用“窗口期”问题是该技术用于血筛领域的致命缺陷,
