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1、淋巴细胞亚群测定方法 流式细胞仪(BeckmanCoulter，贝克曼库尔特)原理： 双/三色/四色直接免疫荧光法。荧光素标记的各种单克隆抗体加入到全血中，与白细胞膜上相应的抗原结合，经过溶血、洗涤（和固定）等步骤后，在流式细胞仪上进行分析，从而得到淋巴细胞亚群的百分数，加入Flow-Count即可得出绝对计数。淋巴细胞表面抗原分布如下：T淋巴细胞：CD3+；B淋巴细胞：CD3-，CDl9+；辅助性T淋巴细胞：CD3+CD4+；抑制性T淋巴细胞：CD3+CD8+；NK细胞：CD3-CDl6+56+等。根据淋巴细胞膜上CD分子表达的不同，流式细胞仪可以分辨出淋巴细胞及其各种不同的亚群，利用计算机
2、软件计算出淋巴细胞亚群的百分数，加入Flow-Count组会自动得出绝对计数。标本采集与处理 受检者的准备 检查对象生活饮食处于日常状态。 采集部位 静脉采血抗凝剂 EDTA或肝素抗凝血 要求 1样本量1ml。 2样本应在采集后6小时内处理，冷冻或溶血的标本不能用。 3样本白细胞计数应在4.0-10.0109/L之间。若10.0109/L， 样本需要稀释，用PBS稀释；若4.0109/L，应分离单个核细胞。 试剂 品牌 剂型 规格 贮存 贝克曼库尔特成分 1：单克隆抗体 液体 28 (CD45/4/8/3 No. CD45/56/19/3 No. CD4/8/3 No.IM1650 同型对照I
3、gG1/IgG1/IgG1 No.IM1672 CD3/19 No.IM1293 CD3/16+56 No.IM2076 CD19-PC5 No.IM2643Flow-Count荧光微球 No.) 2：全血溶血试剂(Q-Prep) 液体(No.) A：甲酸 液体 70ML 室温 B：碳酸钠等 液体 32ML 室温 C：多聚甲醛 液体 14ML 室温 (Optilyse C No.IM1401) 液体 室温 3：鞘液(No.) 液体 20L 室温 4：清洗液(No.) 液体 5L 室温 5：荧光微球(No.) 液体 10ML 2-8(Flow-Check) 仪器 BeckmanCoulter E
4、PICS XL/FC500/Altra 样本制备： 1)按照要求，分别向已编好号的试管中加入10/20 ul单克隆抗体和同型对照2)分别向试管中加入混匀的100u1抗凝血。3)混匀，避光，室温孵育20-30分钟4)溶血：a. OptiLyse C(按说明书步骤溶血) b. 使用COULTER QPREP制备系统开机-显示READY灯亮-选择35SEC灯亮-开门-放入试管关门-自动进行溶血-显示READY灯亮-开门-取出试管-再进行下一个样品测定。（*溶血前确认A/B/C管路充满并能打出液体）5)上机测样（可根据样本情况选择洗或不洗上样）6)需要做绝对计数的指标，在相应管中加入与血样等量的Flo
5、w-Count(务必做到三同：同枪，同人，同种方法加Flow-Count，而且加完即上机) 报告结果 报告百分数（和绝对值）操作性能 精密度 批内五次重复CV2 参考值(百分数（绝对值）) CD3+ 60.8-75.4%(1141-1880) CD4+ 29.4-45.8%(478-1072) CD8+ 18.2-32.8%(393-742) NK 9.5-23.5% (175-567) Th/Ts 1.05-2.03临床意义1.T、B淋巴细胞亚群是重要的免疫状态检测指标，在肿瘤、免疫缺陷、病毒感染，自身免疫性疾病、创伤、急性感染、多脏器功能衰竭、器官移植等具有临床诊断、病情判断、治疗等价值。
6、临床常用ThTs比值来判断病人的免疫状况。ThTs比值升高：表示免疫功能亢进：见于自身免疫性疾病，如SLE、类风湿性关节炎、自身免疫性溶血性贫血、重症肌无力以及HBsAg+乙肝等。ThTs比值减低：表示免疫功能下降：艾滋病、病毒感染、肿瘤病人、慢活肝和活动性肝硬化、再生障碍性贫血、粒细胞减少患者。2：NK细胞主要破坏各种肿瘤细胞和感染某些病毒、细菌的细胞，所以在抗肿瘤和防御疾病中起主要作用。NK活性减低主要见于各种恶性肿瘤、自身免疫性疾病、病毒感染、应用免疫抑制剂，疲劳综合征病人等，NK活性随年龄增长而减退。NK细胞也参与第二型超敏反应和移植物抗宿反应，白介素-2治疗后；外周血NK细胞增加。方案（Protocol）1.选参数点击点击4色3色点击（命名，点击save） 2.画图 结果 此图为CD45圈门如果做绝对计数，则填写Flow-Count的浓度选中cell/ul即可
