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1、化学发光磁酶免疫分析法检测梅毒螺旋体抗体,答辩人： 杨璐 导 师： 崔亚丽 教授 李如琳 副教授,西北大学,Contents,1. 背景介绍,3. 全文总结,2. 实验部分,梅毒 梅毒螺旋体 严重性传播疾病 发病率不断上升 2010年4月国家卫生部全国法定 传染病疫情报告： 全国乙类法定传染病发病第位梅毒检测：孕前检查 供血者血液常规筛选检查,西北大学,医院常用梅毒螺旋体免疫学检测方法快速血浆反应素环状卡片实验试验（RPR）和甲苯胺红试验(TRUST) 初筛 假阳性高 判断主观梅毒螺旋体血球凝集试验（TPHA）和梅毒螺旋体明胶凝集试验（TPPA） 确认 判断主观 操作繁琐 要求严格梅毒ELIS
2、A实验 灵敏度有待进一步提高,西北大学,化学发光免疫分析技术,免疫分析系统,化学发光分析系统,（抗原、抗体，免疫反应）,免疫分析高特异性及化学发光高灵敏度于一体,（酶的化学发光底物或氧化剂）,西北大学,梅毒螺旋体抗体化学发光法检测 灵敏度极高 自动化,化学发光技术 灵敏度极高 较宽线性范围 精密度高 容易实现自动化广泛应用于医学、食品、分析化学等领域,西北大学,化学发光法检测梅毒的商品化试剂盒国外： Abbott：ARCHITECT Syphilis TP 磁粒 国内： 北京科美东雅生物技术有限公司：梅毒螺旋体抗体化学发光试剂盒 酶标板,西北大学,化学发光固相载体的选择,西北大学,金磁微粒化学
3、发光检测方法,1.生物分子固定化容量大 2.超顺磁性，易分离,西北大学,包被,反应,检测,实验原理,西北大学,第一部分 方法的优化,西北大学,HRP标记抗原稀释液的确定,a PBST+20%小牛血清b PBST+0.1%BSAc PBST+0.5%BSAd PBST+1%BSAe PBST+1.5%BSA,降低非特异性吸附 ： 加入非特异性蛋白与表面活性剂,阴性样本的发光值,西北大学,包被抗原和酶标抗原最佳工作浓度的确定,最佳抗原包被量：210ng/孔；最佳酶标抗原工作浓度：1：3000,西北大学,样本稀释液的确定,最佳样本稀释液：PBS+0.1%BSA,检测灵敏度与正常人血清相当,西北大学,
4、保护剂的选择,保护剂X对HRP标记抗原的保护作用良好,HRP标记抗原置于37、放置6天,西北大学,保护剂X对包被抗原金磁微粒的保护作用,包被抗原金磁微粒置于37、放置6天,稳定性很好,西北大学,保护剂Proclin300与保护剂X的对比实验,选定浓度为0.05%的Proclin300作为保护剂,西北大学,保护剂Proclin300对HRP标记抗原的保护作用,含0.05%Proclin300的 HRP标记抗原置于37、放置6天,西北大学,第一部分实验小结,在初步建立的化学发光检测梅毒螺旋体抗体方法的基础上进一步优化，确定各最佳工作条件如下：1. HRP标记抗原稀释液：PBST+1% BSA作为H
5、RP 标记抗原稀释液；2. 抗原包被量：210 ng/孔(7 g/mg )；3. 酶标抗原稀释浓度：1: 3000时，发光强度达到最佳；4. 血清样本稀释液：PBS+0.1%BSA；5. 保护剂：浓度为0.05%Proclin300的PBS缓冲液。,西北大学,精密度,特异性,第二部分 实验方法的评价,西北大学,稳定性,化学发光试剂分别置于4冰箱和37生化培养箱中放置6天,将阳性血清分别稀释50倍、100倍、200倍、400倍后进行检测,西北大学,精密度,国家标准（15%）,批内差： 2.86%5%,西北大学,批间差： 5.1%9.7%,西北大学,质控标准品10次重复测定结果,质控品：抗-TP标
6、准物质（2NCU/mL）,相对标准偏差：5.42%,西北大学,标准曲线,将梅毒螺旋体抗体质控标准品（4 NCU/mL）梯度稀释，在0.25 4 NCU/mL范围内线性良好,Y = 599.1X-165.9R2 = 0.9980,西北大学,参考值（临界值确定）,检测100例临床阴性血清样本,临界值：P/N2.8，计算得出该方法的临界值为： COV=72.8PX+3SD，计算可得临界值为：COV=47.6P/N2.1，计算可得临界值为：COV=54.6,发光值=54.6,西北大学,特异性,阴性符合率均为100%, 80例临床血清样本 20例乙肝阳性血清 样本（TP阴性） 20例丙肝阳性血清 样本（
7、TP阴性）,本次实验：COV=N2.1=54.6,发光值,西北大学,乙肝阳性样本检测结果,丙肝阳性样本检测结果,COV=54.6,COV=54.6,发光值,发光值,乙肝血清样本,丙肝血清样本,阴性符合率均为100%,西北大学,化学发光磁酶免疫分析法与商品化化学发光试剂盒对比,灵敏度比商品化化学发光试剂盒提高4倍,西北大学,化学发光磁酶免法（COV=N2.1=53.2）,商品化化学发光试剂盒COV=N2.1=26151）,特异性对比实验：二者相当，阴性符合率均100%,发光值,发光值,20例阴性血清样本,20阴性血清样本,COV=53.2,COV=26151,西北大学,西北大学,第二部分实验小结
8、,国家法规：,体外诊断试剂注册管理办法,分析性能评估资料：分析灵敏度、分析特异性、检测范围 批内不精密度、批间不精密度等项目,参考值（参考范围）确定,稳定性研究资料,发光免疫分析试剂生产及质量控制技术指导原则,根据各个试剂盒的企业标准或者制检规程进行检验，检验指标一般包括准确性、灵敏度、特异性、精密性（批内差）、相关性等，均应达到相应的质量标准。,稳定性：4，及37加速破坏性实验，均显示保存稳定性良好；精密度： 批内差在2.865%，批间差在5.19.7%，对质控品重复 10 次检测，变异系数为5.42%，均达到国家标准（ 15%）,方法评价结果,西北大学,标准曲线：在0.25 4 NCU/m
9、L范围内线性范围良好临界值：临界值为阴性对照血清均值的2.1倍特异性：检测临床TP抗体阴性血清，阴性符合率为100%，特异性良好对比实验：灵敏度较商品化化学发光试剂盒提高4倍，特异性二者相当,西北大学,全文总结：,西北大学,西北大学,主要生产工艺及反应体系研究资料,半成品试剂盒的检定成品试剂盒的检定,Company Logo,包被抗原酶标抗原试剂盒阳性对照品、阴性对照品研制,Company Logo,主要原材料研究资料,稳定性研究资料,批间稳定性标准品稳定性检测试剂盒成品稳定性检测试剂盒开封稳定性,Company Logo,性能评估资料,试剂灵敏度的考察试剂特异性的考察试剂重复性的考察试剂准确性的考察 与市售同类产品的比较,Company Logo,致 谢,感谢导师崔亚丽教授对我学业的悉心指导。感谢陈超教授为我提供了一流的实验平台。感谢李如琳副教授对我学业上的指导帮助。感谢纳米材料组彭明丽副教授、所有同学及全体员工对我的无私帮助。感谢国微中心全体成员对我工作的支持。感谢我的父母一直对我的大力支持与关怀。感谢各位评委老师。,西北大学,Thank You !,
