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1、,作者 : 药立波,单位 : 第四军医大学,第二十四章,常用分子生物学技术Basic Techniques in Molecular Biology,第一节 分子杂交和印迹技术,第二节 PCR技术的原理与应用,第三节 DNA测序技术,第四节 生物芯片技术,第五节 蛋白质的分离、纯化与结构分析,第六节 生物大分子相互作用研究技术,重点难点,印记技术的概念；PCR技术的概念，原理、用途；DNA序列测定的概念和用途；生物芯片的概念；蛋白质分离纯化的主要技术所依据的蛋白质理化性质,印记技术的种类；实时PCR技术的原理和用途；新一代DNA序列测定的概念和用途；生物芯片的用途；蛋白质分离纯化的主要方法的概
2、念和应用,分子生物学技术在医学发展中的意义；基因文库的概念；蛋白质分离纯化的主要方法及其基本原理；多肽链中氨基酸的序列分析方法及其原理；蛋白质空间结构测定的基本原理；蛋白质相互作用分析的主要方法和意义,分子杂交和印记技术,第一节,Molecular Hybridization and BlottingTechnique,不同的DNA或RNA分子之间，或DNA分子与RNA分子之间，按照碱基互补配对的原则，两条完全或不完全互补的多核苷酸链相互结合、形成杂交分子的过程,一、分子杂交与印迹技术的原理,分子杂交 (molecular hybridization),分子杂交技术,印迹技术,是将待检测的生物
3、大分子转移到固定基质上，再通过分子杂交，使其得到显现的过程。通过印迹技术不仅能够检测DNA 或RNA分子，还能够利用抗原、抗体相互识别结合的特点，对蛋白质分子进行检测。这一技术类似于用吸墨纸吸收纸张上的墨迹，因此称之为“blotting”，即印迹技术,探针（probe）指的是带有特殊可检测标记的多聚核苷酸片段 放射性核素、生物素或荧光染料可以标记其末端或全链的已知序列 探针可以与固定在NC膜上的核苷酸互补结合可以用于检测核酸样本中存在的特定基因,探针技术,二、分子杂交和印迹技术的类别及应用,DNA印迹 (Southern Blotting) Southern EM,1975,RNA印迹 (No
4、rthern Blotting) Alwine JC，Kemp DJ and Stark GR,1977,蛋白质的印迹 (Western Blotting) Towbin H, Staehelin T and Gordon J,1979,用于克隆基因的酶切图谱、基因组中某一基因的定性及定量、基因突变、基因拷贝数及限制性片段长度多态性分析等,用于RNA的定性定量分析,用于蛋白质定性定量及相互作用研究,DNA印迹实验,三种印迹技术的比较,其他杂交或印记技术斑点印迹 (dot blotting) 原位杂交 (in situ hybridization)组织原位杂交细胞染色体DNA原位杂交菌落原位杂交
5、 DNA芯片技术 (DNA chip),原位分子杂交技术,基本原理：利用标记的核酸分子探针与组织、细胞或染色体上待测DNA或RNA结合，经一定的检测手段将待测核酸在组织、细胞或染色体上的位置显示出来重要条件：组织、细胞或染色体的固定，具有能与待测特定片段互补的核苷酸序列（探针），以及与探针结合的标记物,原位杂交是进行基因及其表达产物定位分析的一种技术,分析基因在染色体上的位置 DNA荧光原位杂交 确定特定基因的表达定位 RNA原位杂交,原位分子杂交技术,PCR技术的原理与应用Principle and Application of Polymerase Chain Reaction,第二节,简
6、称PCR，是模拟体内DNA复制的过程在体外获得大量DNA的技术,聚合酶链反应 (The Polymerase Chain Reaction, PCR),一、PCR技术的基本原理,以待扩增的DNA分子为模板，用两条寡核苷酸片段作为引物，分别在拟扩增片段的DNA两侧与模板DNA链互补结合，提供3-OH末端；在DNA聚合酶的作用下，按照半保留复制的机制沿着模板链延伸直至完成两条新链的合成。不断重复这一过程，即可使目的DNA片段得到扩增,模板（template）： DNA双链,原料（material）： 四种dNTP,催化酶（enzyme）： 耐热的DNA聚合酶,引物（primer）： 两条,Mg2+
7、缓冲液,基本反应过程,一对模板变性开二条引物退火连三种温度交替变四种原料来延伸,PCR体系基本组成成分,变性 退火 延伸,基本反应步骤,变性95C,延伸72C,退火Tm-5C（50-65 C）,产物：两引物之间特异的DNA片段,变性（9496C ） 退火（5065C ） 延伸（72C ）,PCR工作原理示意图,二、PCR技术的主要用途,（一）获得目的基因片段在人类基因组计划完成之前，PCR是从cDNA文库或基因组文库中获得序列相似的新基因片段或新基因的主要方法。目前，该技术是从各种生物标本或基因工程载体中快速获得已知序列目的基因片段的主要方法（二）DNA和RNA的微量分析PCR技术敏感性高，对
8、模板DNA的量要求很低，是DNA和RNA微量定性和定量分析的最好方法。理论上讲，1滴血液、1根毛发或1个细胞已足以满足PCR的检测需要，因此在基因诊断方面具有极广阔的应用前景（三）DNA序列分析将PCR技术引入DNA序列测定，使测序工作大为简化，也提高了测序的速度，是实现高通量DNA序列分析的基础。待测DNA片段既可克隆到特定的载体后进行序列测定，也可直接测定,（四）基因突变分析PCR与其他技术的结合可以大大提高基因突变检测的敏感性，例如单链构象多态性分析、等位基因特异的寡核苷酸探针分析、基因芯片技术、DNA序列分析等（五）基因的体外突变在PCR技术建立以前，在体外对基因进行各种突变是一项费时
9、费力的工作。现在，利用PCR技术可以随意设计引物在体外对目的基因片段进行插入、嵌和、缺失、点突变等改造,逆转录PCR(reverse transcription PCR，RT-PCR)是将RNA的逆转录反应和PCR反应联合应用的一种技术RT-PCR是目前从组织或细胞中获得目的基因以及对已知序列的RNA进行定性及半定量分析的最有效方法,逆转录PCR技术,三、几种重要的PCR衍生技术,24,逆转录PCR技术常用引物,逆转录PCR技术原理,三、几种重要的PCR衍生技术,原位PCR技术,利用完整的细胞作为一个微小的反应体系来扩增细胞内的目的基因片段PCR反应在福尔马林固定、石蜡包埋的组织切片或细胞涂片
10、上的单个细胞内进行。反应后，再用特异性探针进行原位杂交即可检出待测DNA或RNA是否在该组织或细胞中存在原位PCR将目的基因的扩增与定位相结合，既能分辩鉴定带有靶序列的细胞，又能标出靶序列在细胞内的位置,实时PCR技术,实时PCR (real-time PCR) 技术是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法 实时技术通过动态监测反应过程中的产物量，消除了产物堆积对定量分析的干扰，亦被称为定量PCR,三、几种重要的PCR衍生技术,实时PCR技术原理-非引物探针类实时PCR,最常用的荧光染料为SYBR Green，它能
11、结合到DNA双螺旋小沟区域,引物探针类实时PCR,TaqMan探针法,FRET探针法,分子信标探针法,实时PCR技术原理-TaqMan探针法,实时PCR技术原理-分子信标引物探针法,实时定量PCR技术具有定量、特异、灵敏和快速等特点，是目前检测目的核酸拷贝数的可靠方法，是DNA定量技术的一次飞跃。目前实时荧光PCR技术已经被广泛应用于基础科学研究、临床诊断、疾病研究及药物研发等领域,实时PCR的应用,实时PCR在肿瘤方面的应用实时PCR用于多态性分析实时PCR用于病原体的检测,DNA测序技术DNA Sequencing,第三节,四、DNA测序在医学领域具有广泛应用价值,三、高通量DNA测序技术
12、使基因测序走向医学实用,二、第一代全自动激光荧光DNA测序仪器基于双脱氧法,一、双脱氧法和化学降解法是经典DNA测序方法,一、双脱氧法和化学降解法是经典DNA测序方法,DNA链末端合成终止法,二、第一代全自动激光荧光DNA测序仪器基于双脱氧法,早期的全自动DNA序列分析仪的工作原理主要是基于Sanger法，采用四色荧光标记ddNTP而制作的。采用4种不同荧光染料标记4种不同的可终止DNA延伸反应的底物ddNTP，经Sanger法反应后，赋予所合成的DNA片段4种不同的颜色。待测DNA样品的4个反应产物在同一个泳道内依照片段大小电泳分离，由仪器自动连续采集荧光数据并完成分析，最后直接显示待测DN
13、A的碱基序列,三、高通量DNA测序技术使基因测序走向医学实用,人群及个体进行全基因组序列分析必须实现DNA测序技术的微量、快速和低成本化新的高通量DNA测序技术及其分析仪器因此应运而生。这些新技术被冠予新一代测序（next generation sequencing，NGS）之称,新一代测序技术,焦磷酸测序（Pyrosequencing） 循环芯片测序（cyclic-array sequencing） 单分子实时测序,二、 DNA序列分析的主要用途,通过DNA序列分析可以鉴定基因和基因组的变异通过DNA序列测定分析人工重组的基因通过DNA序列测定对定点突变进行确认,生物芯片技术Biochip
14、Technologies,第四节,是指将许多特定的DNA片段有规律地紧密排列固定于单位面积的支持物上，然后与待测的荧光标记样品进行杂交，杂交后用荧光检测系统等对芯片进行扫描，通过计算机系统对每一位点的荧光信号做出检测、比较和分析，从而迅速得出定性和定量的结果。该技术亦被称作DNA微阵列(DNA microarray),一、基因芯片,基因芯片(gene chip),利用DNA芯片技术可同时进行高通量基因 转录活性的分析 染色质免疫共沉淀与芯片技术结合检测 蛋白质-DNA相互作用 （ChIP-on-chip） 确定转录因子及其作用位点 确定基因表观遗传修饰，应用于表观遗传学研究,基因芯片技术的应用
15、,基因芯片分析肿瘤差异表达基因,是将高度密集排列的蛋白质分子作为探针点阵固定在固相支持物上，当与待测蛋白质样品反应时，可捕获样品中的靶蛋白，再经检测系统对靶蛋白进行定性和定量分析的一种技术,二、蛋白质芯片,蛋白质芯片(protein chip),蛋白质检测芯片蛋白质功能芯片,蛋白质芯片作用原理-蛋白质分子间的亲和反应,是将数十个、数百个乃至上千个小的处于自然或病理状态下的组织标本集成在一张固相载体上（通常是载玻片） 形成微缩组织切片，以形态学为基础，在组织切片上高通量获取基因的表达信息的一种技术,组织芯片(tissue chip，tissue microarray),多组织片组织阵列组织微阵列
16、,胃癌患者的组织芯片（免疫组化染色）,蛋白质的分离纯化和结构分析Isolation, Purification and Structural Analysis of Proteins,第五节,一、有机溶剂沉淀、盐析及免疫沉淀用于蛋白质浓缩及分离,有机溶剂沉淀蛋白质,丙酮、乙醇等有机溶剂可以使蛋白质沉淀，再将其溶解在小体积溶剂中即可获得浓缩的蛋白质溶液为保持蛋白质的结构和生物活性，需要在04低温下进行丙酮或乙醇沉淀沉淀后应立即分离，否则蛋白质会发生变性,盐析分离蛋白质,将硫酸铵、硫酸钠或氯化钠等加入蛋白质溶液，使蛋白质表面电荷被中和以及水化膜被破坏，导致蛋白质在水溶液中的稳定性因素去除而沉淀,各
17、种蛋白质盐析时所需的盐浓度及pH均不同，可据此将不同的蛋白质予以分离,免疫沉淀分离蛋白质,利用特异抗体可以识别相应抗原并形成抗原抗体复合物的特性，可从蛋白质混合溶液中分离获得相应的抗原蛋白,用于特定蛋白质定性和定量分析,将抗体交联至固相化的琼脂糖珠上，易于获得抗原抗体复合物,二、透析和超滤法去除蛋白质溶液中的小分子化合物,利用透析袋把大分子蛋白质与小分子化合物分开的方法,透析（dialysis）,超滤法（ultra-filtration）,应用正压或离心力使蛋白质溶液透过有一定截留分子量的超滤膜，达到浓缩蛋白质溶液的目的,三、电泳分离蛋白质,电泳：蛋白质分离与鉴定的常用方法,蛋白质在高于或低于
18、其pI的溶液中为带电的颗粒，在电场中能向正极或负极移动。这种通过蛋白质在电场中泳动而达到分离各种蛋白质的技术, 称为电泳(elctrophoresis) 根据支撑物的不同，可分为薄膜电泳、凝胶电泳等,几种重要的蛋白质电泳,SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳：常用于蛋白质分子量的测定IEE等电聚焦电泳：通过蛋白质等电点的差异而分离蛋白质的电泳方法2-DGE双向凝胶电泳：蛋白质组学研究的重要技术,样品加于凝胶上部的上样孔内，在电场的作用下，蛋白质分子根据其固有 的带电性和分子大小进行分离b. 凝胶经染料（例如：考马斯亮蓝）染色后，蛋白质条带得以显现,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,凝胶中加入系列两性电
19、解质载体，在电场中形成一个连续而稳定的线性pH梯度，样品加于凝胶上部，蛋白质根据不同的等电点被分离,IEE等电聚焦电泳,双向凝胶电泳,第一相：等电聚焦电泳将蛋白质按等电点进行分离将等电聚焦电泳的凝胶置于水平的SDS-PAGE凝胶的上样处第二相：SDS-PAGE电泳将蛋白质按分子量进行分离。图中水平方向代表了蛋白质等电点 的差别，垂直方向代表了蛋白质分子量的差别,四、层析分离蛋白质,层析（chromatography）又称色谱法，是根据溶液中待分离的蛋白质颗粒大小、电荷多少及亲和力等使待分离的蛋白质组分在两相中反复分配，并以不同速度流经固定相而达到分离蛋白质的目的,离子交换层析：利用各蛋白质的电
20、荷量及性质不同进行分离,是根据天然蛋白质相对分子质量大小进行分离的技术，又称分子筛层析,凝胶过滤层析,五、蛋白质颗粒沉降行为与超速离心分离,超速离心法 (ultracentrifugation) 既可以用来分离纯化蛋白质也可以用作测定蛋白质的分子量,蛋白质在离心场中的行为用沉降系数(sedimentation coefficient, S) 表示,沉降系数与蛋白质的密度和形状相关,因为沉降系数S大体上和分子量成正比关系，故可应用超速离心法测定蛋白质分子量，但对分子形状的高度不对称的大多数纤维状蛋白质不适用,六、蛋白质的一级结构分析,（一）用化学方法测定肽链的氨基酸序列（二）通过核酸来推演蛋白质
21、的氨基酸序列,得到一个蛋白质的一级结构有两种基本策略,水解法分析已纯化蛋白质的氨基酸残基组分,标记和测定多肽链的N端与C端的氨基酸残基,测定各肽段的氨基酸序列（Edman降解法、质谱法）,把肽链水解成片段,至少要用两种方法裂解多肽链，这两套肽段要逐一测序，最后根据其重叠区确定这些肽段的排列次序，从而得到整条肽链的一级结构,用化学分析方法测定肽链的氨基酸序列,水解法分析已纯化蛋白质的氨基酸残基组分,蛋白质水解后用离子交换层析分析其氨基酸组分,蛋白质经盐酸水解后成为个别氨基酸，用离子交换树脂将各种氨基酸分开，测定它们的含量，算出各氨基酸在蛋白质中的百分组成或个数,标记和测定多肽链的N端与C端的氨基
22、酸残基,N端,C端,胰蛋白酶,胰凝乳蛋白酶,胰蛋白酶,胰凝乳蛋白酶,胰凝乳蛋白酶,氨基酸分析,第二个分析循环,+PITC,+PITC,待测肽段,TFA裂解,切除了N端氨基酸的肽段,Edman降解法,通过核酸来推演蛋白质中的氨基酸序列,按照三联密码的原则推演出氨基酸的序列,分离编码蛋白质的基因,测定DNA序列,排列出mRNA序列,七、蛋白质的空间结构分析,通常采用圆二色光谱(circular dichroism，CD)测定溶液状态下的蛋白质二级结构含量。 -螺旋的CD峰有222nm处的负峰、208nm处的负峰和198nm处的正峰3个成分；而-折叠的CD谱不很固定,圆二色光谱可估算蛋白质二级结构比
23、例,蛋白质三维空间结构解析,X射线衍射法（X-ray diffraction）需要首先将蛋白质制备成晶体，X射线射至蛋白质晶体上，产生不同方向的衍射，收集衍射光束所产生的电子密度图，可计算出空间结构核磁共振技术（nuclear magnetic resonance, NMR）主要用于测定蛋白质的液相三维空间结构。冷冻电镜（cryo-electron microscopy）技术的发明极大提高了蛋白质三维结构的解析速度和分辨率，而且可以分析蛋白质在相对天然状态下的结构，当前已经成为结构生物学的主要研究手段,从头预测法 : 用分子力学、分子动力学的方法，根据物理化学的基本原理，计算蛋白质分子的空间结
24、构,生物信息学方法预测三维空间结构,同源建模法（homology modeling）:又称为比较建模法，是根据大量已知的蛋白质三维结构来预测序列已知而结构未知的蛋白质结构,预测蛋白质空间结构的方法主要有两类,生物大分子相互作用研究技术Technologies for Analyzing Interaction ofBiological Macromolecular,第六节,酵母双杂交 各种亲和分析（标签蛋白沉淀、免疫共沉淀等） 荧光共振能量转换效应分析 噬菌体显示系统筛选,一、常用蛋白质相互作用的研究技术,标签融合蛋白结合实验是一个基于亲和色谱原理的、分析蛋白质体外直接相互作用的方法,标签融合
25、蛋白结合实验主要用于证明两种蛋白质分子是否存在直接物理结合、分析两种分子结合的具体结构部位及筛选细胞内与融合蛋白相结合的未知分子,标签蛋白沉淀,GST融合蛋白沉淀实验,将蛋白X的编码基因插到GST编码序列的下游，表达为GST-蛋白X融合蛋白该融合蛋白的GST部分可以与偶联在琼脂糖珠上的GSH结合；蛋白Y可以籍与蛋白X相互作用，被琼脂糖珠间接沉淀下来经洗涤去除未结合的蛋白质，再用含游离GSH的缓冲液将GST-蛋白X融合蛋白竞争洗脱下来，经电泳染色即可证明两者的相互作用,如蛋白X和蛋白Y间存在相互作用，可用GST标签蛋白沉淀实验予以证明,酵母双杂交系统利用激活报告基因的表达来检测蛋白质-蛋白质的相
26、互作用,酵母双杂交技术（yeast two-hybrid system）,鉴定/分离新的相互作用蛋白质及其编码基因 分析已知存在相互作用的两种蛋白质分子的相 互作用功能结构域或关键的氨基酸残基 是建立哺乳动物双杂交系统的基础,酵母双杂交技术,二、蛋白质-DNA相互作用分析技术,electrophoretic mobility shift assay，EMSA)，又称凝胶迁移变动实验(gel shift assay) 最初用于研究DNA结合蛋白与相应DNA序列间的相互作用，可用于定性和定量分析，已经成为转录因子研究的经典方法。目前这一技术也被用于研究RNA结合蛋白和特定RNA序列间的相互作用,电
27、泳迁移率变动分析,凝胶迁移实验结果示意图,染色质免疫沉淀技术（chromatin immunoprecipitation，ChIP）,ChIP结合了PCR和免疫沉淀两种技术而发展起来，是研究体内DNA与蛋白质相互作用的方法,82,染色质免疫沉淀技术原理,分子杂交与印迹技术 DNA印迹、RNA印迹、蛋白质印迹 聚合酶链反应 PCR技术的定义、组成成分、原理、反应步骤、PCR衍生技术 DNA测序技术 发展简史、基本原理、应用 生物芯片技术 基因芯片、蛋白质芯片、组织芯片 蛋白质的分离纯化和结构分析 蛋白质的沉淀、电泳分离、层析分离、一级结构和三维结构分析 生物大分子相互作用研究技术 蛋白质相互作用、蛋白质-DNA相互作用,
