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1、专题5DNA和蛋白质技术,考点一DNA的粗提取与鉴定,1.基本原理提取原理DNA在NaCl溶液中的溶解度随浓度的变化而改变，DNA在0.14molL的NaCl溶液中溶解度最低。提纯原理（对酶、高温和洗涤剂的耐受性及在酒精中的溶解度不同）,酶的专一性蛋白酶水解蛋白质而对会对DNA不产生影响。（加柔嫩粉）蛋白质、DNA热稳定性不同。温度值为6080，因为该温度值蛋白质变性沉淀，而DNA不会变性。洗涤剂瓦解细胞膜，对DNA没有影响。,（3）DNA鉴定原理,在沸水浴条件下，DNA遇二苯胺呈现蓝色,(1)材料的选取：选用DNA含量相对 的生物组织，如非哺乳动物的红细胞（鸡血）、菜花、洋葱等。（2）材料处
2、理：鸡血（吸水胀破法），植物细胞（洗涤剂和食盐。食盐的作用是溶解DNA，洗涤剂的作用的溶解细胞膜）提取血细胞核物质(蒸馏水涨破)溶解(2 mol/L的NaCl溶液)过滤(除杂质)析出(滴蒸馏水，降NaCl溶液浓度至0.14 mol/L)过滤再溶解(2 mol/L的NaCl溶液)过滤进一步提纯(体积分数为95%的冷却酒精)鉴定。提纯环节中还可加入肉嫩粉（木瓜蛋白酶），将滤液放在6075的恒温水浴箱中保温1015分钟能去除滤液中的杂质,要点,1、三次过滤,2、两次沉淀析出,3、两次加蒸馏水,4.关于DNA粗提取与鉴定实验的有关说法正确的是A充分溶解DNA的盐溶液是0.14mol/L的NaCl溶液B
3、实验中提取较纯净的DNA利用了DNA不溶于酒精的特点C对最后提取出DNA用二苯胺试剂鉴定时需用酒精灯直接加热D实验操作过程中先后两次加入蒸馏水的作用相同,B,6.下列关于DNA粗提取与鉴定的说法正确的是A洗涤剂能瓦解细胞膜，同时也能控制DNA在NaCl溶液中的溶解度B在探究洗涤剂对植物细胞DNA提取的影响实验中，需要控制的变量是洗涤剂和植物细胞C常温下，DNA遇二苯胺被染成蓝色D将滤液放在6075的恒温水浴箱中保温1015分钟能去除滤液中的杂质，其原理是利用了DNA和蛋白质对高温耐受性的不同,D,7.下列有关“DNA粗提取与鉴定”实验原理的叙述正确的是（）ADNA在NaCl溶液中的溶解度，随N
4、aCl溶液浓度的降低而减小B利用DNA不溶于酒精的性质，可除去细胞中溶于酒精的物质而得到较纯的DNACDNA是大分子有机物，不溶于水而溶于所有有机溶剂D在沸水中，DNA遇二苯胺会出现紫色反应,B,PCR技术扩增DNA片段,1原理：DNA复制。2条件：模板、原料、酶。3场所：体外PCR扩增仪。4.过程：(1)变性:当温度上升到90以上时，双链DNA解旋为单链，(2)复性：温度下降到50左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合(3)延伸：温度上升到72左右，溶液中的四种脱氧核苷酸在DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链，,PCR扩增技术和DNA复制的比较,PCR技术的
5、应用 PCR技术模拟细胞内DNA的复制过程，实现对某一段DNA的扩增。PCR技术能在几小时内将极微量的DNA特异性地扩增上百万倍，从而有效地解决了因为样品中DNA含量太低而难以对样品进行分析研究的难题，大大提高了对DNA分子的分析和检测能力，被广泛地应用于基因克隆、基因序列分析、遗传病诊断、古生物学研究以及刑侦破案、亲子鉴定等诸多方面。,考点二血红蛋白的提取和分离,1.凝胶色谱法凝胶色谱法是根据相对分子质量的大小分离蛋白质的方法之一。所用的凝胶实际上是一些微小的多孔球体，这些小球体大多数是由多糖类化合物构成的，小球体内部有许多贯穿的通道，当一个含有各种分子的样品溶液缓慢流经时，相对分子质量较大
6、的蛋白质分子不能进入凝胶颗粒内部，只能分布在颗粒之间，通过的路程较短，移动速度较快；相对分子质量较小的蛋白质分子比较容易进入凝胶内的通道，通过的路程较长，移动速度较慢。因此，样品中相对分子质量较大的蛋白质先流出，相对分子质量较小的分子后流出。,2.电泳凝胶电泳法的原理是不同蛋白质的带电性质、电量、形状和大小不同，在电场中受到的作用力大小、方向、阻力不同，导致不同蛋白质在电场中的运动方向和运动速率不同。从而达到对样品进行分离、鉴定或提纯的目的。,4.实验操作流程 样品的处理 粗分离透析(去除小分子杂质)纯化凝胶色谱法进行分离和纯化 纯度鉴定SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定相对分子质量,下列有关提
7、取和分离血红蛋白的叙述中，不正确的（）A.样品的处理就是通过一系列操作收集到血红蛋白溶液B.通过透析可以去除样品中相对分子质量较大的杂质，此为样品的粗提取C.可以通过凝胶色谱法将相对分子质量较大的杂质蛋白除去，即样品的纯化D.可以通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定血红蛋白的纯度,B,解析：选B。样品处理是洗涤红细胞，使血红蛋白释放出来，通过离心法得到血红蛋白溶液。透析袋能使小分子自由进出，则大分子留在袋内，这样可以去除样品中相对分子质量较小的杂质。当相对分子质量不同的蛋白质通过凝胶时，这些蛋白质分子就可以分离开。判断纯化的蛋白质是否达到要求，通常用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法对蛋白质的纯度进行鉴定
8、。,4(2011广东卷，5)以下关于猪血红蛋白提纯的描述，不正确的是()A洗涤红细胞时，使用生理盐水可防止红细胞破裂 B猪成熟红细胞中缺少细胞器和细胞核，提纯时杂蛋白较少 C血红蛋白的颜色可用于凝胶色谱法分离过程的监测 D在凝胶色谱法分离过程中，血红蛋白比分子量较小的杂蛋白移动慢,对位训练,答案D,解析 猪成熟红细胞中缺少细胞器和细胞核，提纯时杂蛋白较少，是提纯血红蛋白的理想材料。提纯血红蛋白分四步：红细胞的洗涤、血红蛋白的释放、分离血红蛋白溶液、透析，其中洗涤红细胞时，要用生理盐水反复洗涤，既要将红细胞洗涤干净，又要不破坏红细胞，然后再用蒸馏水和甲苯使红细胞破裂，释放出血红蛋白。分离提纯血红
9、蛋白时用凝胶色谱法，其原理是根据相对分子质量的大小来分离蛋白质，相对分子质量大的蛋白质移动速率较快；血红蛋白的颜色可用于观察红色区带的移动情况，并据此判断分离效果。,(5)实验过程中加入柠檬酸钠的目的是防止血液凝固；低速、短时离心防止白细胞沉淀；缓慢搅拌防止红细胞破裂释放出血红蛋白。(6)检测血红蛋白的分离是否成功的方法：如果凝胶色谱柱装填得很成功、分离操作也正确，能清楚地看到血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整，随着洗脱液缓慢流出；如果红色区带歪曲、散乱、变宽，说明分离的效果不好，这与凝胶色谱柱的装填有关。,考纲能力技术实践应用能力 考题1 血红蛋白是人和其他脊椎动物红细胞的主要组成成分，负责
10、血液中O2和部分CO2的运输。请根据血红蛋白的提取和分离流程图回答问题。,考题链接 1.蛋白质的提取与分离技术,(1)将实验流程图补充完整：A为_，B为。凝胶色谱法的基本原理是根据分离蛋白质的有效方法。(2)洗涤红细胞的目的是去除，洗涤次数过少，无法除去；离心速率过快和时间过长会使一同沉淀，达不到分离的效果。洗涤干净的标志是。释放血红蛋白的过程中起作用的是。(3)在洗脱过程中加入物质的量浓度为20 mmol/L的磷酸缓冲液(pH为7.0)的目的是。如果红色区带，说明色谱柱制作成功。,血红蛋白的释放,样品的加入和洗脱,量的大小,杂蛋白(血浆蛋白),血浆蛋白,胞和淋巴细胞,离心后的上清液中没有黄色,蒸馏水和甲苯,准确模拟生物体内的生理环境，保持,均匀一致的移动,体外的pH和体内的一致,相对分子质,白细,体会(1)实验原理：依据蛋白质的各种特性可以将不同种类的蛋白质分离。(2)常用方法 凝胶色谱法：根据相对分子质量的大小分离蛋白质。电泳：利用待分离样品中各种分子带电性质的差异及分子 本身大小、形状的不同产生不同的迁移速率，由此将各种分子分离。(3)蛋白质的提取和分离一般分为四步：样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。,
