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1、项目名称：脑血管疾病发生和防治的基础研究首席科学家：苏定冯 中国人民解放军第二军医大学起止年限：2009.1至2013.8依托部门：总后勤部卫生部 上海市科委一、研究内容以脑卒中为代表的脑血管疾病发生率高、危害性大。脑卒中的发生具有不可预测性，发生以后有效治疗的时间窗很小(3-6小时)，神经细胞一旦死亡病人的功能恢复非常困难。尽管急性期脑卒中的死亡率显著下降，但脑卒中的发生率是有增无减、越来越高。因此，预防脑卒中的发生是关系国计民生的重大科学问题。本项目要解决的关键科学问题是：(1) 以脑卒中的发生机制为重点研究内容，确立干预脑卒中发生的新靶标。首先要深刻认识脑卒中发生的病理生理学机制和影响其
2、发生的相关因素，找出其中可以作为药物干预的新的靶点，用经典的药物、基因治疗、转基因、基因敲除、RNA干扰等手段，对这些新的靶点进行验证性治疗，最终确定3-5个可用于脑卒中预防的新靶标；(2) 以严格的脑卒中分型诊断和颅内动脉影像学诊断为基础，研究易感基因。通过严格的脑卒中分型诊断，建立脑卒中病人的分型数据库；通过严格的脑血管影像学检查，建立脑血管狭窄病人数据库。对他们的DNA进行SNP分析和其他研究，发现中国人各型脑卒中和高血压伴颅内动脉狭窄的易感基因，找出高效率的预测脑卒中发生的新指标。根据这些指标，探讨对高危人群进行干预的可能性；(3) 以神经血管单元为对象，研究如何改善脑卒中的治疗。在脑
3、卒中神经损伤与保护的研究方面，我们不应把恢复脑血流和保护神经元作为两个独立的治疗目标，而是要把神经血管单元作为一个整体进行研究。发现新的调节因素，作为干预靶点，改善脑卒中的治疗；(4) 探索新技术、新方法和新的活性化合物在脑卒中研究和防治中的应用。随着分子生物学技术的发展，一大批新的技术和方法用于或将要用于临床。但在脑卒中的防治中尚不成熟。此外，脑卒中发生发展的深入的分子机制和信号转导通路尚不清楚。在本项目研究中，我们将首先完善两个技术平台：转基因技术平台和化学生物学平台(小分子探针技术平台)。利用这两个技术平台阐明脑卒中发生发展的深入的分子机制和信号转导通路，验证我们发现的脑卒中预防和治疗的
4、新靶点。并希望给以后的临床应用提供理论基础。(一) 脑卒中发生新的决定或影响因素研究鉴于已知的有关因素不足于解释脑卒中的发生，因此研究新的决定或影响因素是当今重要的研究前沿。以血管为基准，我们把这些影响因素分为血管内、血管壁和血管外三个方面来叙述。从血管外(或全身性)因素看，关键的科学问题有：(1)动脉压力感受性反射(ABR)功能。我们以前的工作提示ABR功能低下导致脑卒中易发。那么，ABR功能低下是如何导致脑卒中易发的？尼古丁alpha7受体是否起重要作用？没有高血压存在的情况下，ABR功能低下是否也能导致脑卒中易发？(2)热量限制。我们在以往的研究中发现热量限制可以大幅度地延缓脑卒中的发生
5、。那么，热量限制延缓脑卒中发生的主要机制是什么？Sirtuin是否起决定性作用？有无可能找到热量限制起保护作用的靶分子？由于热量限制在实践中不容易推广，有无可能用相应的靶分子作为药物新靶点，用药物替代限食？(3)炎症反应。全身性的炎症反应与脑卒中的发生有没有确切的关系？抗炎治疗能否作为脑卒中预防的新策略？在脑卒中的发生中最重要的炎症因子是哪一个？(4)脂肪细胞因子。具有调节代谢、胰岛素敏感性、血管功能、炎症免疫等多种功能活性的脂肪细胞因子能否作为脑卒中防治新靶标？能否寻找到有效调节脂肪细胞因子表达/活性的天然活性化合物？其脑卒中的防治疗效和机制如何？从血管因素看，血管重构是脑血管疾病发生的关键
6、。以往对离子通道在脑血管重构中所起作用研究较少。少量的研究也仅仅涉及阳离子通道，对于氯离子通道在其中的作用主要由本项目组成员开展研究，刚刚起步。关键的科学问题有：平滑肌Cl-通道（容积调节性/ClC-3及Ca2+激活Cl-通道）与Ca2+通道（ROC和SOC）是怎样参与脑血管重构的？这些通道在脑卒中发生过程中起什么样的作用？其作用相关的分子机制是什么？如何为防治脑血管重构、进而预防脑卒中从离子通道角度提出新思路及新靶点？从血管内因素看，关键的科学问题有：巨噬细胞吞噬脂质成为泡沫细胞，与T淋巴细胞相互作用，分泌大量炎性因子，产生活动性炎症是不稳定斑块的重要特征。Tim分子对巨噬细胞及T淋巴细胞均
7、有重要调控作用，Tim在巨噬细胞泡沫化、与T淋巴细胞相互作用并介导内皮细胞损伤中发挥什么作用？哪些分子在此过程中起到关键作用？能否针对这些分子进行干预以减轻或消除斑块内炎症？已知多种炎症因子可通过增强斑块纤维帽胶原的分解代谢途径而诱导斑块破裂，但这些因子在胶原代谢中的分子调节机制尚不清楚。能否通过研究炎症因子对各个胶原酶转录的影响以明确炎症在斑块易损中的作用机制和发现新的干预靶点？为解决这些科学问题，拟进行以下三方面的研究： 1. 影响脑卒中发生的全身性因素。(1)建立动物模型：对于脑卒中的动物实验大部分采用大脑中动脉阻塞，观察脑损伤情况。如果要对预防脑卒中的作用进行评价，必须使用自发性脑卒中
8、动物模型。大鼠有遗传性的SHR-SP，但无法用于小鼠，这是个世界性难题。因此，建立小鼠自发性脑卒中动物模型十分必要，以便能使用基因敲除小鼠来研究自发性脑卒中的发生；(2)针对ABR功能。用alpah7基因敲除小鼠研究ABR功能低下导致脑卒中易发的alpha7机制；用我们自己培育的全世界唯一的自发性ABR功能缺陷大鼠进一步研究ABR功能与脑卒中的关系；寻找改善ABR功能的药物，用于脑卒中的预防；(3)针对热量限制。用Sirt1基因敲除小鼠和慢病毒RNA干扰，研究限食延缓脑卒中的Sirtuin机制；从天然药材中筛选Sirt1激动剂并用于脑卒中的预防；热量限制发挥脑卒中保护作用的其他机制研究，包括雌
9、激素受体机制、ABR功能改善机制等；(4)针对炎症因子。用SHR-SP与普通的SHR比较，观察各组织和血清中炎症因子(或与炎症反应有关的因子)的差异表达。对差异表达明显的因子的相应基因进行测序，观察DNA有无突变位点，进一步研究该突变位点对蛋白表达有无影响(意义)。用基因敲除小鼠，制成2肾2夹自发性脑卒中模型，观察白介6、白介10、E选择素等在脑卒中发生中的作用。用过表达的方法观察以上因子对SHR-SP脑卒中发生的影响；(5)针对脂肪细胞因子。采用多种干预手段，如：visfatin重组蛋白、特异性酶抑制剂FK866、酶产物NMN、抗体、基因overexpression、基因knockdown等
10、，确认visfatin能否作为脑卒中防治新靶标；寻找能上调visfatin表达的天然活性化合物，研究其脑卒中防治疗效和机制；采用基因芯片差异筛选等策略，发现新的脂肪细胞因子，研究其对血管、脑细胞的作用，确认其能否成为脑卒中防治新靶标。(6)针对其他因素。通过蛋白质组学、基因芯片、代谢组学和miRNA芯片等手段，用SHR-SP和普通的SHR进行比较(以利于去除高血压引起的差别)，找出差异，进行深入的研究。比如我们发现SHR-SP大脑中的醛脱氢酶显著低于SHR，该酶的产物之一dopac降低。我们将研究：首先醛脱氢酶是怎样降低的，对相应的基因DNA测序，发现有无突变位点，如有特别，确定该突变是否足以
11、引起表达差异。或者调节醛脱氢酶的基因发生了改变，等等。其次，研究醛脱氢酶降低的后果(底物dopal是一种醛，有细胞毒性)，是否与脑卒中的发生有关。2. 影响脑卒中发生的血管壁因素。用SHRSP及2肾2夹肾血管性高血压大鼠研究氯离子通道和钙离子通道在脑血管重构中的作用：(1)Ca2+激活Cl-通道。探讨在高血压脑血管重构过程中及脑卒中发生的脑血管平滑肌细胞Ca2+激活Cl-通道活性与调节的变化，以及与Ca2+调控之间的关系；(2)容积调节/ClC-3 Cl-通道。研究高血压脑血管重构/脑卒中脑血管平滑肌细胞该通道的功能及调节通路变异；建立靶向敲除血管平滑肌ClC-3动物模型，在此基础上建立相应野
12、生型动物高血压模型，在基因水平比较ClC-3对脑血管重构的影响；研究ClC-3对脑血管平滑肌细胞增殖/凋亡调节机理；确定ClC-3功能型酪氨酸磷酸化位点；研究ClC-3-ROS在脑卒中发生所扮演的角色；(3) Ca2+通道。研究在脑血管重构及脑卒中发生过程脑血管平滑肌细胞ROC/SOC功能变化；研究ROC/SOC对脑血管平滑肌细胞增殖/凋亡及ROS生成作用与机理；观察特异性阻断ROC/ SOC的人参皂甙单体Rd干预后对脑血管重构脑卒中的作用及相关作用机理。3. 影响脑卒中发生的血管内因素。(1) 不稳定斑块活动性炎症机制的研究。巨噬细胞泡沫化及其与T细胞的相互作用在不稳定斑块活动性炎症形成中具
13、有重要作用。拟研究Tim分子在不稳定斑块形成中各类免疫细胞上的表达及其表达调控模式；Tim在AS特异性抗原ox-LDL活化巨噬细胞中的作用及其分子机制；Tim对巨噬细胞-T淋巴细胞相互作用的影响；Tim通路在斑块破裂过程中主要炎症细胞功能发挥中的作用，寻找关键分子，应用siRNA等手段干扰关键分子或其胞内信号传导通路以观察对不稳定斑块破裂的影响；(2) 炎症介导血管胶原代谢的分子机制研究。我们首次阐明了TNFa导致斑块纤维帽胶原降解和斑块易损的ASK1JNKNonO 的信号转导通路。拟继续做如下研究：观察血管炎症中主要的炎性因子对脑血管壁中富含的I型、III型和VI型胶原代谢的影响；应用siR
14、NA及PGL-3荧光报告载体等技术,发现启动子反应序列及相应的转录因子，并应用通路抑制剂和过表达载体等观察炎症因子干预胶原代谢的信号转导通路；研究TNFa对P4Ha1干预调节的机制，观察NonO和DJ-1蛋白的变化。观察ROS通路在TNFa导致的DJ-1过氧化形成OX-DJ-1的过程中所起的作用；(3)其他研究。包括高血压导致血管壁细胞凋亡机制的研究，非瓣膜病心房颤动时血栓形成机制的研究，脑卒中早期生物标志物的研究和血管内皮细胞eNOS表达分子机制的研究等。(二) 脑卒中的易感基因研究脑卒中有许多亚型，各种亚型的发生机制不一样，其相应的易感基因也可能不一样。以往对脑卒中易感基因的研究成效不大的
15、原因可能与此有关。能否通过建立中国人的脑卒中分型资料库，发现不同发病机制分型的脑卒中患者的易感基因，提高脑卒中预测、预防的有效性，是一个重要的问题。此外，颅内动脉狭窄是国人缺血性脑卒中的理想中间表型。能否通过研究与颅内动脉狭窄相关易感基因，识别国人缺血性脑卒中易感基因，进而找出可用作预测、预防脑卒中的基因变异？为解决这些问题，本项目拟进行以下研究工作： 1. 研究各亚型脑卒中的易感基因。通过进行包括脑卒中临床、实验室检查、辅助检查、治疗及预后等信息的大样本登记研究，建立以发病机制为基础的脑卒中分型数据库，研究不同发病机制分型脑卒中患者的生化标记物和易感基因，对不同的发病机制分型与患者的临床表现
16、与预后等进行相关性研究。 2. 研究颅内动脉狭窄病人的易感基因。通过对高血压患者中无症状性颅内动脉狭窄的筛查及其危险因素分析，为全基因组关联研究提供样本，并阐明高血压患者发生颅内动脉狭窄的危险因素；开展颅内动脉狭窄的全基因组关联研究，识别国人高血压患者中与颅内动脉狭窄相关的SNP位点；通过为期3年的随访研究，进一步验证上述研究发现的基因位点及心血管危险因素在颅内动脉狭窄发生、发展中的作用。 3. 脑卒中的家系研究。大部分脑卒中的遗传属于多基因遗传，但是也存在一些以脑卒中为主要表现的单基因遗传病。对脑卒中的特殊家系研究，有可能发现新的单基因遗传性疾病。如果是多基因遗传，家系研究也有助于发现易感基
17、因。我们最近收集到2个大的脑卒中家系。(三) 针对脑卒中神经损伤和神经保护的研究 针对缺血性脑卒中神经损伤与神经保护的研究，长期以来主要聚焦于神经元而忽略了占脑体积90以上的神经胶质细胞(包括星形胶质细胞、小胶质细胞等）。近年来的研究表明保护胶质细胞的正常生理功能已经成为脑卒中神经保护的重要策略。进而，应该重视神经血管单元(neurovascular unit)的集成研究。神经血管单元包括：神经元、星形胶质细胞、小胶质细胞、血管内皮细胞及胞外基质等。但是对该单元中各组分的相互调节作用尚缺乏研究，在脑卒中发生时的相互依赖关系尚不清楚。在脑卒中发生时起保护作用的内源性物质有哪些？能否作为药物作用的
18、新靶点？脑卒中损伤进程中神经再生障碍的细胞与分子机制是什么？为回答这些问题，拟进行如下研究：1. 系统研究神经-血管单元在脑卒中神经损伤中的作用及其相互调节，阐明脑卒中神经损伤的关键病理机制，为临床治疗学的突破提供有益的思路与策略； 2. 发现与脑卒中神经损伤高度相关的基因、受体、离子通道、酶、信号转导的关键分子等，为研发理想的神经保护剂提供新的靶点；3. 应用基因组学、蛋白组学知识与技术，探索增强已知的内源性神经保护的途径，发现新的内源性神经保护通路及其调节规律；4. 研究、阐明脑卒中损伤进程中神经再生障碍的细胞与分子机制，探索促神经再生和干细胞移植在脑卒中神经损伤治疗中的应用及其学术基础；
19、5. 根据学术研究发现的新靶点，设计、合成及从天然产物中获得靶向性先导化合物，为发展自主创新的神经保护剂积累基础。(四) 新技术、新方法和新化合物在脑卒中研究和防治中的应用随着分子生物学的发展，一些新技术和新方法应用于基础研究。转基因技术在研究疾病发生的分子机制和发现新治疗靶点的过程中具有不可替代的作用，通过融入RNA干扰等其它新技术，人为调高或者调低特定蛋白质的表达，可以验证和确定我们前期发现的和本项目新发现的脑卒中发病原理，获得具有潜在应用价值的新治疗靶点。此外，把小分子化合物作为小分子探针，探索与某些疾病有关的靶分子的信号转导通路越来越受到人们的重视。我们现有两个技术平台：转基因技术平台
20、和化学生物学技术平台。如何利用这两个技术平台为脑卒中发生、防治的基础研究服务，是本项目要解决的关键问题。1. 在其它课题组发现对脑卒中边缘区细胞转归有益和有害因子，提出脑卒中边缘区细胞转归机制新理论的基础上，协助其它课题组制备携带这些基因的载体或携带能产生这些基因siRNA的载体，通过边缘区转基因，观察其对脑卒中转归的影响，以明确我们新发现的边缘区细胞转归的分子机制，找出新的治疗靶点。2. 经尾静脉给SHR-SP注射带类固醇激素合成急性调节蛋白(StAR)的I 型腺相关病毒载体（AAV1-StAR），人为提高肝脏内清除血脂的次要途径，观察脑动脉粥样硬化的形成、脑动脉张力、脑卒中发生率和严重程度
21、。为我们提出的通过肝脏转基因，提高原本次要的将血脂清除出体外或者动脉壁的途径，达到稳定甚至消除动脉粥样硬化斑块、降低脑卒中发生率的目的的新策略提供实验依据。 3. 给SHR-SP的脑动脉转染AAV1-StAR，提高血管内皮细胞清除和逆向转运胆固醇的能力，观察其对脑卒中发生率和严重程度的影响，探讨通过调控脑动脉内皮细胞脂质代谢预防再卒中的假设。4. 给SHR-SP的脑动脉转染AAV1-IL-10（白介素-10），提高血管内皮细胞生存力，抑制血管内膜炎症，观察其对脑卒中发生率和严重程度的影响，验证通过持续抑制脑动脉内膜炎症预防再卒中的假设。5. 用实时PCR列阵、多因子酶标检测法从病灶组织中筛选出
22、表达增加最明显的5种对炎症有调节作用的细胞因子或化学因子，制备相应的AAV1基因载体，转染MSC并用于脑卒中实验性治疗，比较它们对脑缺血后再灌注的损伤与炎症、边缘区细胞和转基因细胞本身的转归、血管重构、血管新生以及大鼠神经功能与行为障碍的影响，明确脑卒中病症微环境中最重要的影响边缘区细胞转归的因子，并获得1-2个新的治疗靶点基因。6. 我们建立化学生物学技术平台包含了从500种常用中药里分离出40000个中药小分子组分(平均每个组分含11个单体化合物)。我们已经找到了一个水通道蛋白4(AQP4)的阻断剂和一个氯离子通道阻断剂。此外，目前正在筛选的新化合物主要针对本项目组其他人提出的新的靶分子，
23、如Sirt1的激动剂、a7受体激动剂、白介素6的拮抗剂等。提供各个课题组进行深入的研究。二、预期目标总体目标：本项目以脑卒中发生的决定因素或影响因素为研究重点，以SHR-SP大鼠和2肾2夹自发性脑卒中小鼠为基本动物模型，以整体动物脑卒中发生实验、蛋白质组学技术、基因敲除、RNA干扰等为基本手段，通过深入的病理生理学研究，阐明脑卒中发生的新的决定或影响因素。并用基因转移和新的来源于植物的活性化合物针对新靶点进行试验性治疗，以验证可能的预防脑卒中的新靶点。同时，以现有的脑卒中分型数据库和颅内动脉狭窄病人的数据库为基础，充分利用我国的临床病人的资源，扩大数据库规模，采用各种先进的手段，研究各型脑卒中
24、和研究颅内动脉狭窄的易感基因和遗传标志物。阐明脑卒中发生新的决定因素或影响因素，阐明我国脑卒中的易感基因和遗传标志物，为制定适合我国国情的针对脑卒中的早期预警和干预策略及防治方案提供科学依据，使脑血管疾病的发生率显著降低。五年预期目标：1. 确立1-2个有关脑卒中发生的新理论，用于指导脑血管疾病的防治；2. 找出3-5个新的与脑卒中发生有关的靶分子，明确其功能及临床意义；3. 找出脑卒中各种亚型和颅内动脉狭窄相应的易感基因和遗传标志物，力争将它们连同上述新的靶分子一起用作脑卒中的预警指标； 4. 本项目实施中取得的基础性研究成果将在国际刊物上发表IF5.0的SCI收录文章50篇以上，其中IF1
25、0的8篇，顶级杂志1-3篇；5. 本项目实施中将培养博士生200名，争取有4-8篇论文评上全国优秀博士论文；培养年轻教师50名，争取评上国家杰青4-8名；6. 提升现有的脑血管病研究基地的学术地位，形成3-5个新的临床与基础研究相结合的脑血管病研究基地。三、研究方案总体研究方案本课题项目分为四个部分，以影响或决定脑卒中发生的因素为研究核心，将脑卒中有关的易感基因、神经损伤机制、新技术和新方法以及新的活性化合物四方面的研究结合在一起。第一部分从血管外(全身性)因素(包括调节紊乱、代谢紊乱、炎症反应等)、血管因素(血管重构)和血管内因素(斑块的稳定性、血栓形成)，研究脑卒中发生的影响或决定因素；第
26、二部分以脑卒中的临床分型为基础，以颅内动脉狭窄为重点，研究各型脑卒中和脑卒中的中间表型颅内动脉狭窄的易感基因和遗传标志物；第三部分为神经损伤机制的研究，重点研究神经血管单元；第四部分通过新方法、新技术和新的化合物，验证防治脑卒中新的靶点，并为最终用于脑卒中的防治打下基础。这四个部分又可分成8小块，相对应于8个课题组的主要研究内容，各部分之间紧密地联系，并相互促进，图示如下：易感基因验证新靶点新技术新方法新化合物神经血管单元研究管壁因素:血管重构管内因素:斑块不稳定 验证新靶点预测预防治疗全身因素:脂肪细胞因子全身因素: 神经调节、能量代谢第一部分 脑卒中发生的决定或影响因素研究影响脑卒中发生的
27、全身性因素拟采用两种策略：撒网法和垂钓法。前者采用基因芯片、miRNA芯片、蛋白质组学和代谢组学等手段，发现与脑卒中发生有关的靶分子(如下图左侧)。采用SHR-SP与SHR比较，旨在排除高血压因素，使差异更多地代表脑卒中。对找到的靶分子进行深入的研究，利用RNA干扰、转基因治疗、基因敲除等方法进行中间表型验证和终点指标验证。垂钓法根据我们以前的发现和某些文献的启示，选定一些可能的靶点或靶分子进行深入的研究。最终验证该靶点或靶分子能否作为预防脑卒中的新靶点(如下图右侧)。SHR-SP vs SHR基因敲除小鼠2K2CSHR-SP终点指标功能验证(脑卒中的发生)中间表型功能验证(炎症，凋亡等)我们
28、发现或文献报道可能的靶点蛋白组学代谢组学RNA干扰基因治疗RNA干扰基因敲除基因芯片miRNA芯片差异表达的靶分子基因治疗基因转移研究的创新性：(1)国外有用基因敲除小鼠研究该基因对大脑中动脉阻塞后神经损伤(梗死面积)的影响。由于缺乏合适的模型，无法观察某种基因是否影响自发性脑卒中的发生。而要预防脑卒中，必须观察对自发性脑卒中的影响。本项目建立了适合这种研究的动物模型，在该领域领先了一步；(2)我们在前期工作中发现ABR功能、长寿基因Sirtuin、脂肪细胞因子Visfatin、IL6等有可能成为脑卒中预防的新靶点，经过本项目的进一步深入研究，有可能确立其中几个新靶点。影响脑卒中发生的血管因素
29、研究方案见下图。在与人类高血压相近的遗传性易卒中自发性高血压大鼠（SHR-SP）及非遗传性易卒中双肾双夹高血压大鼠（RHR-SP）模型上，采用斑片钳单离子通道记录, 荧光影象动态测定单细胞胞浆Cl- 及分子生物学 等技术,探讨Cl-通道（容积调节性/ClC-3及Ca2+激活Cl-通道）与Ca2+通道（ROC和SOC）在高血压发展过程中血管平滑肌细胞Cl- 调控失平衡，脑血管重构及其过程中细胞增殖，凋亡及相关信号转导通路的内在关系， 以及在脑卒中发生过程中所起的作用及相关的分子机制, 并探讨通过他汀类等药物干预后的影响。阐明Cl-通道与Ca2+通道脑血管重构，脑卒中发生过程的作用；为寻找作用新靶
30、点用来防治高血压血管重构及其他并发症的新药予以佐证。研究的创新性：高血压发病机理包含遗传因素及非遗传因素；本研究是在遗传性易卒中自发性高血压大鼠及非遗传性易卒中肾性高血压大鼠模型上同步进行，研究工作是在高血压脑卒中发展过程中的不同阶段动态进行, 更能切实地反映出高血压易卒中发展过程中的规律；本研究是通过易卒中高血压大鼠整体实验与离子/通道水平及基因表达实验结合起来动态监测高血压发展过程中Ca2+ 与Cl- 通道的功能与调节的变化以及与血管重构，脑卒中的关系，故能更系统确切地揭示二者的内在关系。WKY大鼠SHR-SP（遗传性）假手术组大鼠RHR-SP（非遗传性）新鲜分离大脑中动脉，基底动脉容积依
31、赖性Cl-通道特性和信号调控：RhoA-Rho激酶调节通路、酪氨酸磷酸化通路PKC调节新鲜分离脑血管平滑肌细胞+他汀类+Rd-他汀类-Rd脑血管重构的形态学改变（光镜，电镜）血管重构标志物表达检测（免疫荧光）培养的脑血管平滑肌细胞对细胞增殖及相关信号转导通路的影响：u ERKu RhoA-Rho激酶调节通路u 细胞周期相关蛋白Ca2+激活Cl-通道特性和细胞Ca2+调控：不同类型Ca2+通道调节、CaMKII,calcineurin调节、通道分子基础ROC 和SOC特性以及与：u ROS生成的关系u Cl-通道调控的关系u 细胞增殖信号通路的关系对细胞凋亡及相关信号转导通路的影响：细胞色素C、
32、Bcl-2 Bax Caspase-3 Lamin A 及fodrin 等凋亡相关蛋白u 细胞周期相关蛋白+他汀类-他汀类ClC-3转染和siRNA干扰高血压不同阶段影响脑卒中发生的血管内机制研究方案如下图所示。建立小鼠颈总动脉斑块动物模型，大鼠房颤动物模型。针对易损斑块破裂脱落导致远端动脉闭塞，引起缺血性脑卒中。拟四方面研究影响脑卒中发生的血管内机制：(1)阐明27bp miRNA 对一氧化氮合成酶（eNOS）调节的分子机制以及血管内皮细胞存活和凋亡的关键因子及细胞内信号转导通路，了解它们在不稳定斑块的形成和发展中所起的作用。通过控制血管内皮细胞的凋亡，纠正内皮细胞的功能异常，以达到稳定斑块
33、的目的；(2)从炎症因子调节胶原合成代谢的有关途径入手，探讨炎症因子介导胶原合成代谢的传导通路及它们和血管已损斑块的关系，以期通过控制炎症因子来达到稳定斑块的目的。(3)探讨Tim 分子参与巨噬细胞活化的过程、巨噬细胞-T细胞相互作用的分子机制，明确Tim 分子在血管不稳定斑块炎症网络调节机制中的地位，为抑制斑块炎症反应而达到稳定斑块提供新的靶点和治疗途径。(4)了解非瓣膜性房颤患者血小板功能、凝血及纤溶状态的变化及其在止血和血栓形成过程中的作用，探讨非瓣膜性房颤患者高发缺血性脑卒中的分子机理，为非瓣膜性房颤脑卒中的防治提供新思路。研究的创新性利用ApoE基因敲除、高脂喂养、内皮损伤、脂多糖刺
34、激和应激状态等多重因素，建立了最大程度模拟人不稳定斑块病变的动物模型；27bp miRNA 是我们首次报道的对eNOS 表达有抑制作用的小RNA；构建27 sir-RNA 表达载体(Hue NOS-sir-RNA）和含有eNOS基因cDNA全长的表达载体（HueNOS-cDNA/nx27nt）载体，转入eNOS-/-老鼠的胚胎干细胞，产生出两种基因型转基因鼠，来研究miRNA在活体内对eNOS基因表达的影响，属于原创性工作；从血管内皮细胞存活和凋亡这两个方面的关键因子和胞内信号转导通路入手，研究它们在不稳定斑块形成和破裂中的作用及其交互对话，在国内外尚未见报道；首次提出血管炎症中主要的炎性因子
35、通过调节NonO ,DJ-1的变化, 来介导血管胶原合成代谢途径, 并影响斑块稳定性。提出非瓣膜性房颤患者体内存在的高水平氧化应激产物，使血小板表面CD36表达增加，并以CD36为受体，激活血小板，使患者形成高凝状态或血栓前状态，并最终引起缺血性脑卒中，是新的研究思路。第二部分 脑卒中各亚型和颅内动脉狭窄的易感基因研究脑卒中各亚型的易感基因研究脑卒中分缺血型和出血型脑卒中。缺血性脑卒中又可分成以下几类：动脉粥样硬化性大血管闭塞(流域性脑梗死)；动脉源性脑栓塞；低灌注性脑梗死；心源性脑栓塞；腔隙性脑梗死；其他机制；混合性；发病机制不明。一级评价(所有病人都必须有的检查)包括：脑影像：头颅CT和M
36、RI；脑供血动脉：TCD、颈动脉彩超、MRA；其他血管床：肾动脉彩超、ABI；相关血液化验：血糖、LDL、HDL、HCY、CRP和一般资料的收集和登记；二级评价包括：主动脉弓斑块检查；PFO筛查(TCD发泡试验，经食道超声)；TCD微栓子监测；脑血流动力学检查和头PWI/CT灌注；三级评价包括：心脏MRA；双肾及双下肢MRA；超声颈动脉弹性检查；磁共振颈动脉血流分析；头SWI(微出血)；DTI/T2(小血管病定量分析)。具体流程如下图。到2008年5月，我们已经建立了由20000例病人组成的数据库。本项目拟选择出血型脑卒中、动脉源性脑栓塞、低灌注性脑梗死、心源性脑栓塞、腔隙性脑梗死等5种主要类
37、型的脑卒中，每种200例，进行全基因组关联研究。患者就诊病因发病机制对症治疗初步评价发病机制明确预后评估故一级评价全基因组关联研究以发病机制为基础的脑卒中分型数据库预后评估故发病机制不明二级评价发病机制明确病因发病机制对症治疗初步评价预后评估故三级评价发病机制明确病因发病机制对症治疗初步评价预后评估故发病机制不明发病机制不明再次评价高血压患者中无症状性颅内动脉狭窄的筛查及其危险因素研究原发性高血压，无脑卒中史及临床症状和体征，男女不限。完成颅内动脉CTA检查1000-1500例。血管狭窄程度50%判定为颅内动脉狭窄。心血管危险因素的检查和纪录：包括基本信息；高血压病程；血压水平和服用降压药物史
38、；个人史；家族史等；体格检查；生化检查；部分对象进行高血压相关靶器官损害的检查。所有对象签署知情同意书，取外周血抽提基因组DNA。选取颅内动脉狭窄：300-500例，颅内动脉正常：300-500例。基因扫描：采用Illumina HumanHap500 SNP基因芯片。随访研究：对进入研究的2组所有对象(600-1000例)进行平均为期3年的随访。随访结束时，重复1次CTA和心血管危险因素检查。通过前瞻性研究分析，验证上述研究中发现的基因位点及心血管危险因素与颅内动脉狭窄的发生、发展及进展为缺血性脑卒中之间的因果关系(见下图)。研究的创新点：1. 建立前瞻性、大样本缺血性脑卒中发病机制分型数据
39、库，针对不同发病机制分型的脑卒中进行生化标记物和易感基因研究，有利于发现各型脑卒中的易感基因，大幅度提高脑卒中预测的有效性；2. 颅内动脉狭窄的GWA研究,为一原创性研究。与已发表的缺血性脑卒中的GWA研究比较，本研究采用CTA证实的颅内动脉狭窄作为缺血性脑卒中的理想中间表型，这一研究思路具有创新性，且符合国人特点。研究样本的均一性将明显好于该研究。此外，在样本量和扫描SNP的数量方面，本研究也均超过该研究。3. 在GWA研究的基础上进行随访，通过队列研究进一步证实横断面研究结果，在GWA研究上未见报道。第三部分 脑卒中神经损伤和神经保护的研究研究方案如下图所示。建立脑卒中的整体和细胞模型，针
40、对神经血管单元和脑卒中神经损伤的复杂级联反应开展系统研究，阐明神经损伤的细胞与分子机制，发现与脑卒中神经损伤高度相关的重要基因、受体、通道、蛋白、关键信号分子；应用基因组学、蛋白组学知识与技术，探索增强已知的内源性神经保护的途径和新的内源性神经保护通路及其调节规律；应用基因敲除技术，建立靶向性的生物模型（整体和细胞模型），予以研究、佐证。建立MCAO动物模型建立氧糖剥夺等细胞模型星形胶质细胞神经元小胶质细胞血管内皮细胞针对神经-血管单元的研究兴奋性毒性机制神经炎性机制细胞凋亡机制神经再生障碍针对损伤级联反应的研究发现与脑卒中神经损伤高度相关的重要基因、受体、通道、蛋白、关键信号分子发现针对神经
41、损伤复杂病理机制中关键环节的神经保护新靶点及其内源性神经保护新途径应用基因敲除技术建立靶向性的生物模型研究的创新点：1. 从整体、细胞和分子水平，系统研究、阐明神经血管单元在脑卒中神经损伤中的作用及其相互调节，有益于揭示与脑卒中神经损伤高度相关的复杂多元病理机制，为研发理想的多潜能神经保护剂提供有益的靶标。2. 应用基因组学、蛋白组学与神经生物学的集成技术与方法，不仅有益于研究、阐明脑卒中神经损伤级联反应的关键环节，也有益于探索增强机体内源性神经保护的途径，发现新的潜在的神经保护通路及其调节机制。第四部分 新技术、新方法和新化合物在脑卒中研究和防治中的应用新技术、新方法主要反映在转基因技术平台
42、。利用该技术平台，除了要配合其他课题组的需要外，本课题组本身的研究有以下几方面。动脉粥样硬化是脑卒中的主要原发病，StAR 是肝脏清除胆固醇次要途径的限速蛋白。申请者发现肝脏StAR转基因可降低肝脏和血液的脂质含量，减少主动脉壁脂质斑块。有望降低脑卒中的发病率和严重程度。由于是预防性治疗，基因载体将选用我们常规应用的低度高效能介导基因长期表达的AAV1做为基因载体。血管内皮细胞表达StAR，给脑动脉直接转染StAR，降低脑动脉壁脂质沉积，减少和稳定斑块，降低脑卒中的发病率和严重程度。IL-10、NDRG2或NOGO-B是内源性血管保护因子，可能通过保护脑血管内皮、调节平滑肌增殖、拮抗炎症等方面
43、的作用，减轻血管病变，减少再卒中的发生率。因此研究用这些内源性血管保护因子转基因预防脑卒中的可行性，并进一步探讨保护基因在脑血管疾病中的功能机制，具有重要的理论和实际意义。新化合物主要反映在化学生物学技术平台。目前我们已经利用500种常用中药建立了含40000个中草药小分子组分（平均每个组分含11个单体化合物）的天然化合物库。除了要配合其他课题组的需要外，本课题组首先要研究的靶分子有：AQP4阻断剂，Sirtuin激动剂，酸敏感通道ASIC1的阻断剂等。创新点与特色：1. 首次通过基因治疗手段提高体内原本存在但作用不明显的清除脂质的机制，达到预防脑卒中的目的；首次用减毒病毒载体介导脑卒中的转基
44、因干细胞治疗；首次进行针对脑卒中后缺血再灌注损伤和炎症的转基因干细胞治疗；首次针对脑卒中后产生的对干细胞有调节作用的细胞因子/化学因子网络进行筛选，寻找有望成为转基因干细胞治疗靶基因的因子并进行验证；2. 我们建立的天然药物库与众不同的特点有两点。一是涵盖面广，基于有效中草药的各种成分都不遗漏，特别是一些含量低的活性成分；二是效率高，能很快地得到有效单体化合物；3. 本项目拟研究的AQP4阻断剂，Sirtuin激动剂，酸敏感通道ASIC1的阻断剂等对脑卒中的防治作用都是作用于新的靶点的新化合物。课题设置本项目的课题设置分为八个部分，分别研究影响脑卒中发生的全身性因素(2个课题组)、血管因素(血
45、管重构)和管内因素(斑块的稳定性)、研究脑卒中的易感基因和遗传标志物、研究神经损伤和神经保护机制、研究新方法、新技术和新的天然活性化合物在脑卒中研究和防治中的应用(2个课题组)。各个课题在研究中各有侧重，但在脑卒中的预测、预防和治疗的各个环节中又互相联系，互相促进。课题一：神经调节、能量代谢等在脑卒中发生中的作用负 责 人： 苏定冯 54岁，教授，博士生导师，第二军医大学药学院学术骨干：陈丰原 46岁，长江讲座教授，博士生导师，第二军医大学药学院戴生明 38岁，副教授，硕士生导师，第二军医大学长海医院研究目标：确立对脑卒中的发生起决定性作用的靶系统一个、靶分子2-3个，并阐明其作用机理，为作为
46、预防脑卒中的干预靶点提供基础研究的证据。紧密联系临床，确定影响我国脑血管疾病发病的各种全身性的关键危险因素，为制定适合我国国情的针对脑卒中的早期预警和干预策略及防治方案提供科学依据。发表SCI论文，总IF 100, 其中IF5.0的论文10篇以上，IF10的论文2-3篇，争取在顶级杂志发表1篇，培养全国优博1-3名、国家杰青1-2名。研究内容：主要影响脑卒中发生的全身性因素。(1)建立动物模型：对于脑卒中的动物实验大部分采用大脑中动脉阻塞，观察脑损伤情况。如果要对预防脑卒中的作用进行评价，必须使用自发性脑卒中动物模型。大鼠有遗传性的SHR-SP，但无法用于小鼠，这是个世界性难题。因此，建立小鼠
47、自发性脑卒中动物模型十分必要，以便能使用基因敲除小鼠来研究自发性脑卒中的发生；(2)针对ABR功能。用a7基因剔除小鼠研究ABR功能低下导致脑卒中易发的a7机制；用我们自己培育的全世界唯一的自发性ABR功能缺陷大鼠进一步研究ABR功能与脑卒中的关系；寻找改善ABR功能的药物，用于脑卒中的预防；(3)针对热量限制。用Sirt1基因敲除小鼠和慢病毒RNA干扰，研究限食延缓脑卒中的Sirtuin机制；从天然化合物中筛选Sirt1激动剂并用于脑卒中的预防；热量限制发挥脑卒中保护作用的其他机制研究，包括雌激素受体机制、ABR功能改善机制等；(4)针对其他因素。通过蛋白质组学、基因芯片、代谢组学和miRNA芯片等手段，用SHR-SP和普通的SHR进行比较(以利于去除高血压引起的差别)，找出差异，进行深入的研究。比如我们发现SHR-SP大脑中的醛脱氢酶显著低于SHR，该酶的产物之一dopac降低。我们将研究：首先醛脱氢酶是怎样降低的，其次研究醛脱氢酶降低的后果(底物dopal是一种醛，有细胞毒性)，是否与脑卒中的发生有关。另外，与王拥军
