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1、NR2B在小鼠骨癌痛中的作用及机制研究 中南大学湘雅三医院 黄 东 教授,目前，全球癌症患者的数量呈,骨癌痛的具体机制,癌性疼痛成为影响癌症病人生活 质量的一个严重问题。,在癌痛中又以骨癌痛最为严重和最难以控制。,?,研究背景,癌痛的特点:,临床上，癌痛表现为进行性加重，常伴随有爆发痛；癌痛与炎性痛和神经病理性痛存在着不同的外周和中枢机制1。如癌痛：胶质细胞增生肥大；GFAP,1:Honore P.Neuroscience,2000,98:585598.,NMDA受体活化是反复伤害性刺激诱发中枢敏化 的基础，是持续性疼痛产生和维持的关键 2。大量研究证实：NMDA受体的亚基NR2B在炎性痛、神
2、经病理痛中参与了伤害性信息传递，在疼痛调 制及痛觉敏化 的形成和维持中发挥重要作用 3。,疼痛研究进展,2:Petrenko.Anesth Analg.2003,97(4):1108-1116.3:Nagy GG.Eur J Neurosci,2004,20(12):3301-3312.,（一）,研究显示，MAPK信号通路在神经可塑性和炎症 反应的细胞信号转导过程中起重要作用4。增生肥大的星形胶质细胞能释放大量胶质纤维酸 性蛋白（GFAP），骨癌痛的产生和维持与脊髓 星形胶质细胞结构和功能的变化密切相关1。,4:De Leo JA.Pain,2006,122(122):17221.,疼痛研究进
3、展,（二）,研究癌痛的确切机制，需要适当的动物模型，现有动物模型仍显不足。,小鼠骨癌痛模型的优势,肺癌是临床骨转移较多见的一种肿瘤，且小鼠在肿瘤 学及神经系统研究方面具有独特的优势。小鼠作为实验模型，较经济适用本实验参照Schwei等的方法，将Lewis肺癌细胞接种 于C57BL/6小鼠股骨骨髓腔，建立一个全新的骨癌痛 模型。,我们从如下四个方面加以研究：1、建立一个小鼠骨癌痛新模型2、NR2B在骨癌痛小鼠前扣带回和脊髓中的分 布与表达3、脊髓NR2B基因沉默对小鼠骨癌痛的影响4、MAPK信号通路介导的NR2B在小鼠骨癌痛中 的作用机制,NR2B是否也参与骨癌痛的发生机制呢？,实施方案：检测癌
4、痛小鼠脊髓和前扣带回NR2B的表达和分布，分析小鼠NR2B的表达和小鼠疼痛行为学关系。应用RNA干扰技术，沉默骨癌痛小鼠NR2B基因；通过对比干扰组小鼠与癌痛组小鼠NR2B的表达以及两组小鼠疼痛行为学，从而阐明NR2B是否在癌痛的发生与维持中起重要作用。,对比骨癌痛小鼠NR2B基因沉默前后，MAPK 信号通路及其介导的下游信号分子表达的相应改变；研究MAPK 信号通路中信号分子表达的相应改变与GFAP的关联性；探索MAPK信号通路在小鼠骨癌痛中的可能作用机制。,NR2B是怎样参与骨癌痛的发生机制呢？,选用清洁级雄性C57BL/6小鼠,模型组,一般情况观察,行为学测定,内容1技术路线,热灭活组,
5、PBS组,正常对照组,放射学检查,组织学检测,自发痛行为观察,机械性触诱发痛,选用清洁级雄性C57BL/6小鼠,癌痛组,一般情况观察,行为学测定,内容2技术路线,假手术组,正常对照组,实时定量PCR检测NR2B的表达,免疫组化检测NR2B的表达及分布,自发痛行为观察,机械性触诱发痛,Western Blot检测NR2B的表达,选用清洁级雄性C57BL/6小鼠,癌痛组,一般情况观察,行为学测定,内容3技术路线,干扰组,干扰对照组,实时定量PCR检测NR2B的表达,自发痛行为观察,机械性触诱发痛,Western Blot检测NR2B的表达,选用清洁级雄性C57BL/6小鼠,正常组,一般情况观察,行
6、为学测定,内容4技术路线,干扰组,干扰对照组,实时定量PCR检测NR2B、SP、c-fos和GFAP基因的表达,自发痛行为观察,机械性触诱发痛,Western Blot检测NR2B，p-ERK，p-p38和GFAP的表达,癌痛组,结 果,体重和一般状况,图1：观察期内各组小鼠体重的变化,2.行为学测试,图2：自发痛行为观察 图3：机械性触诱发痛测定,3.放射学检测,图4：模型组小鼠不同时间段术侧股骨X片结果:A为肿瘤细胞接种前摄片；B为接种后第7天；C为接种后第15天；D为接种后第23天。,组织学观察,骨髓腔破坏，肿瘤细胞穿破骨组织,A:接种第7天模型组小鼠股骨切片 B:接种第15天模型组小鼠
7、股骨切片,C:1接种第23天模型组小鼠股骨切片,C2:接种第23天模型组小鼠股骨 周围肌肉组织病检结果,图6：模型组小鼠术侧股骨下段不同时间段的HE染色（HE400）,行为学、放射学、组织学三方面证实：C57BL/6小鼠股骨骨髓腔接种Lewis肺癌细胞，能成功制备小鼠骨癌痛模型，且此模型稳定、重复性好，与人类骨癌痛高度相似。,本研究我们首次选用来源广泛、致瘤作用强的 Lewis肺癌细胞，接种于C57BL/6小鼠股骨骨髓 腔，建立了一个新的小鼠骨癌痛模型。,5、实时荧光定量PCR检测前扣带回和脊髓NR2B的表达,前扣带回NR2B的表达,前脑扣带回NR2BmRNA 相对表达量,脊髓NR2B的表达,
8、图5：脊髓NR2BmRNA 相对表达量,第14天前扣带回NR2B的表达 A癌痛组前扣带回100倍；B癌痛组前扣带回区域200倍 C正常组前扣带回100倍；D正常组前扣带回区域200倍 E假手术组前扣带回100倍；F假手术组前扣带回区域200倍,6、免疫组化检测前扣带回和脊髓NR2B的表达,前脑扣带回NR2B的表达,L4-L6脊髓NR2B的表达,L4-L6脊髓NR2B的表达（200倍）,术后第14天，L4-L6脊髓NR2B的表达,术后第18天，L4-L6脊髓NR2B的表达,癌痛组,假手术组,正常组,癌痛组,假手术组,正常组,L4-L6脊髓NR2B的分布,癌痛组 正常组 假手术组,L4-L6脊髓N
9、R2B的分布（接种后14天）,脊髓各层NR2B表达量在中央导水管、背角浅层、前角依次增多,7、Western Blot检测L4-6段脊髓NR2B的表达,*,术后第14天各组小鼠脊髓NR2B 术后第18天各组小鼠脊髓NR2B的表达，A:癌痛组B:假手术组C:正常组 的表达，A:癌痛组B:假手术组C:正常组,*,1、癌痛组小鼠脊髓和前扣带回中NR2B表达均明显增加，脊髓各层表达量由大到小依次为前角、背角浅层、中央导水管周围；且癌痛组NR2B表达上调的同时，疼痛行为学也有相应的改变。初步表明脊髓和前扣带回中的NR2B表达增加与小鼠骨癌痛产生和维持存在一定相关性。2、同一癌痛模型中观察到NR2B在脊髓
10、和前扣带回同时高表达，提示在癌痛的产生和维持中不仅激活了脊髓低位中枢，而且有脑部中枢的参与。3、本研究初次发现NR2B在脊髓前角细胞表达呈强阳性，为下一步研究提供了新的思路。,图3：癌痛组、干扰组和干扰对照组小鼠脊髓NR2BmRNA的相对表达量,8、实时荧光定量PCR检测小鼠脊髓L4-6节段NR2B的表达,9、Western Blot检测小鼠脊髓L4-6节段NR2B的表达,Western Blot检测接种术后第14天 小鼠脊髓L4-6节段NR2B的表达 A:干扰组；B:干扰对照组；C:癌痛组,NR2BGAPDH,A B C,*,Western Blot检测接种术后第18天 小鼠脊髓L4-6节段
11、NR2B的表达 A:干扰组；B:干扰对照组；C:癌痛组,NR2BGAPDH,*,1、PEI/NR2B-siRNA复合物鞘内注射后能使骨癌痛小鼠脊髓中NR2B的表达下调；2、骨癌痛小鼠脊髓中NR2B的表达下调与小鼠疼痛行为学减轻相一致，进一步证明NR2B在癌痛发生过程中起重要作用，可能是癌痛治疗的有效靶点。,10、实时荧光定量PCR检测小鼠脊髓NR2B、SP、c-fos和GFAP基因的表达,接种术后第14天，实时荧光定量PCR检测各组小鼠脊髓NR2B、SP、GFAP、c-fos的相对表达量 注：图示中NR2B组放大100倍，c-fos放大10倍,11、实时荧光定量PCR检测小鼠脊髓NR2B、SP
12、、c-fos和GFAP基因的表达,接种术后第18天，实时荧光定量PCR检测各组小鼠脊髓NR2B、SP、GFAP、c-fos的相对表达量 注：图示中NR2B和c-fos组均放大100倍,图5：Western Blot检测接种术后第18天 小鼠脊髓NR2B的表达 A:正常组；B:癌痛组；C:干扰组；D:干扰对照组,*,图6：Western Blot检测接种术后第14天 小鼠脊髓p-ERK的表达A:正常组；B:癌痛组；C:干扰组；D:干扰对照组,3.1 接种术后第14天，检测NR2B和p-ERK蛋白表达,NR2B,GAPDH,p-ERKGAPDH,*,12、Western Blot检测接种术后第14
13、天小鼠脊髓的NR2B，p-ERK，p-p38和GFAP蛋白表达,Western Blot检测接种术后第14天 小鼠脊髓p-p38的表达 A:正常组；B:癌痛组；C:干扰组；D:干扰对照组,*,Western Blot检测接种术后第14天 小鼠脊髓GFAP的表达A:正常组；B:癌痛组；C:干扰组；D:干扰对照组,*,13、接种术后第14天，检测p-p38和GFAP蛋白表达,GAPDH,GFAP,GAPDH,Western Blot检测接种术后第18天 小鼠脊髓NR2B的表达 A:正常组；B:癌痛组；C:干扰组；D:干扰对照组,Western Blot检测接种术后第18天 小鼠脊髓p-ERK的表达
14、A:正常组；B:癌痛组；C:干扰组；D:干扰对照组,接种术后第18天，检测NR2B和p-ERK蛋白表达,14、Western Blot检测接种术后第18天小鼠脊髓的NR2B，p-ERK，p-p38和GFAP蛋白表达,NR2BGAPDH,p-ERK,GAPDH,*,*,Western Blot检测接种术后第18天 小鼠脊髓p-p38的表达 A:正常组；B:癌痛组；C:干扰组；D:干扰对照组,Western Blot检测接种术后第18天 小鼠脊髓GFAP的表达A:正常组；B:癌痛组；C:干扰组；D:干扰对照组,接种术后第18天，检测p-p38和GFAP蛋白表达,p-p38,GAPDH,GFAP,G
15、APDH,*,*,1）癌痛小鼠的MAPK通路中相应信号分子p-ERK、p-p38、c-fos表达明显上调；而NR2B的沉默可以下调MAPK通路中相应信号分子p-ERK、p-p38、c-fos表达；2）GFAP在癌痛小鼠中高表达，同时NR2B的调控可以影响GFAP的表达；,解除Mg2+对NMDA受体离子通道的阻断作用,结合到突触后膜上配体门控离子型谷氨酸受体AMPA受体，Na+内流,NMDA受体激活，Ca2+内流增加,激活ERK，p38,c-fos转录因子激活,NR2B表达,伤害性信号传入脊髓背角，释放大量谷氨酸,SP表达,神经元下游相关基因表达变化,神经胶质细胞GFAP表达,结合到胶质细胞上A
16、MPA受体,激活ERK，p38,直接导致胶质细胞内的GFAP大量表达,导致癌痛,我们推测癌痛产生的可能机制,因此，,结 论,1.C57BL/6小鼠股骨骨髓腔接种Lewis肺癌细胞能成功制备小鼠骨癌痛新模型，此模型与人类骨癌痛具有相似性；2.NR2B在小鼠骨癌痛模型中呈高表达，且同一癌痛模型中观察到NR2B在L4-L6段脊髓和前扣带回同时高表达，提示在癌痛的产生和维持中不仅激活了脊髓低位中枢，而且有脑部中枢参与；3.本研究初次发现NR2B在癌痛模型的L4-6段脊髓前角细胞表达呈强阳性，为下一步研究提供了新的思路；,结 论,4.PEI/NR2B-siRNA复合物能特异性的使骨癌痛小鼠脊髓 NR2B的表达明显下调；其表达下调与小鼠疼痛行为学减轻相一致，进一步证明NR2B在骨癌痛发生过程中起重要作用；5.MAPK信号转导通路（ERK通路和p38通路）在骨癌痛小鼠模型中被激活；NR2B参与了MAPK信号通路介导的骨癌痛的中枢敏化；6.NR2B参与介导的骨癌痛可能与GFAP的过表达相关，其机制有待进一步研究。,
