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1、,体外放射分析,内容提要,Part one: 体外放射分析技术 Part two: 非放射免疫分析技术 Part three: 临床应用,历史,1960年美国的Berson和Yalow 将核技术与免疫学技术相结合建立了放射免疫分析法，并首先用于测定血浆胰岛素浓度，由于该法对医学的巨大贡献，1977年Yalow获得了Nobel奖。,Definition,在体外条件下 In vitro 以放射性核素标记的配体为示踪剂Tracer 以结合反应为基础 Base 以放射性测量为定量手段 Means 对微量物质进行定量分析Quantitative analysis一类分析方法的总称。 General na
2、me,Main methods,放射免疫分析、免疫放射分析、放射受体分析、受体放射分析、蛋白质竞争结合分析等。 其中以放射免疫分析和免疫放射分析应用最为普遍。 不仅可用于样品中蛋白质、多肽、甾体类激素等物质的测量，而且可用于具有生物活性的小分子物质的检测，如血药浓度测定等。,分类,Competive binding analysis 放射免疫分析是体外放射分析最有代表性的一类检测技术。另外还有放射受体分析、蛋白质竞争结合分析、放射酶促分析等。 Non-competive binding analysis 免疫放射分析、受体放射分析是典型的非竞争性体外放射分析。此外。还有酶的放射化学测定、酶的激
3、活剂或抑制剂测定法等。,Radioimmunoassay,RIA,是以抗原抗体的免疫反应为基础，利用待测抗原与定量的标记抗原同有限量的特异性抗体竞争性结合，以放射性测量为微量定量手段，获得待测生物样品中抗原浓度的技术。,Radioimmunoassay,RIA,抗原与相应的特异性抗体在适当条件的反应体系中能够产生结合反应，形成抗原抗体复合物。,标记物的制备和鉴定,常用放射性核素：125I方法1、直接法：最常用于肽类、蛋白质、酶的碘化标记，采用化学或酶促氧化反应直接将125I结合于被标记物分子中酪氨酸残基或组胺残基上。1）氯胺T法：125I-被ch-T氧化成125I+ ，后者取代酪氨酸残基苯环上
4、的氢原子。2）乳过氧化物酶法：LPO催化H2O2释放活泼的新生态氧，后者使125I-氧化成125I+ ，从而取代酪氨酸残基苯环上的氢原子。2、间接法：联接标记最常用。主要用于小分子化合物的标记。,标记物的纯化,1、凝胶过滤法（Sephadex G-50柱层析分离较常用）2、离子交换层析法3、聚丙烯酰胺凝胶电泳法（PAGE）4、高效液相色谱法（HPLC）,标记物的鉴定,1、放射化学纯度，一般要求大于95%2、免疫活性3、比放射性：单位化学量标记物中所含的放射性强度。,Competive inhibition curve,Binding rate（）Concentration of antigen
5、(mol/L),抗体的工作浓度,Ag*与Ag的免疫化学性质相同； Ag*与Ag之和大于Ab，Ag*与Ab的量保持恒定。 Binding rate(%) 50%Diluted multiple of Ab50的最大结合 率为抗体工作浓度,放射免疫分析,基本原理：,放射免疫分析,RIA竞争结合原理示意图：,Standard curve,如果采用系列已知浓度的标准品在相同条件下进行分析，测得各标准点的结合率(B/F)，以结合率对标准品量作图，可以得到一条标准曲线。通过这条标准曲线即可查得未知浓度的待测样品的含量。 结合率 50% 2 4 8 16 32 已知Ag浓度,标准曲线,标准曲线的拟合方式,标
6、准曲线是衡量待测样品中配体浓度的客观尺度 反映检测质量的指标 标准曲线要最大限度地反映量、效关系 便于自动化分析，使用灵活 每一批分析必须做一条标准曲线。,常用的方法有,log-logit坐标系及线性回归法： 是目前公认比较好的拟合方法，它是以结合率的logit值为纵坐标，以标准品浓度的对数值为横坐标，制成散点图，然后用最小二乘法对各散点进行直线回归，得出回归方程，获得标准曲线，可用计算机或计算器完成。,Log-Logist 作图法,logit Y=a+b logit Y=ln(logX/ 1-B/Bo ) a截距 b斜率为“-”值 Y结合率 Y与X呈负相关 r为负值，接近1表示曲线质量好,L
7、ogistic 法是log-logit的发展，但克服了log-logit的不足，也是目前认为较好的拟合方法。,半对数坐标系制图法制图方法简便，但易导致主观误差。 B/F (%) Log X,RIA的基本条件,特异性抗体：亲和力大，滴度高，特异性强标记抗原：纯度高；较高的比活度；放化纯度95%;保持免疫活性;标记稳定性好,无核素脱落标准品:与被测物属同一种物质,具有相等的活性,高度纯化;定量要精确(国家标准;药盒标准;质控标准)B与F分离技术:完全又快速,非特异性结合低;不易受外界因素的干扰;价廉,操作简便,重复性好(双抗法,沉淀法,双抗+PEG法,固相分离法,SPA法,微孔滤膜法)放射性测量仪
8、器: 计数器,Specific binding reagent,特异性结合剂抗体特异性(specificity)：交叉反应的程度越小越好 亲和力(affinity)：配体与结合剂相互结合的程度，是反映结合剂质量的主要指标。可用亲和力常数表示。 滴度(titer)：在RIA时，结合50%的标记配体的结合剂稀释度；IRMA分析要求较高滴度（过量）。,Labeled,标记品合适的核素标记（半衰期、射线类型、能量等） 标记物的用量要小，应等于或低于待测物的最小量 足够的比活度 放化纯度高 免疫活性 稳定性好，贮存不易脱标,Standard sample,标准品Qualitative request 质
9、的要求 与待测配体属同类物质 与待测配体有同等的活性和亲和能力 纯度高，不含其它杂质、稳定性好 Quantitative request 量的要求 定量精确,Separation technique,分离技术免疫分离法：利用抗原抗体结合形成的复合物 化学分离法：PEG等 物理分离法：电泳、层析、离子交换、活性炭 或树脂吸附等 生物分离法：葡萄球菌A蛋白（SPA） 固相分离法：包被试管、塑料球、磁化分离技术等。,Quality control 质量控制,A.反映测定精度的质量指标平均批内变异系数(C.V) 反应误差关系(RER) 精密度图 B.反映测定稳定性的质量指标及其影响因素零标准管结合率(
10、Bo) 非特异性结合率(NSB) 反映标准曲线的质量：截距(a)、斜率(b)、相关系数(r)及有效剂量ED25、ED50、ED75等,C.反映测定标准准确度的质量指标 回收率测定 ，二样本Youden图 D.反映测得方法灵敏度的质量指标用最低可测浓度表示测，是指能与不含有标准配体的零标准管的测定结果在统计学上区别开来的最低浓度。累计多批测定结果，计算出Bo%的平均值和标准差，经减去2倍SD后的结合率，从标准曲线上查出其对应的浓度，即为最低可测浓度。,RIA质量控制,实验室内QC:是一个实验室内部实验方法的QC,以便在一个人的同一批或不同批实验中,不同操作者和不同方法之间有可比性标准曲线的QC指
11、标:B0%:30%-50%,有效期内稳定; NSB%: 30%; 标准曲线直线回归的a,b值稳定,r 0.99; ED25,ED50,ED75稳定,RIA质量控制,质控图,RIA药盒质量控制,精密度:变异系数(批内CV 5%, 批间CV 5%-10%); 反应误差关系(RER 0.04);精密度图准确度:指测定值与已知真实值的符合程度.健全性:评价被测物与标准品的免疫活性是否相同的指标灵敏度:从生物样品总能够检出某物质的最小浓度特异性:交叉反应越小,特异性越好.,实验室外质量控制,即室间质控:对各实验室之间测定结果按统一评价方案及方法比较分析组织单位:各省临床检验中心,卫生部临床检验中心,Im
12、munoradiometric assay,IRMA免疫放射分析,也是以抗原抗体的免疫反应为基础，不同的是放射性核素标记的是抗体，以过量标记抗体直接与待测抗原结合。因此，溶液中放射性与待测物的浓度呈正相关。为非竞争性结合分析。 AgAb*(过量)=Ag.Ab*Ab*,免疫放射分析,基本原理,单位点法：,AgAb*(过量) Ag.Ab*Ab*(加抗原吸附剂去除多余Ab*)。,双位点法(Ab2为McAb),具有代表性的固相免疫放射分析法： 固相Ab1(试管壁上)+Ag (固相)Ab1.Ag (过量) + 过量Ab*2(McAb) 固相Ab1.Ag.Ab*2 +剩余Ab*(洗去) sandwichA
13、b1Ag,双位点法(Ab1为McAb),固相Ab1-McAb(试管壁上)+Ag (固相)Ab.Ag (过量) + (过量Ab*2) 固相Ab1.Ag.Ab*2 + 剩余Ab* 最后抗原被夹在两种抗体分子之间，测固相上的放射性(结合部分)。此法过量标记抗体易去除,NSB较低，灵敏度高；抗原结合部分需要有两个特定的抗原决定簇，故特性较高。,标记第三抗体法,与双位点法相似，只是两种抗体均不标记，而是反应结束后，加入非特异的125I-第三抗体(兔抗鼠IgG)，与抗原抗体复合物结合，达到测量结合部分的目的。 Abb3*,RIA与IRMA的异同,均为以抗原抗体的免疫反应为基础，测定对象为物质的抗原； RI
14、A 为竞争性，标记物为抗原 结合部分放射性与待测抗原浓度呈负 相关,在直角坐标系呈曲线 为了产生竞争,抗体仅使用结合50%抗 原的量,故灵敏度较免放法低,IRMA,为非竞争性，标记的是抗体，且为过量（高滴度） 结合部分放射性与待测抗原浓度呈正相关，因抗体为过量，不存在竞争结合，故结合在固相物上的放射性计数与抗原浓度呈正比，在直角坐标系近似直线；但当待测抗原浓度超过一定范围时，则正比关系消失，出现“ 平台效应。,因抗体为过量，抗原全量参与反应，反应更为迅速，灵敏度高 标准曲线工作范围大 由于使用单抗，其特异性好 免疫放射分析仅适用于多肽和蛋白质大分子物质的测定，要求抗原不少于两个以上的抗原决定簇
15、（通常一个抗原决定簇至少由5-6个氨基酸组成，故理论上少于10个以下氨基酸的小分子物质无法建立免放分析法）,因使用固相法，操作更简便，易于分离（固相材料有多种） 标记抗体比标记抗原容易,可获得高比度的抗体。,受体放射分析,Receptor radioligand binding assayRadioassay of receptor,Characteristic of receptor,受体是细胞膜上或细胞内的一些能首先与生物活性物质相互作用的分子 细胞上存在三种受体，即膜受体、浆受体和核受体。,受体是细胞的生物活性部分，因此测定结果反映的是生物活性； 受体的种属特异性不强，为制备受体提供了方
16、便； 受体通常有两个以上结合位点(高亲和力低容量和低亲和力高容量)，故对标记配体的质量要求较高； 受体制备较复杂，保存期较短，批间变异大，常规使用困难。,Saturability of receptor,受体具有可饱和性，一定量的组织内受体的含量极少，与配体结合是有限度的。 逐步加大配体浓度可使其饱和。,Moderate affinity,配体占据受体的浓度范围，相当于体内内源性配体的生理浓度，通常是10-9M左右。 以低浓度存在的配体，应该有高亲和力的受体；以高浓度存在的配体，需要有低亲和力的受体。一般配体与受体结合达到平衡状态时，亲和力很高，而离解常数很小。,Specific of rec
17、eptor binding,受体与专一配体作用不受其它信号干扰。 配体分为激动剂和拮抗剂，激动剂与受体结合后引起生物学效应，天然存在于体内的大多为激动剂。 某些药物或毒物可以是激动剂，也可是拮抗剂。拮抗剂与受体结合后，不产生生物学效应，但它可阻止激动剂发挥作用。,Reversibility,受体与配体的结合反应是可逆的。 受体周围配体浓度高时形成的复合物多，周围配体浓度低时，复合物又离解为游离配体和受体。已结合的配体还可被另一种与受体有高亲和力的配体所取代。,Consistency with physiologic effect,受体与配体结合的强度与产生生物效应的强度是相关的。,Existe
18、nce of endogenesis ligand,多数人认为，所有受体应有相应的内源性配体存在。 阿片受体脑啡肽、内啡肽多巴胺受体多巴胺 胰岛素受体-胰岛素,Specific with tissue 组织的专一性,只有特殊类型的细胞可对一种特定信号起反应。,Protein character of receptor,受体的蛋白质性质将受体组织作变性处理,可破坏其结合。 受体也可作为抗原使用而产生抗受体的抗体(如TSH受体抗体)。,Receptor radioassay 受体放射分析,是以分析受体的数量和性质为目的 一定量受体只能与一定量的标记配体（受体激动剂和阻断剂）结合，受体具有一定的饱和
19、度 根据复合物的最大放射性及所用标记配体的比活度推算出受体的数量，并利用scatchard作图法求出受体的亲和力常数，以反映受体的性质等。 L* + R=L*.R + L* Receptor radioligand binding assay,Preparation of receptor 受体的制备,取出所需组织，置4预冷的玻璃培养皿中，除去残存血液及非靶组织； 称重后加适量缓冲液用高速分散器打碎，再用超声波粉碎器将组织制成匀浆； 46000rpm离心20min，去除组织细胞残渣，上清再用15000rpm离心30min，去上清，沉淀再15000rpm离心30min，去除含内源性配体的上清，沉
20、淀加入适量缓冲液备用。,受体放射分析时对标记配体要求,与相应的受体有高的亲和力，在一定浓度能达到最大结合率，专一性好； 标记配体比活度高(10Ci/mMol)，纯度高，常用的多为3H标记受体拮抗剂，但标记配体需专门的实验室合成；某些具有酪氨酸残基的配体可用125I标记。 放射性配体应密封、避光、低温贮存。,Preparation of biological sample 生物样品的制备,应根据不同样品或不同分析方法制备生物样品和贮存样品，避免活性损失。 避免反复冻融、溶血、室温保存过长 部分样品测定前需提取、稀释等处理。,非放射性标记免疫分析技术Enzyme immunoassay,EIA C
21、hemiluminescence immunoassay,CLIA Time-resolved fluoroimmunoassay,TrFIA美国拜耳公司化学发光仪,化学发光免疫分析碱性磷酸酶 发光发光底物 Dioxetane光电倍增管 测量光强度ALP标记Ag 或Ab，形成 Ag.Ab反应去除游 离部分温育分为竞争法与夹心法两类,非放射性免疫与体外放射分析的比较试剂稳定，有效使用期长，可达612月 灵敏感度高，可达10-1418g 标准曲线稳定，可达24周，节省试剂 自动化程度高，减少加样误差 出结果迅速，适合急诊检测 缺点：仪器及试剂成本较放免高，试剂与仪器不能兼容差，不利于市场竞争。,甲
22、状腺激素及有关激素：TT3、TT4、FT3、FT4、rT3、促甲状腺激素(TSH)、促甲状腺激素释放激素(TRH) 甲状腺自身抗体与抗原：TgAb,TmAb,TsAb与Tg抗原 甲状旁腺激素、降钙素、骨钙素等 胰岛素、胰高血糖素、C肽 肾上腺及有关激素：皮质醇、醛固酮、ACTH等内分泌系统,垂体激素：LH、FSH、PRL 性腺激素：E2、E3、睾酮、孕酮 生殖激素：胎盘催乳素、绒毛膜促性腺激素等 性腺及生殖系统,心血管系统 心钠素、肌红蛋白、地高辛、肾素、血管紧张素、内皮素 神经系统 内啡肽、生长激素、神经元特异烯醇酶(NSE) 血液系统 红细胞生成素、铁蛋白、血栓素、前列腺素,消化系统 CEA、AFP、乙型肝炎抗原及抗体、肝胆酸、胃泌素、胃动素等 泌尿系统 2-MG、尿白蛋白、TH糖蛋白、分泌型免疫球蛋白A(SIgA),肿瘤疾病及其它 CEA、CA-50、CA-199、CA-125、CA-153、前列腺特异性抗原(PSA)、前列腺酸性磷酸酶(PAP)、铁蛋白、肿瘤坏死因子、SOD等。,
