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1、微生物学实验一,细菌的培养方法,（综合性实验）,1. 实验室规则2录相：细菌标本的采集和细菌的接种方法3操作： 细菌的接种法 （液体、半固体、固体 1套/3人） 空气中细菌的检查 （沉降法 血平板 1块/6人） 呼吸道细菌的检查 （咳碟培养 血平板 1块/3人） 随身物品的细菌检查 （普通平板 1块/3人）4. 材料： 大肠杆菌斜面培养物 （1支/6人） 碘酒、75%酒精、棉签等 （1套/6人）,实验内容,教学目标,了解： 培养基的类型与制备方法；细菌菌落的观察 常用的细菌接种方法和各种细菌的培养方法掌握： 1. 细菌的液体、半固体、固体接种 2. 空气中细菌的检查方法沉降法 3. 呼吸道细菌
2、的检查法咳碟法 4. 随身物品的细菌检查方法,实验室规则,1. 穿白大褂，尽量少带物件进实验室。2. 严格按老师及教材要求进行实验，以获得正确结果。3. 书、笔记本、笔等文具放入实验台抽屉里。4. 严禁在实验室喝水，吃东西，用嘴咬笔或标签，不要用手抚摸头、脸等部位，以免发生感染。,微生物学实验的对象多为病原微生物，如有不慎就会发生实验室感染。,5. 实验室不得高声喧哗，保持安静，守秩序，不要随便走动，以免影响他人实验和安全。6. 如果发生实验室不慎，吸入菌液、划破手指、培养物破损传染物外溢，应及时报告，及时处理。7. 实验过程中应注意节约实验材料、爱护仪器，损坏器材要及时报告、登记、并作相应的
3、赔偿。实验室内物品，未经老师许可，严禁带出室外。,8. 每次实验之后，所用物品放回原处。需要培养或消毒处理的物品及时送到指定地点，用过的涂菌载玻片放入小桶内，不得乱丢乱放。9. 实验完毕，整理桌面，肥皂洗手，值日生打扫实验室卫生，关好水电门窗，待老师检查后方可离开。,细菌和其它生物一样，大多数属异养菌，必须从周围环境中摄取营养，进行新陈代谢及生长繁殖等生命活动。 人为地提供细菌生长繁殖所需的营养物质（适宜的培养基）和创造适合细菌生长繁殖的有利条件如温度、湿度、气体等，能使细菌在体外迅速生长繁殖。,细菌的人工培养,细菌生长繁殖的条件：,1充足的营养物质,2适宜的温度,3合适的酸碱度（pH）,4必
4、要的气体环境,一、细菌生长繁殖所需营养,1水 营养的吸收与代谢均需有水才能进行。,2碳源 病原菌主要从糖类获得碳及能量。,4无机盐 常用元素如磷、硫、钾、钠、镁、钙、铁等,3氮源 其主要功能是作为菌体成分的原料。,5生长因子 某些细菌生长所必需而又不能自身合成的有机化合物。,（一）培养基（culture medium）,由人工方法配制而成的，专供微生物生长繁殖使用的混合营养物制品。,培养基的制备,（1）按用途划分,1）基础培养基,含多数细菌生长所需要的最基本营养，能满足一般细菌生长繁殖的营养需要，如肉汤（含有水、牛肉膏、蛋白胨、氯化钠等原料）。,2）营养培养基,在基础培养基中加入葡萄糖、血液、
5、酵母浸膏等。,1、培养基的类型及应用,3）鉴别培养基,4）选择培养基,在培养基中加入一定底物和指示剂，而不同种类的细菌由于分解代谢及合成代谢能力的不同，会产生不同的特征性培养结果，从而将不同细菌区分开来的培养基。,在培养基中加入某些特殊的营养物质或化学物质，使之能抑制一些细菌生长，而有利于另一些细菌生长，从而将后者从混杂的细菌群体中分离出来的培养基。,SS琼脂培养基（Salmonella-Shigella agar）,大肠埃希菌,沙门菌,志贺菌,5）厌氧培养基,用于培养厌氧性细菌的培养基，此时需要在培养基中加入还原剂降低培养基的氧化还原电势，厌氧菌才能生长发育。,疱肉培养基 不饱和脂肪酸和谷胱
6、甘肽,（2）根据物理状态分,液体培养基：增菌固体培养基（琼脂浓度为1.5）：分离培养半固体培养基（琼脂浓度为0.5%）：动力检查,液体培养基 固体培养基 半固体培养基,嗜冷菌（10-20）嗜温菌（20-40）：绝大多数病原菌嗜热菌（50-60）,二、适宜的温度,嗜中性菌（pH 6.0-8.0）嗜酸性菌（pH 8.5） 多数病原菌最适酸碱度为pH 7.2-7.6霍乱弧菌耐碱(pH 8.4-9.2)结核分枝杆菌耐酸(pH 6.5-6.8),三、适宜的酸碱度（pH）,氧和二氧化碳,1、按细菌对氧的需求可分为四种类型：,专性需氧菌（obligate aerobe）,兼性厌氧菌（facultative
7、anaerobe）,微需氧菌（microaerophilic bacterium）,专性厌氧菌（obligate anaerobe）,四、适宜的气体环境,2、细菌的二氧化碳培养法,烛缸法二氧化碳孵箱,某些细菌（脑膜炎双球菌、淋球双球菌、布氏杆菌等少数细菌）的生长，需在孵育时加入5-10% CO2,示教,1. 细菌的接种法：液体、半固体、固体培养基2. 空气中细菌的检查（沉降法，血平板）3. 呼吸道细菌的检查（咳碟培养，血平板）4. 随身物品细菌检查（普通平板）,操作内容,细菌的分离接种是人工分离培养细菌的重要步骤，是微生物学的基本技术之一，其目的是从含多种细菌的患者标本中分离出单一病原菌，从而
8、可以进行感染性疾病的病原学诊断。 同时，在细菌学的研究，生物制品如疫苗、类毒素、抗毒素和免疫血清等的制备，基因工程及工农业生产等方面，人工培养分离细菌，都有着极为重要的意义。,操作一 细菌的接种法,琼脂平板划线分离接种法（固体培养基） 划线法 斜面培养基接种法（蛇形划线法）半固体培养基接种法（穿刺法）液体培养基接种法（乳磨法）,接种时要注意无菌操作，避免污染，也要防止细菌外溢污染环境。,细菌的分离接种方法,固体平板培养基的划线接种,三线法,划线接种手法,平板划线接种的结果菌落观察,1固体平板培养结果观察 单个微生物在适宜的固体培养基表面生长、繁殖到一定程度，可以形成肉眼可见的有一定形态结构的细
9、菌集团，称为菌落（colony）。 菌落特征是鉴别细菌的重要依据之一。,肺炎克雷伯菌,奇异变形杆菌,菌落形态,链球菌,斜面培养基接种蛇形划线,半固体培养基的穿刺接种及结果观察,液体培养基的乳磨接种手法,液体培养结果观察,表面生长,沉淀生长,混浊生长,空气中没有营养物质，且受日光中紫外线的作用，细菌一般不能繁殖。然而，土壤中有大量的细菌存在，可随尘埃散布到空气中；寄生在人和动物呼吸道及消化道中的细菌也能通过各种途径散布到空气中，使得空气中也有一定量的细菌存在。 空气中细菌的数量和种类随地区、季节和人口密度的不同而不同。通常，可测定单位体积空气中所含细菌的数量来评价空气的污染程度。,操作二 空气中
10、细菌的检查,沉降法是利用含有细菌的尘粒或气溶胶粒因重力作用自然下降到培养基表面，通过细菌培养，计数菌落数，粗略评估空气中细菌含量。,沉降法简单易行，缺点是不够准确。但它客观地反映了空气污染的程度和卫生通风状况，对手术室、食品业等有重要的参考意义，是判断空气污染的指标之一。,操作：将血平板打开盖，放到教室的四个角上，静止15分钟后，合上盖送37孵箱培养。,据推算，每100cm培养基在空气中暴露5min，其表面接受自然沉降的细菌数约相当于10升空气中所含的细菌量。那么，暴露于空气中15min应相当于30升，所以，每m空气中活菌数=（100 cm培养基上菌落平均数/30）x1000,注意：计数菌落时
11、，两个或几个菌落边缘有重叠者，均分别计算为两个或几个。,人体呼吸道与外界相通，常常有不同种类的细菌存在。其中，1/4为需氧菌，3/4为厌氧菌。这些细菌常是条件致病菌，在一般情况下并不致病。有时，正常人的呼吸道中也有致病菌的存在，如肺炎球菌、脑膜炎球菌、乙型链球菌、流感杆菌等，是引起疾病传播的一个重要因素。 由于寄居人体的关系，这些细菌对营养的要求较高，常需要用含血液成分的培养基进行分离。,操作三 呼吸道细菌的检查咳碟试验,操作方法： 打开血平板，将平板置于口腔前约15cm处，对准培养基表面用力咳嗽34次，然后盖好平板盖，放置于37孵箱内培养24小时后观察结果。结果判断： 平板上可有不同的菌落长
12、出，观察菌落的形态、大小及溶血现象。,人体的皮肤表面有多种细菌存在，用水洗手或用肥皂洗手，可以除去皮肤上的污垢和灰尘，从而减少手上细菌数量，但并不能有效的杀死细菌。日常医疗、试验工作中常用的化学消毒剂如碘酒、酒精等有很好的杀菌作用，在临床医疗中广泛应用。,操作四 正常人体皮肤及随身物品的细菌检查,1、在平板底部用笔划分8个区，分别标记为。2、用右手食指在区上轻轻按一下，然后用肥皂洗手后，用无菌棉签拭干手指皮肤，再轻轻在区培养基上按一下。3、用左手食指轻轻在区按一下，然后用棉签蘸碘酒、酒精消毒左手食指皮肤，待干后轻轻在区按一下。4、任取随身物品在区各按一下。5、盖好平板，送37孵箱培育24小时后观察结果。,操作方法,1.细菌接种的方法有哪些？各有什么用途？2.厌氧菌为什么在有氧环境中不能生长？,思考题,谢谢！,
